Los glucósidos de feniletanol de Cistanche Tubulosa suprimen la activación de las células estrelladas hepáticas y bloquean la conducción de las vías de señalización en TGF-01/smad como agentes potenciales contra la fibrosis hepática
Mar 05, 2022
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Shu-Ping You, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang y Tao Liu
Resumen: Cistanche tubulosaes una medicina herbal china tradicional ampliamente utilizada para regular la inmunidad yglucósidos de feniletanoide(CPhG) se encuentran entre los principales componentes responsables de esta actividad. Estudios previos han indicado los efectos preventivos y terapéuticos de las CPhG en la fibrosis hepática inducida por albúmina sérica bovina (BSA) en ratas. El objetivo del estudio fue evaluar el efecto anti-fibrosis hepática de las CPhG y los monómerosechinacósidoyacteósidoinhibiendo la activación de las células estrelladas hepáticas (HSC), bloqueando la conducción de las vías de señalización en el factor de crecimiento transformante-p1 (TGF-p1)/smad, y determinando su actividad hepatoprotectora in vitro. La proliferación de HSC fue obviamente inhibida después del tratamiento con CPhGs (100,50 ^g/mL)/echinacósido (500,250,125 ^g/mL)/actósido (6,3 ^g/mL), con valores IC50 de 119,125,520,345 y 6,999 g/ mL, respectivamente, en el ensayo MTT. Diferentes concentraciones de CPhGs/echinacósido/acteósidono afectó la toxicidad celular en HSC según las mediciones de lactato deshidrogenasa (LDH). Diferentes concentraciones de CPhGs/echinacósido/acteósidoaumentó el nivel de ARNm y la expresión de proteínas de smad7 y disminuyó los niveles de ARNm de smad2, smad3 y la expresión de proteínas de smad2, fosfo-smad2 (p-smad2), smad3, fosfo-smad3 (p-smad3) en HSC. En resumen, estos resultados demuestran que CPhGs/echinacósido/acteósidopuede bloquear la conducción de las vías de señalización en TGF-p1/smad e inhibir la activación de HSC, lo que sugiere queC. tubulosapor lo tanto, puede ser una medicina herbaria potencial para el tratamiento de la fibrosis hepática.
Palabras clave: Cistanche tubulosa; glucósidos de feniletanol deCistanche(CPHG);echinacósido; acteósido; células estrelladas hepáticas (HSC); TGF-p1/smad
1. Introducción
se vuelven proliferativas y fibrogénicas, posteriormente acumulan ECM y finalmente se diferencian en células fibrogénicas similares a miofibroblastos. Se considera que el factor de crecimiento transformante-.1 (TGF-p 1) es el principal mediador profibrogénico. La vía de señalización relacionada con TGF-&1 es un mecanismo importante de la fibrosis hepática e incluye principalmente señalización dependiente de smad e independiente de smad, y se cree que la vía de transducción de señalización dependiente de smad es un canal importante de señalización de TGF-p1 . Por lo tanto, el bloqueo de la vía de señalización TGF-p1/smad puede suprimir la producción de colágeno y, finalmente, aliviar la fibrosis hepática, lo que ha convertido a esta vía en un objetivo importante en la investigación de fármacos contra la fibrosis hepática en los últimos años.
A pesar de la alta incidencia mundial de fibrosis hepática, no existe una terapia antifibrogénica generalmente aceptada [2—4]. Las medicinas herbales chinas tradicionales (TCHM) son de gran interés para el tratamiento de los trastornos hepáticos porque algunas pueden utilizarse como fármacos terapéuticos en el tratamiento y la prevención de la fibrosis hepática. En la actualidad, muchos estudios se centran en posibles fármacos antifibrogénicos que se han utilizado como TCHM durante miles de años [5].
