El echinacósido promueve la proliferación de células epiteliales tubulares renales humanas mediante el bloqueo de la vía de señalización NF‑κB mediada por HBX/TREM2

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

YuFan ZHang, QinFang Wu, LiMin ZHong, DongWei Gong

Resumen.

La proteína del virus de la hepatitis B X (HBX) es necesaria para la replicación del VHB y juega un papel en la progresión de la hepatitis en humanos. Sin embargo, se desconoce la función subyacente de HBX durante la glomerulonefritis crónica inducida por VHB (VHB-Gn). (echinacoside de cistanche)(ecH) es un glucósido feniletanoide del género Cistanche, que posee fuertes actividades antiapoptósicas y neuroprotectoras. En el presente estudio, se exploró la función de HBX y la relación entre HBX y ecH en células epiteliales tubulares renales humanas (rTecs; línea celular HK-2). Para cuantificar los niveles de expresión de ARNm y proteínas de HBX en células HK-2, respectivamente, se utilizaron análisis de PCr cuantitativos con transcripción inversa y transferencia Western. Se realizó el ensayo del kit de recuento celular-8 para analizar la proliferación celular. Se usó análisis de citometría de flujo para determinar la tasa de apoptosis. HBX mostró efectos antiproliferativos y proapoptóticos en células HK-2 y se asoció positivamente con la activación del receptor expresado en la expresión de células mieloides 2 (TreM2). Además, ECH interrumpió la función de HBX en las células HK-2, funcionando como un supresor de HBX. Además, se utilizó un inhibidor específico de NF-κB, PdTc, para examinar más a fondo la relación entre HBX y nF-κB. Los resultados sugirieron que nF-κB estaba involucrado en la vía de señalización HBX/TreM2 y regulaba negativamente la expresión de TreM2 en RTECS. El presente estudio proporcionó nuevos conocimientos sobre la función de HBX y también indicó el valor potencial de ECH como agente terapéutico para HBV-Gn.

Introducción

El virus de la hepatitis B (VHB) es un virus Hepadnaviridae, que provoca hepatitis aguda y crónica en humanos (1). El VHB no solo causa una infección persistente o transitoria en el hígado, sino que también infecta el tejido extrahepático, incluido el páncreas, las vías biliares, el sistema linfoide y los riñones (2). Además, la infección por VHB está estrechamente relacionada con la glomerulonefritis crónica (VHB-Gn); sin embargo, los mecanismos moleculares de HBV durante HBV-Gn no se conocen por completo (3,4).

La proteína reguladora del virus de la hepatitis B X (HBX) del VHB es necesaria para la replicación del VHB (5,6). varios estudios han informado que HBX promueve la proliferación celular durante el hepatocarcinoma asociado a la infección por VHB (7-9). Las células epiteliales tubulares renales humanas (rTecs) son una parte importante del intersticio tubular renal y juegan un papel activo en la inflamación renal (10). La apoptosis de rTec está estrechamente asociada con la disfunción del intersticio tubular, que posteriormente conduce a la progresión de HBV-Gn (10). HBX se expresa principalmente en células rTec y causa apoptosis de rTec y lesiones del tubo renal en pacientes con HBV-Gn (11,12). Además, se ha informado que HBX suprime la proliferación de rTecs de rata (13), y la sobreexpresión de HBX acelera la progresión del ciclo celular de la fase G1 a la S en rTecs primarios, lo que lleva a la detención del ciclo celular en la fase S (14). Por lo tanto, identificar un inhibidor de HBX puede proporcionar una nueva terapia para HBV-Gn. Sin embargo, la red molecular precisa de HBX en rTecs humanos no se entiende completamente.(echinacoside de cistanche)(ecH) es un compuesto natural extraído deCistancheplantas, que muestra efectos antiapoptóticos y antiinflamatorios (15,16). Un estudio previo informó que ecH induce la proliferación y previene la apoptosis de las células epiteliales intestinales (17). Además, se ha informado que la ecH acelera la regeneración ósea al aumentar la proliferación de células osteoblásticas (18). ecH también puede disminuir la replicación del VHB, la expresión de antígenos y la inflamación en células epiteliales intestinales de rata (16,19). Sin embargo, el efecto biológico de ecH en rTecs no se ha dilucidado completamente.