Cistanche tubulosa W (familia Orobanchaceae) una planta parásita, se cultiva ampliamente en la región sur de Xinjiang en China [6]. La gente lo usa para vigorizar los riñones, nutrir la sangre, relajar los intestinos y retrasar la senescencia sin efectos secundarios, y figura oficialmente en la Farmacopea China [7]. C. tubulosa contiene una variedad de componentes activos, incluidos los glucósidos feniletanoides (CPhG), iridoides y polisacáridos. Entre los múltiples componentes activos de C. tubulous, los CPhGs, que presentan una serie de bioactividades (antioxidante, antifatiga, radiorresistencia, etc.) son los principales componentes característicos de Pie de esta planta. En los últimos años, se informó que los CPhGi tienen un exceso de efectos hepatoprotectores de Hent y pueden eliminar los radicales de los árboles, proteger las membranas hepáticas y exhibir efectos inmunorreguladores, inhibición de la apoptosis, inhibición de la expresión del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBs Ag) y hepatitis B. El antígeno (HBeAg) y la actividad de replicación del ADN del virus de la hepatitis B (VHB), etc. El nivel de ADN del VHB es el índice más confiable que refleja directamente la actividad de replicación viral, que es el factor clave para determinar la historia natural de las infecciones crónicas por VHB. monitorear el efecto de la terapia antiviral oP y evaluar el pronóstico de infecciones agudas y crónicas por VHB. Los índices serológicos de detección del VHB incluyen principalmente HBsAg, HBeAg, etc. [8—11]. Sin embargo, existen pocos informes en la literatura sobre los efectos antifibrosis hepática de las CPhG. Estudios previos han indicado los efectos preventivos y terapéuticos de las CPhG en la fibrosis hepática inducida por albúmina sérica bovina (BSA) en ratas, pero la actividad antifibrogénica de las CPhG y sus principales monómeros (equinacósido y acteósido, Figura 1) nunca se han evaluado in vitro.
Cistanche tubulosa orgánica
2. Resultados
2.1. Determinación cuantitativa de CPhG
CPhG enC. tubulosacontienen dos glucósidos de alcohol feniletílico: equinacósido y acteósido, y su contenido en los CPhG se detectó mediante análisis HPLC (Figura 1) en 42,71 por ciento 土 0, 42 por ciento y 14,27 por ciento 土 0.18 por ciento, respectivamente.
2.2. Actividades inhibidoras de CPhG, equinacósido y acteoside en HSC-T6
CPhGs, echinacoside y acteoside (62.5-500 卩g/mL) inhibieron la viabilidad celular de HSC de una manera dependiente de la concentración. Los CPhG y el acteósido mostraron una notable actividad inhibitoria sobre las células HSC, con una inhibición del 50 por ciento de los valores de actividad de crecimiento celular (IC50) de 119,125 µg/ml y 6,999 µg/ml, respectivamente. El equinacósido mostró una actividad inhibitoria moderada (IC50,520.345 昭/mL; Tabla 1 y Figura 2).
2.3. Toxicidad celular de CPhG, Echin acoside y Acteorida en HSC
La lactato deshidrogenasa (LDH), una enzima citoplasmática estable presente en todas las células, se libera rápidamente en el sobrenadante del cultivo celular cuando se daña la membrana plasmática. La actividad enzimática en el sobrenadante del cultivo se correlaciona con la proporción de células lisadas [12]. Como se muestra en la Tabla 2, cuando se trató con diferentes: concentraciones de C PhGs, equinacósido y acteósido, aunque la actividad de LDH mostró un ligero aumento en comparación con el grupo de control celular, la diferencia no fue estadísticamente significativa (p > 0.05 ), lo que indica que la mayoría de las membranas celulares mantuvieron su integridad, y la inhibición de CPhG, equinacósido y acteósido en HSC no se debe a una toxicidad celular inespecífica.
2.4. Efecto de CPhGs, Echinacoside y Acteosde en la proliferación de HSC inducida por TGF-^i
La proliferación, activación y diferenciación de HSC están reguladas por una variedad de factores. Entre los diversos factores implicados en la fibrosis hepática, el TGF{{0}} se considera el más importante, ya que puede activar las HSC, promover la diferenciación de miofibroblastos, aumentar la síntesis de ECM, inhibir la degradación de ECM y liberar quimiocinas y citocinas implicadas en la fibrosis hepática [13]. En este estudio, a excepción del grupo de control, las HSC estacionarias se estimularon con TGF-P1 in vitro para simular la formación de fibrosis hepática temprana y para investigar el efecto de las CPhG, el equinacósido y el acteósido sobre el TGF-p1- proliferación de HSC inducida. Como se muestra en la Tabla 3, en comparación con el grupo de control, el grupo TGF-61 promovió significativamente la proliferación de HSC (p < 0.01).="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" tgf-p1,="" tgf-p1="" más="" cphg="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf{{18}="" }="" más="" echinacósido="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" µg/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf-p1="" más="" acteósido="" (ta)="" (3,0,="" 6,0="" µg/ml,="" p="">< 0,05)="" inhibieron="" notablemente="" la="" proliferación="" de="" hsc="" inducidas="" por="" tgf-|3="" 1="" en="" diferentes="">
2.5. Expresiones de ARNm de smad2) smad3 y smad7 después de la intervención de CPhG, ochmacoside y acteaside en HSC
Smad3 y smad2 son efectores clave aguas abajo de la vía de señalización de TTGF-p [14,15], y smad7 es un inhibidor de la señalización de smad. En teoría, el aumento de la expresión de smad7 o la disminución de la expresión de smad2/smad3 pueden bloquear la conducción de las vías de señalización en TGF-p 1/smad. Como se muestra en la Figura 3, el análisis de PCR cuantitafiva en tiempo real mostró que la expresión de ARNm de smad2 y smad3 indicó un nivel más bajo, mientras que smad7 indicó niveles más altos en el grupo de control, en comparación con el grupo TGF-|31. En el grupo TC (25, 50, 75,100 |dg/ml), el nivel de ARNm de smad2 (p < 0).{{37="" }}5)="" y="" smad3="" (p="">< 0,01)="" disminuyeron="" significativamente="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" tgf-pf,="" e="" incluso="" fue="" similar="" al="" grupo="" de="" control;="" mientras="" tanto,="" el="" nivel="" de="" arnm="" de="" smad7="" aumentó="" significativamente="" en="" el="" grupo="" tc="" (50,="" 75,100="" 卩g/ml)="" (p="">< 0.05,="" p="">< 0.05,="" p="">< 0.01,="" respectivamente).="" sin="" embargo;="" la="" expresión="" de="" smad7="" indicó="" una="" tendencia="" ascendente="" en="" el="" grupo="" tc="" 25="" μg/ml="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" tgf-p1="" (figura="">
Mientras tanto, en comparación con el grupo TGF-p1, la expresión de ARNm de smad2 y smad3 disminuyó significativamente en el TE (62,5, 125, 250, 500 卩g /mL) (p < 0.01),="" y="" las="" expresiones="" de="" arnm="" de="" smad7="" aumentaron="" significativamente="" en="" el="" grupo="" te="" (125,="" 250,500="" 昭/ml)="" (p="">< 0.01)="" (figura="" 4)="" .="" de="" manera="" similar,="" el="" grupo="" ta="" (0.75,="" 1.5,="" 3.0,="" 6.0="" ^g/ml)="" también="" mostró="" la="" misma="" tendencia="" (figura="">
2.6. Influencia de CPhGs, Echinacoside y Ac)eosids en T GF-^i/smad Signaling Pathway en HSC
La vía de señalización de TGF-p 1/smad depende de smad2, smad3, fosfo-smad2 (p-smad2), fosfo-smad3 (p-smad3) y smad7, donde p-smad2, p-smad3 son las formas activadas de smad2 y smad3. En este estudio, se analizaron los niveles de proteína de omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 y smad7. El análisis de transferencia Western detectó aumentos en los niveles de smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 por TGF-p1, y la inhibición de estos aumentos por CPhG, ec hinacoside y acteoside; mientras tanto, el análisis de transferencia de Wesiern reveló niveles de smad7 regulados al alza por CPhG, echinacoside y acteoside. (Figuras 6—8).
Como se muestra en la Figura 6, en comparación con el grupo c on2rol (las expresiones de proteínas de smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 aumentaron significativamente, y la expresión de proteínas smad7 disminuyó en el grupo TGF-p1. En el TC (25 , 50, 75, 100 昭/mL) grupos de fármacos, el smad/ (Figura 6A), p-smad2 (Figura 6B), smad 3 (Figura 6C), p -smad3 (Figura 6D) las expresiones fueron significativamente menores que las del grupo TGF-p1 (卩 < 0,01) y la expresión de la proteína smad7 (Figura 6E) fue mayor que la del grupo TGF-S1 (p < 0,01) (Figura 6).