La sobreexpresión de TreM2 promovió la proliferación de células de glioma (22). Por el contrario, la caída de TreM2 disminuye la translocación de nF-κB al núcleo en células degenerativas del núcleo pulposo humano (23). Además, TreM2 se ha identificado como una nueva diana terapéutica para la degeneración del disco intervertebral humano (23). Sin embargo, no se ha informado sobre la función biológica de TreM2 en rTecs humanos. En el presente estudio, se indujo la sobreexpresión de HBX (oeHBX) en rTecs humanos (línea celular HK-2) ​​y, posteriormente, el efecto de ecH(echinacoside de cistanche) en células oeHBX transfectadas. El objetivo del presente estudio fue investigar las funciones de HBX y el valor potencial de ecH como agente terapéutico eficaz para HBV-Gn.

Materiales y métodos

Célula cultura.La línea celular rTec humana HK-2 se adquirió de Shanghai Yaji Biotechnology co., ltd. Se cultivaron células HK-2 en medio DME/F12 (n.º de cat. SH30023.01B; Hyclone; cytiva) suplementado con suero fetal bovino al 10 % (n.º de cat. 16000‑044; Gibco; Thermo Fisher Scientific, inc. .), L-glutamina 2 mM y penicilina/estreptomicina al 1 % (n.º de cat. P1400-100; Beijing Solarbio Science & Technology co., Ltd.) a 37 °C con 5 % de CO2.

ARN aislamiento y reverso transcripción-cuantitativa PCR (RT‑qPCR).El arn total se extrajo de las células HK-2 usando Trizol® (n.º de cat. 1596 -026; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, inc.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN total se transcribió inversamente en ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena de acuerdo con el protocolo del fabricante (n.º de cat. K1622; Thermo Fisher Scientific, Inc.). La qPCR se realizó con la premezcla SYBr-Green según el protocolo del fabricante (n.º de cat. K0223; Thermo Fisher Scientific, Inc.) en un detector en tiempo real ABI-7300 (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Las condiciones de PCR fueron: 95˚C por 10 min seguido de 40 ciclos de 95˚C por 15 seg, 60˚C por 45 seg. Se necesitaron tres repeticiones para cada reacción. Se utilizaron los siguientes pares de cebadores para la qPCR: HBX directo, 5'-GGcTGcTaGGTTGTacTG-3' e inverso, 5'-caGaGGTGaaGcGaaGTG -3'; TreM2 adelante, 5'-TGGcacTcTcaccaTTacG-3' y atrás, 5'-ccTccc aTcaTcTTccTTcac-3'; y GaPdH adelante, 5'-AAT cccaTcaccaTcTTc-3' y atrás, 5'-aGGcTGTTG TcaTacTTc-3'. Los niveles de ARNm se cuantificaron mediante el método 2-ΔΔCq y se normalizaron al gen de referencia internoGAPDH (24).

Sobreexpresión y noquear.Para inducir la sobreexpresión de HBX y TreM2, las secuencias de ADNc de HBX o TreM2 de longitud completa se insertaron en el vector plVX-puro (cleantech laboratorios, inc.) mediante digestión doble (Posterioriii yEcoRI). Posteriormente, el plásmido recombinado (1,5 µg) se transfectó en células HK-2 (2x105). El plásmido simulado (un vector vacío, 1 µg) se transfectó transitoriamente en células HK-2 (2x105) como control negativo (oenc) utilizando lipofectamine® 2000 (n.º de cat. 11668-027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.). ecH(echinacoside de cistanche)(cat. no. 82854-37-3; Biopurify Phytochemicals, ltd.) se disolvió en DMSO (cat. no. d2650; Sigma-Aldrich; Merck KGaa) a la concentración de 1, 2,5, 5, 10, 20 y

50 mg/l respectivamente; y añadido al cultivo de células oeHBX o oeTreM2 transfectadas. La experimentación posterior comenzó 48 h después.

Para eliminar la expresión de TreM2, se sintetizaron tres pequeños ARN de interferencia (si) (siTreM2-1, siTreM2-2 y siTreM2-3; 20 µM) dirigidos a TreM2 (Shanghai Majorbio Bio-Pharm Technology co ltd.) y posteriormente se transfectaron en células HK-2 (2x105) usando lipofectamine® 2000 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Como control negativo se usó una secuencia de siRNA codificada no específica (5'uucuccGaacGuGucacGu3, 25 nM) si-negative control (nc). El locus objetivo y las secuencias de las sirnas de TreM2 se proporcionan en la Tabla Si. La experimentación posterior se realizó 48 h después.