Al mismo tiempo, las expresiones de las proteínas ot smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 y smad7 se midieron después de la intervención de equinacósido y acteosido en HSC. Como se muestra en las Figuras 7 y 8, los niveles de expresión de las proteínas smad2, smad3, p-smad2 y p-smad3 se inhibieron significativamente (p < 0.05="" o="" p="">< 0.01="" ),="" el="" nivel="" de="" expresión="" de="" la="" proteína="" smad7="" fue="" elevado="" (p="">< 0,01),="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" tgf-p="" 1="" (figuras="" 7="" y="">
3. Discusión
La fibrosis hepática es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, pero las opciones terapéuticas disponibles actualmente para esta afección son muy limitadas, por lo tanto, es muy importante para nosotros buscar objetivos potenciales para la intervención terapéutica para prevenir el desarrollo de )fibrosis hepática [ dieciséis]. Recientemente, los investigadores han descubierto que varios medicamentos a base de hierbas tienen efectos hepatoprotectores o antifibróticos. Muchos TCHM como las píldoras Fufang Biejia Ruangan [17] y la decocción Xiao-chai-hu (shosaiko to en Japón) [18,19] se han utilizado ampliamente para tratar la fibrosis hepática en China, Corea y Japón durante miles de años. C. tubulosa contiene una variedad de componentes activos que incluyen CPhG, iridoides y polisacáridos. Como una de las bases materiales eficaces de C. tubulosa, las CPhG poseen una excelente actividad hepatoprotectora, pero existe información limitada sobre los efectos antifibróticos de las GPhC y sus compuestos relacionados. En este estudio, investigamos cómo las CPhG, el equinacósido y el acteósido suprimen la activación de las HSC y bloquean la conducción de la ruta de señalización en TGF-p1/snaad como posibles agentes contra la fibrosis hepática in vitro.
La lesión hepática de cualquier etiología conducirá en última instancia a la activación de las HSC, que experimentan una transdiferenciación a células fibrogénicas similares a miofibroblastos [20]. Es decir que los miofibroblastos
se derivan de la activación y proliferación de HSCss [21], y se considera que es el mediador de la formación de fibrosis hepática. Por esta razón, realizamos estudios in vitro para comparar las tasas de viabilidad celular de las HSC expuestas a CPhG, equinacósido y acteósido. Los resultados mostraron que el efecto inhibitorio del acteósido sobre las HSC fue el más fuerte, y el efecto de las CPhG fue mejor que el del equinacósido. Los sueros medicados con CPhG, equinacósido y acteósido inhibieron la proliferación de HSC de una manera dependiente de la dosis.
La LDH es una enzima citoplasmática en las células vivas y no puede penetrar la membrana celular en circunstancias normales. Cuando las células se dañan, la permeabilidad de la membrana aumenta y la LDH se libera al exterior de la célula. Por lo general, LDH puede detectar el grado de daño celular [{{0}}]. La investigación mostró que la actividad LDH del suero medicado con CPhG, equinacósido y acteósido solo mostró un ligero aumento en comparación con el grupo de control celular, y la diferencia no fue estadísticamente significativa (p> 0,05), lo que indica que la mayor parte de la membrana celular mantuvo su integridad. , y la inhibición de HSC por CPhG, equinacósido y acteósido no se debe a una toxicidad celular inespecífica.
Cuando ocurre una lesión hepática, los hepatocitos activados pueden liberar TGF-pi que a su vez activa HSC-T6, por lo tanto, TGF-pi tiene una estrecha relación con la fibrosis [25-27]. En este estudio, las CPhG, el equinacósido y el acteósido podrían considerarse una estrategia terapéutica atractiva para la inhibición de la proliferación de HSC después de que las HSC se estimularan con wTGF-pi in vitro. Especulamos que los CPhG, el equinacósido y el acteósido pueden usarse como un tipo de tratamiento y/o prevención de la fibrosis hepática e inhibir la formación de fibrosis hepática temprana. La formación de fibrosis hepática es un proceso complejo de participación multifactorial y multicelular. En este proceso patológico, las interacciones célula-célula, célula-citoquinas y célula-matriz constituyen una red engorrosa. En esta red, el desarrollo de fibrosis hepática puede ser regulado por diferentes vías y medios de señalización. TGF-pi es un activador clásico de HSC y un mediador clave en la patogénesis de la fibrosis hepática [28]. Los CPhG, el equinacósido y el acteósido pueden inhibir las expresiones de ARNm y proteínas relacionados con la vía TGF-pi/smad en las HSC.