occidental secandoLa proteína total se extrajo de células HK-2

utilizando tampón de lisis RIPA (n.º de cat. BY140825; Jrdun Biotech Co., Ltd.). La proteína total se cuantificó utilizando el kit de ensayo de ácido bicinconínico (n.º de cat. PICPI23223; Thermo Fisher Scientific, inc.) según el protocolo del fabricante y se separaron 20 µg de proteína/carril mediante SDS-PaGe en un gel al 15 %. La densitometría de las muestras se determinó utilizando un lector de microplacas (dnM-9602, Pulangxin). Posteriormente, las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de PVDF. Después del bloqueo con leche descremada en polvo al 5 % durante 1 h a temperatura ambiente, la membrana se incubó con anticuerpos primarios (Tabla SII) a 4 °C durante la noche y se volvió a incubar con el anticuerpo secundario anti-igG de ratón (1:1, 000, nº de catálogo a0216, Instituto de Biotecnología Beyotime) durante 1 h a 37 ˚C. Las bandas de proteínas inmunorreactivas se visualizaron usando un sistema ecl (cytiva). Las transferencias se realizaron por triplicado.GAPDHy H3 se usaron como controles de carga para proteínas citoplasmáticas y nucleares, respectivamente.

Resultados

ECH (echinacoside de cistanche)suprime la función de HBX en HK‑2 células.para evaluar

la función de HBX, se indujo la sobreexpresión de HBX en células HK-2. Los niveles relativos de mrna y proteína de HBX aumentaron significativamente en las células oeHBX en comparación con las células oenc (Fig. 1a y B). Posteriormente, se cultivaron células oeHBX con diferentes concentraciones de ecH (1, 2,5, 5, 10, 20 y 50 mg/l; e1, e2,5, e5, e10, e20 y e50, respectivamente). La sobreexpresión de HBX redujo significativamente la proliferación de células HK-2, y esta disminución fue revertida por ecH de manera dependiente de la dosis a las 24 y 48 h (Fig. 1c).

Además, la tasa de proliferación de las células oeHBX no mostró diferencias significativas en comparación con las células tratadas con E1 (Fig. 1c). Por el contrario, el tratamiento con e10 aumentó significativamente la tasa de proliferación de las células oeHBX en comparación con el tratamiento con E20 y E50, que no mostró diferencias significativas (Fig. 1c). Por lo tanto, se examinó el efecto de ecH sobre la apoptosis en células tratadas con e2.5, e5 y e10-. La sobreexpresión de HBX aumentó significativamente la apoptosis de las células HK-2, y la tasa de apoptosis de las células oeHBX disminuyó con el tratamiento con ecH de manera dependiente de la dosis (Fig. 1d). En general, los resultados sugirieron que ecH inhibía la función de HBX en las células HK-2 de forma dependiente de la dosis.

TREM2 expresión es inhibido por ECH(echinacoside de cistanche) en transfectado oeHBX

células.Se usaron rT-qPcr y transferencia Western para examinar los niveles relativos de expresión de mrna y proteína de TreM2 en células oeHBX, respectivamente. Los niveles de expresión de mrna y proteína de TreM2 aumentaron significativamente en las células oeHBX en comparación con las células oenc (Fig. 2a y B). Sin embargo, ecH disminuyó los niveles de expresión de TreM2 en células oeHBX transfectadas de manera dependiente de la dosis (Fig. 2a y B). Por lo tanto, los resultados sugirieron que la expresión de HBX se asoció positivamente con la expresión de TreM2 e indicaron además el efecto supresor de ecH sobre HBX en células HK-2.

Noquear y sobreexpresión de TREM2 en HK‑2 células.Para evaluar más a fondo la función de TreM2, se indujeron la sobreexpresión y la eliminación de TreM2 en células HK-2 usando interferencia de ARN y un vector lentiviral, respectivamente. Para el ensayo de eliminación, tres siRNA dirigidos al gen humanoTREM2(siTreM2-1, siTreM2-2 y siTreM2-3) se transfectaron en células HK-2 y se utilizó un siRNA no específico como control negativo (sinc). las tres sirnas TreM2 derribaron con éxito la expresión endógena de TreM2 en células HK-2 (Fig. 3a y B). Sin embargo, los niveles de expresión de mrna y proteína de TreM2 relativos más bajos se observaron en células transfectadas con siTreM2-1 y siTreM2-2- (Fig. 3a y B), por lo tanto, siTreM2-1 y siTreM{{13 }}Las células transfectadas se eligieron para la experimentación posterior. Para los experimentos de sobreexpresión, se construyó un plásmido que contenía la secuencia TreM2cdna humana de longitud completa y posteriormente se transfectó en células HK-2 (oeTreM2). a

el plásmido simulado sirvió como control negativo (oenc). El nivel de expresión de TREM2 aumentó significativamente en las células oeTREM2 en comparación con las células oenc (Fig. 3c y d). Por lo tanto, se utilizaron células oeTreM2 para la experimentación posterior.

TREM2 silenciando disminuye la apoptosis de oeHBX células.Se evaluó el perfil de apoptosis de células oeHBX transfectadas con siTREM2 o sinc. La tasa de apoptosis de las células oeHBX más sinc fue significativamente mayor en comparación con las células abiertas. Sin embargo, la tasa de apoptosis disminuyó significativamente en las células oeHBX más siTreM2-1 o siTreM2-2 en comparación con las células oeHBX más sinc (Fig. 4a). Los resultados sugirieron que la caída de TreM2 inhibía la función de HBX durante la apoptosis de las células HK-2.

Survivin pertenece al inhibidor de una familia de proteínas de apoptosis, que inhibe la actividad apoptótica y suprime la muerte celular (25). Dirigirse a Survivin se ha identificado como un enfoque novedoso para el tratamiento del carcinoma de células renales (26). nF-κB también es un inhibidor de la apoptosis que desempeña un papel en los procesos tumorales antiapoptóticos (27). Además, la activación de caspasa3 está estrechamente relacionada con la apoptosis (28). En el presente estudio, se cuantificó el contenido de proteína de TreM2, Survivin y caspasa3 escindida en células HK‑2. El nivel de expresión de TREM2 disminuyó significativamente en las células oeHBX más siTreM2-1/2 en comparación con las células oeHBX más sinc (Fig. 4B). El nivel de expresión de survivina aumentó significativamente en las células oeHBX más siTreM2-1/2 en comparación con las células oeHBX. además, el nivel de expresión de caspasa3 escindida disminuyó significativamente en las células oeHBX más siTreM2-1/2 en comparación con las células oeHBX más sinc (Fig. 4B). Además, oeHBX disminuyó significativamente la translocación de NF‑κB al núcleo, y la transfección siTREM2‑1/2 aumentó significativamente la translocación nuclear de nF-κB (Fig. 4B). En conjunto, los resultados sugirieron que TreM2 era un factor corriente abajo de HBX en las células HK-2, por lo tanto, HBX podría promover la apoptosis al regular la expresión de TreM2 en rTecs humanos.

TREM2 sobreexpresión suprime la translocación deNF-κB a la núcleo en HK‑2 células.El efecto de la ecH(echinacoside de cistanche)en células transfectadas con oeTreM2-. La sobreexpresión de TreM2 promovió la apoptosis de las células HK-2 (Fig. 5a). La apoptosis de las células oeTREM2 disminuyó significativamente con el tratamiento con ECH (E10; Fig. 5A). Además, ECH disminuyó significativamente la expresión de TreM2 en células oeTreM2. La sobreexpresión de TREM2 disminuyó significativamente los niveles de expresión de Survivin, sin embargo, esta disminución en la expresión fue revertida por ecH. además, los niveles de expresión de la proteína de la caspasa3 escindida aumentaron significativamente en las células oeTreM2 en comparación con las células oenc; un efecto que disminuyó significativamente con el tratamiento con ECH. Además, ecH promovió la translocación de nF-κB al núcleo en células oeTreM2 (Fig. 5B). En conjunto, los resultados indicaron que ecH también suprimió la función de TreM2 en células rTec humanas.

HBXfunciones son reprimido por la NF-κB inhibidor PDTCen humano RTEC.Para evaluar más a fondo la relación entre

HBX y nF-κB, las células HK‑2 se cultivaron con un inhibidor específico de nF-κB, PdTc (10 µmol/l; P10). La tasa de apoptosis celular de las células oeHBX aumentó significativamente en comparación con las células oenc (Fig. 6a). Sin embargo, las células oeHBX más PdTc mostraron una tasa de apoptosis significativamente mayor en comparación con las células oeHBX. Además, los niveles relativos de expresión de mRNA y proteína de TreM2 han disminuido en las células oeHBX más PdTc en comparación con las células oeHBX (Fig. 6B). Por lo tanto, los resultados

sugirió que nF-κB regulaba negativamente la expresión de TreM2 en células transfectadas con oeHBX.