TGF-pi ejerce sus efectos celulares a través de la vía de señalización smad, y se ha considerado un mediador clave en el desarrollo de fibrosis e inflamación hepática. Tras la unión de TGF-pi al receptor de TGF-p-tipo II, la quinasa del receptor de tipo II fosforila el dominio GS del receptor de TGF-p tipo I, lo que conduce a la activación del receptor de tipo I [29]. A través de la acción de p-smad2 y p-smad3 en dos residuos de serina en el motivo SSXS de su terminal C, las reacciones aguas abajo de la vía de señalización de smad se activan mediante la activación del receptor de tipo I [30]. P-smad2 y p-smad3 forman complejos oligoméricos con smad4, luego ingresan al núcleo y ejercen su actividad de transcripción biológica. Por lo tanto, las proteínas smad transmiten señales directamente desde el receptor quinasa al núcleo [3i]. Por otro lado, smad7 se combina firmemente con el receptor TGF-pi, lo que lleva a la incapacidad de smad 2/3 para activarse, así como a la inhibición de las vías de transducción de señales [32]. Smad7 puede actuar para inhibir p-smad2 y p-smad3, la translocación nuclear de complejos smad activados y la activación de (CAGA) (9)-MLP-Luc, lo que resulta en una disminución de la expresión de colágeno I y una inhibición completa de la transducción de señales de TGF-p [33,34]. Nuestros resultados mostraron que los CPhG, el equinacósido y el acteósido pueden disminuir las expresiones de ARNm de smad2 y smad3 y aumentar la expresión de ARNm de smad7; inhiben las expresiones de las proteínas smad2, p-smad2, smad3 y p-smad3, y regulan al alza la expresión de la proteína smad7, lo que sugiere que las CPhG, el equinacósido y el acteósido también desempeñan un papel en la inhibición de la activación de las HSC y, por lo tanto, inhiben la fibrosis hepática, lo que destaca un potencial antifibrótico mecanismo.
Se demostró que la secuencia de los efectos hepatoprotectores de los tres agentes de prueba era acteósido > CPhGs > equinacósido. Con el fin de dilucidar aún más las razones de las diferencias en el mecanismo por el cual CPhG, equinacósido y acteósido protegen contra la fibrosis hepática, se analizaron sus estructuras químicas. El resto de glucósido de alcohol fenetílico parece ser una estructura esencial para el efecto hepatoprotector [35]. El acteósido (C29H36Oi5) es un glucósido doble y el equinacósido (C35H46O20) es un triglucósido, es decir, el equinacósido tiene un glucósido extra en su estructura en comparación con el acteósido, lo que conduce a un aumento de su tamaño espacial. La actividad hepatoprotectora o inhibidora de HSC del acteósido es mejor que la del equinacósido, lo que puede deberse a la existencia de un impedimento estérico.
proteger el hígado: extracto de cistanche
4. Sección Experimental
4.1. Sustancias químicas y reactivos
TGF-pi se adquirió de Peprotech (Rocky Hill, NJ, EE. UU.). La línea celular HSC-T6 se adquirió de Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd. (Wuhan, China). El dimetilsulfóxido (DMSO) se adquirió de Sigma Inc. (St. Louis, MO, EE. UU.). Los cebadores Smad2, smad3 y smad7 fueron producidos por Shanghai Sangon Biological and Technological Company (Shanghai, China). El kit de síntesis de cDNA de primera cadena Revert Aid se adquirió de Thermo Scientific (Shanghai, China). El kit de PCR verde Quantifast SYBR se adquirió de QIAGEN GmbH (Hilden, Alemania). El anticuerpo p-smad2 (ser465/467), el mAb de conejo Smad3 (C67H9) y el mAb de conejo p-smad3 (ser423/425) se adquirieron de Cell Signaling Technology (Boston, MA, EE. UU.). El anticuerpo Smad7 se adquirió de Boster (Wuhan, China). El anticuerpo policlonal Smad2 y el anticuerpo monoclonal p-actina se adquirieron de Proteintech (Wuhan, China). La detección del anticuerpo primario se realizó utilizando una solución de anticuerpo de 2 grados (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) y una solución de anticuerpo de 2 grados (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) adquiridas de Invitrogen™ (Carlsbad, CA, EE. UU.). El kit de ensayo de lactato deshidrogenasa era del Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China).
4.2. Material vegetal
C. tubulosa se recolectó de Tulufan, en la región autónoma de Xinjiang Uirghur de China, en mayo de 2006. Los materiales vegetales fueron identificados como C. tubulosa por Jiang He, Instituto de Materia Médica de Xinjiang. Se depositó un espécimen de comprobante en el Instituto de Materia Médica de Xinjiang en China.
4.3. Aislamiento y purificación de CPhG y sus compuestos
Los rizomas secos y rebanados de C. tubulosa (6,0 kg) se extrajeron consecutivamente tres veces a reflujo con etanol al 70 por ciento (4,8 L), y luego se eliminó el solvente de los extractos combinados para para producir el extracto de etanol (1,146 kg). Los extractos de etanol se purificaron con resina AB-8 para obtener el extracto crudo de glicósidos de feniletanol (CPhG s). Después de disolver en agua, el extracto se purificó mediante cromatografía de resina macroporosa de adsorción AB-8 para obtener los glucósidos de feniletanol totales de C. tubulosa (CPhGs, 210 g). Se aplicaron CPhG en una columna ODS OP{{10}} y se eluyeron sucesivamente con mezclas de MeOH-H?.(0:1 -^1:0). Los eluatos se combinaron en cinco subfracciones de acuerdo con el comportamiento de TLC usando el sistema solvente CHCh-MeOH-H? (6:4:0.5). Las manchas se visualizaron después de rociar con FeCih al 1 por ciento. Varias fracciones se purificaron repetidamente mediante cromatografía en columna Sephadex LH-20 con metanol como eluyente, y se aislaron dos glicósidos de feniletanol de los CPhG. Sus estructuras se confirmaron como echinacósido (C35H46O20) y acteósido (C29H36O15) usando MS, 1H- y MC-NMR [35], cuyas purezas se determinaron en 99,17 por ciento y 98,92 por ciento, respectivamente, por UV-HPLC. Las estructuras de echinacósido y acteósido se muestran en la Figura 9.
4.5. Determinación Cuantitativa deCPhGs
Se empleó cromatografía líquida (HPLC) (LC{{0}}A instrumento HPLC, Shimadzu Co., Kyoto, Japón) para analizar los contenidos de echina cósido y un cteósido en las CPhG. Se usó una columna Phenomenex Gemini ODS (250 x 4,6 mm, 5 |^m) a 30 grados. Se usó una fase móvil isocrática que consistía en metanol-acetonitrilo-1 por ciento de ácido acético (15:10:75, v/v/v) durante un ciclo de 40 min, a un caudal de 0,6 ml/min, con UV detección a 334 nm.
4.6. Cultivo de células
Las células HSC se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (con alto contenido de glucosa) (DMEM, Beijing, China) suplementado con suero bovino fetal al 10 por ciento (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, EE. UU.), 10 0 UI/mL de penicilina y 100 ^g/mL de estreptomicina (HyClone, Logan, UT, EE. UU.) en una incubadora humidificada a 37 grados con 5 por ciento de CO2. Estas células se subcultivaron regularmente con solución de tripsina al 0,25 por ciento (1x) (HyClone, Logan, UT, EE. UU.) y el medio se cambió cada 2 días. Inicialmente, las células se cultivaron con DMEM que contenía FBS al 10 por ciento durante 48 h. Luego, el medio se reemplazó con DMEM sin FBS para privar a las células durante 12 h. Estas células se propagaron durante 48 h y después de 48 h, el suero se privó de FBS al 0,5 % durante 12 h antes de añadir 5 ng/ml de TGF-&1.