NF-κB inhibidor PDTC suprime TREM2 promotor actividad en oeHBX células.Se construyó un indicador de luciferasa (pGl3-enhancer-luc2) que contenía la secuencia promotora de tipo salvaje de TreM2 (pGl3-enhancer-luc2-pTreM2) y posteriormente se transfectó en oenc, oeHBX y oeHBX más células cultivadas P10.

La actividad de luciferasa del vector informador que contiene el promotor TREM2 de tipo salvaje aumentó significativamente en las células oeHBX en comparación con las células oenc. Sin embargo, PdTc suprimió significativamente la actividad de luciferasa del reportero en células oeHBX (Fig. 7). En general, los resultados indicaron que PdTc inhibió la transcripción de TreM2 al suprimir la actividad promotora de TreM2 en células oeHBX.

Discusión

HBX se expresa principalmente en rTecs de pacientes con HBV-Gn y funciona como un determinante de la patogénesis viral (11,29). Por lo tanto, aumentar el conocimiento de la función de la red de moléculas HBX es un paso crítico en el desarrollo de un enfoque novedoso para el tratamiento de HBV-Gn. El objetivo del presente estudio fue examinar más a fondo la función de HBX y explorar su red molecular potencial en rTecs humanos.

HBX inhibe la proliferación de rTecs (11). En el presente estudio, se identificaron las funciones antiproliferación y proapoptosis de HBX en RTEC humanos, lo que sugiere que HBX suprimió el desarrollo de rTecs humanos. Un estudio anterior indicó que ecH(echinacoside de cistanche)inhibe la replicación del VHB y la expresión del antígeno (19). en el presente estudio, ecH(echinacoside de cistanche)el tratamiento interrumpió la función de HBX en las células HK-2, por lo tanto, HBX puede verse afectado por ecH en las células HK-2.

INFORMES DE MEDICINA MOLECULAR 22: 1137-1144, 2020 1143

Además, los resultados sugirieron que ecH(echinacoside de cistanche)puede servir como agente terapéutico potencial para HBV-Gn.

TreM2 es un receptor inmunitario innato que desempeña un papel en la respuesta inflamatoria (30). En el presente estudio, la expresión de HBX se asoció positivamente con la expresión de TreM2 en RTECS humanos. Además, la eliminación de TREM2 disminuyó significativamente la tasa de apoptosis de las células oeHBX y ecH(echinacoside de cistanche)el tratamiento redujo el efecto de oeTreM2 sobre la apoptosis celular. En conjunto, estos resultados sugirieron que TreM2 fue atacado por HBX en células HK-2. Por lo tanto, ecH(echinacoside de cistanche)puede inhibir la apoptosis de las rTec humanas al bloquear la actividad de la vía de señalización HBX/TreM2.

Un informe anterior demostró que nF-κB no solo desempeña un papel en la apoptosis celular, sino que también está involucrado en la regulación de las respuestas inmunitarias y la inflamación (31). Además, TreM2 está mediado por el microARN-34a sensible a nF-κB durante la enfermedad de Alzheimer y la degeneración macular (32,33). en el presente estudio, la tasa de apoptosis de las células oeHBX aumentó significativamente en presencia de PdTc. Hasta donde sabemos, el presente estudio sugirió por primera vez que el inhibidor de NF-κB PdTc suprimió la actividad promotora de TreM2. Además, los resultados sugirieron que TreM2 regulaba negativamente la translocación de nF-κB al núcleo en las células HK-2, pero se asoció positivamente con los niveles de expresión de caspasa3 escindida. TreM2 jugó un papel opuesto en las células HK-2 a su papel en el núcleo pulposo degenerativo humano y las células de glioma (22,23). Por lo tanto, el presente estudio sugirió que TreM2 podría tener diferentes funciones en diferentes tipos de células humanas.

En conjunto, el presente estudio no solo indicó que nF-κB era un componente novedoso de la vía de señalización HBX/TreM2, sino que también sugirió que nF-κB regula negativamente la expresión de TreM2 en rTecs humanos. Sin embargo, las principales limitaciones del presente estudio fueron la falta deen vivosexperimentos y datos clínicos. Por lo tanto, másen vivosy se requieren estudios clínicos para confirmar los hallazgos del presente estudio.

en el presente estudio, la función de ecH(echinacoside de cistanche)fue investigado y los resultados sugirieron los efectos potenciales de ecH(echinacoside de cistanche)en las vías de señalización en humanos rTecs. Además, el presente estudio mejoró el conocimiento existente sobre la función biológica de ecH en células rTec humanas y también sugirió su potencial como agente terapéutico novedoso para HBV-Gn.

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