4.7. Determinación de valores IC50
Después de una incubación durante la noche en medio de inanición que contenía {{0}}.5 por ciento de FBS, las células HSC se sembraron en una placa de 96-pocillos a una densidad de 5 x 104 células/mL durante 24 h. Las células HSC se trataron con CPhG, equinacósido y acteósido en diferentes concentraciones (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250 y 500 ^g/mL) durante 48 h. Cada concentración tenía cuatro pocillos. Al final del tratamiento, 20 µL de MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bromuro de difeniltetrazolio] (Sigma; 5 mg/mL) y las células se incubaron durante otras 4 h. Se añadió DMSO (200 rL) a cada pocillo después de eliminar el sobrenadante. Después de agitar la placa durante 10 min en un agitador, los valores de IC50 se obtuvieron midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm utilizando un instrumento de etiquetado enzimático (Benchmark PLUS, Hercules, CA, EE. UU.), este ensayo se realizó por triplicado. Los valores IC50 de CPhGs, equinacósido y acteósido fueron 119,125, 520,345 y 6,999 Rg/mL, respectivamente.
4.8. Los efectos de inhibición de la proliferación celular y la viabilidad celular
Las células HSC se expusieron a diferentes concentraciones de CPhG (25, 50, 100 Rg/mL), equinacósido (125, 250, 500 Rg/mL) y acteósido (1,5, 3, 6 Rg/mL). Se aplicaron diferentes concentraciones de CPhGs, echinacoside y acteoside en la placa en cuatro pocillos consecutivos y se incubaron durante 48 h. Los efectos de inhibición de la proliferación celular y el nivel de viabilidad celular (basado en la medición de la actividad LDH liberada de las células dañadas en el sobrenadante [36]) se determinaron mediante un ensayo MTT. La tasa de inhibición se calculó utilizando la siguiente fórmula [37]:
Tasa de inhibición (porcentaje) " [1 — (absorbancia promedio del grupo experimental/absorbancia promedio del grupo de control en blanco)] x 100 por ciento
De acuerdo con las instrucciones del kit,
LDH (U/L) {{0}} (OD medida — DO de control)/(OD estándar — DO en blanco) x 0,2 mmol/L x 1000
Nuestro estudio preliminar mostró que CPhG, echinacoside y acteoside no afectaron la viabilidad celular.
4.9. Actividades antiproliferativas por TGF-^1
Durante mucho tiempo se ha considerado que las HSC activadas por TGF-p1 están asociadas con la fibrosis hepática, y se ha propuesto la inhibición del crecimiento de las HSC como un método para tratar la fibrosis hepática [36,38]. Los efectos antiproliferativos de CPhG, equinacósido y acteósido en HSC activadas por TGF-p1 se determinaron mediante un ensayo MTT [39]. Usando los procedimientos y las concentraciones de drogas como se describe, el
los grupos experimentales incluyeron el grupo de control, el grupo TGF-pi, TGF-pi más grupos de fármaco de diferente concentración. Todos los grupos de células, excepto el grupo de control, se cultivaron con DMEM que contenía 5,0 ng/mL de TGF-p1 (sin FBS) durante 24 h. La actividad inhibitoria sobre la proliferación celular se calculó como 100 x (absorbancia del compuesto tratado - absorbancia de la luz de fondo)/(absorbancia del modelo - absorbancia de la luz de fondo).
4.10. Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR)
El nivel de expresión de ARNm de smad2, smad3 y smad7 se determinó mediante PCR en tiempo real. Para determinar la expresión de ARNm en células HSC, las células (5 x 104 células) se sembraron en placas de seis pocillos con 3,0 ml de DMEM con 10 % de FBS y se incubaron durante la noche a 37 grados y 5 por ciento de CO2. Después de cambiar el medio de cultivo a DMEM sin suero, se agregaron a los pocillos CPhG (100, 50, 25 μg/mL), equinacósido (500, 250, 125 μg/mL) y acteósido (6, 3, 1,5 μg/mL). Después de la incubación durante 48 h con CPhG y composiciones de monómero, el ARN total se extrajo con el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) y se agitó vigorosamente con cloroformo durante 15 s. Después de dejar reposar a temperatura ambiente durante 3 min, el lisado se centrifugó a 12,000 xg durante 15 min a 4 grados. El ARN en la fase acuosa se precipitó con isopropanol y la fase acuosa superior se transfirió a un nuevo tubo de microcentrífuga. El ARN se precipitó mediante la adición de etanol al 0,75 por ciento, después de lo cual se centrifugó el tubo de microcentrífuga a 12,000 xga 4 grados durante no más de 5 min. Se eliminó el sobrenadante y se secó el ARN a temperatura ambiente durante 5-10 min. Los cebadores (Sangon) se diseñaron utilizando Batch Primer 3 y se enumeran en la Tabla 4. Los resultados se normalizaron al ARNm del gen de limpieza p-actina como control interno y se presentan como niveles relativos de ARNm. Las reacciones se realizaron con 8 |^L iQ SYBR Green Supermix, 1 10 pM par de cebadores, 8,5 l de agua destilada y 2,5 rl de ADNc.
Cada reacción en cadena de la polimerasa se realizó en las siguientes condiciones: 95 grados durante 3 min, luego 40 ciclos de 10 s a 95 grados, 30 s a 55 grados y 10 s a 55 grados -95 grados para la extensión, seguido de una sola medida de fluorescencia. Los resultados finales se describieron con los valores relativos (2_AACt). El cálculo y el análisis se realizaron mediante el sistema de detección de PCR en tiempo real iQ5.
4.11. Análisis de Western Blot
Los extractos de células enteras se prepararon utilizando tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) con cócteles de inhibidor de proteasa Halt al 1 por ciento y inhibidor de fosfatasa Halt al 1 por ciento (Thermo Fisher Scientific, Inc.). La proteína total se utilizó para la detección de smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 y smad7. La concentración de proteína se midió y cuantificó por el método de Bradford. La proteína (10-30 Rg) se separó en un gel SDS-PAGE al 10 por ciento y se transfirió a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Boston, MA, EE. UU.). Las membranas se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente con albúmina sérica bovina al 5 % y los anticuerpos primarios (anticuerpo policlonal smad2, anticuerpo p-smad2, mAb de conejo smad3 y mAb de conejo p-smad3, dilución 1:1000; mAb de conejo de smad7, 1 :200 dilución, anticuerpo monoclonal p-actina, 1:5000 dilución) se incubaron a 4 grados durante la noche. El correspondiente Alk-Phos. Los anticuerpos secundarios conjugados se incubaron a temperatura ambiente. Finalmente, las membranas se lavaron tres veces con solución salina Tris-HCl 1 x con Tween 20 al 0,1 por ciento, y las señales se escanearon y visualizaron mediante un sistema de imágenes GEL DOC XR (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). El análisis densitométrico se realizó en las proteínas de interés y se normalizó a p-actina mediante el software GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). Se usó p-actina como control interno.
4.12. Análisis estadístico
Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (DE). Los análisis estadísticos se realizaron con el software SPSS 16.0 (Universidad Médica de Xinjiang). Se utilizó el análisis probit para analizar los valores de IC50. La significación de la diferencia se calculó mediante la prueba ANOVA de una vía, y los valores con p < 0,05="" se="" consideraron="" estadísticamente="">
5. Conclusiones
En conclusión, las CPhG de C. tubulosa y sus componentes equinacósido y acteósido muestran efectos antifibróticos significativos. Entre ellos, la actividad del acteósido es la más potente, mientras que la actividad de las CPhG se encuentra entre los dos compuestos. La inhibición de la activación de la señalización de TGF-p1/Smad puede ser el mecanismo subyacente por el cual las CPhG protegen contra la enfermedad hepática crónica asociada con la fibrosis, y el equinacósido y el acteósido son la base material antifibrótica eficaz de C. tubulosa.
Expresiones de gratitud:Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81260624). Los autores desean expresar su más sincero agradecimiento al profesor Tao Liu por mejorar la redacción de este documento.
Contribuciones de autor:TL, JZ, S.-PY, LM y S.-LZ concibieron y diseñaron los experimentos. S.-PY, TL y JZ analizaron los datos. S.-PY y JZ escribieron el manuscrito. TL, LM y JZ revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
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