Los glucósidos de feniletanol de Herba Cistanche mejoran el microambiente del tumor hipóxico y mejoran los efectos del oxaliplatino a través de la vía de señalización HIF-1

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

LIMEI WEN, JUNPING HU, JIAWEI ZHANG y JIANHUA YANG

Resumen.

El cáncer de hígado es uno de los tipos más comunes de tumor maligno y se caracteriza por una alta malignidad, progresión rápida, alta morbilidad y mortalidad. Se ha informado que el oxaliplatino (OXA) tiene una eficacia marcada contra el cáncer de hígado avanzado con una toxicidad tolerable. En los tumores sólidos, el microambiente hipóxico promueve la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT), que también puede inducir la resistencia a los medicamentos del cáncer de hígado a los medicamentos de platino. HerbaCistanche (Cistanche tubulosa) se ha utilizado con frecuencia en la medicina tradicional china y los glucósidos feniletanoides de HerbaCistanche(CPhG) son los principales componentes activos. El presente estudio tuvo como objetivo investigar los efectos de las CPhG sobre la viabilidad, la apoptosis, la migración y la invasión de las células de cáncer de hígado. Las células de cáncer de hígado HepG2 se dividieron en los grupos control, DMSO, CoCl2, OXA, OXA más CoCl2 y CPhG más OXA más CoCl2. Posteriormente, se realizaron PCR cuantitativa de transcripción inversa y análisis de transferencia Western para determinar los niveles de expresión del factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1), tipo 2 de lisil oxidasa (LOXL2) y genes y proteínas relacionados con EMT (es decir, E -cadherina y Twist), con el fin de investigar los efectos de las CPhG en el cáncer de hígado. Los resultados demostraron que las CPhG podrían potenciar los efectos de OXA sobre el cáncer de hígado e inhibir la migración, la invasión y la tasa de apoptosis de las células de cáncer de hígado. Además, el tratamiento con CPhGs indujo de manera efectiva la regulación a la baja de HIF-1, LOXL2 y Twist, y la regulación al alza de E-cadherina. Los hallazgos presentes indicaron que los CPhG desencadenaron un aumento significativo en la sensibilidad a OXA y la supresión de la EMT inducida por hipoxia en el hígado.

beneficio de la cistanche: anti-Cáncer de hígado

Introducción

Liver cancer is a malignant tumor that usually involves the digestive system, and consists of primary and secondary types. Primary liver cancer is divided into hepatocellular carcinoma and intrahepatic cholangiocarcinoma (1,2). Notably, liver cancer is associated with a high incidence and mortality rate worldwide (3). According to the World Health Organization, it is predicted that there will be >1,000,000 muertes relacionadas con el cáncer de hígado para 2030, y de los casos confirmados recientemente, los de China continental representarán el 46,6 % .

Se ha informado que el oxaliplatino (OXA) ejerce efectos inhibitorios sobre el crecimiento del cáncer de hígado con una toxicidad tolerable en entornos clínicos. Sin embargo, la eficacia general de la terapia con medicamentos a base de platino se ve obstaculizada por la resistencia de las células tumorales (4). Es bien sabido que el cáncer de hígado exhibe una menor sensibilidad a la quimioterapia en comparación con otros tipos de cáncer. La resistencia a múltiples fármacos del cáncer de hígado ha contribuido a su resistencia a numerosos agentes terapéuticos (5). En un estudio anterior, Xie y Zhong (6) informaron que las células HepG2 mostraban poca sensibilidad a la adriamicina, el 5-fluorouracilo y el cisplatino en condiciones de hipoxia. A pesar de que los agentes de quimioterapia a base de platino son las principales opciones de tratamiento para el cáncer, existe resistencia a estos medicamentos entre los pacientes. Además, el pronóstico de los pacientes con cáncer de hígado sigue siendo malo (7,8). Hasta la fecha, se han realizado grandes esfuerzos para investigar la resistencia a los medicamentos y mejorar la sensibilidad a los medicamentos en pacientes con cáncer de hígado.

En condiciones hipóxicas, la revascularización se produce en las células cancerosas, lo que puede conducir a la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT) y al mimetismo vascular (VM). EMT y VM pueden promover posteriormente la invasión y la metástasis a distancia. Además, se ha especulado que la EMT desempeña un papel como fuerza impulsora de la progresión del cáncer (9). Además, los factores inducibles por hipoxia (HIF) están involucrados en la formación de neovasos, el metabolismo energético, la proliferación celular, la invasión y la metástasis (10).

La proteína similar a la lisil oxidasa (LOX) 2 (LOXL2) es un miembro de la familia LOX y está estrechamente relacionada con el entrecruzamiento covalente del colágeno y la elastina, que puede provocar fibrosis y es crucial para la integridad de la matriz extracelular ( 11). En un estudio anterior, se consideró que LOXL2 estaba estrechamente relacionado con la metástasis de las células cancerosas (12). Además, se ha demostrado que LOXL2 modula la patogenia y la progresión de numerosos tipos de cáncer maligno a través de vías extracelulares e intracelulares, que fueron índices importantes para la evaluación de un mal pronóstico (13,14).Herba Cistanchees una hierba tónica comúnmente distribuida en las regiones desérticas, que se ha utilizado con frecuencia en la medicina tradicional china (15,16).Cistanche tubulosa(C. tubulosa)es una medicina herbaria natural comúnmente plantada en la Región Autónoma de Xinjiang. Los glucósidos feniletanoides de Herba Cistanche (CPhG) sirven como uno de los principales componentes activos de Herba Cistanche. Previamente, Hu et al (17) indicaron que las CPhG podrían atenuar la lesión hepática en ratones portadores de tumores H22 e inhibir el crecimiento de células cancerosas. Se sugirió que el mecanismo subyacente podría estar relacionado con una reducción de la ‑fetoproteína sérica y podría mejorar la inmunidad en los ratones.

En el presente estudio, se indujo un modelo hipóxico de células de cáncer de hígado HepG2 utilizando CoCl2. Sobre esta base, el presente estudio tuvo como objetivo investigar los efectos de OXA sobre la proliferación, apoptosis, migración e invasión de células cancerosas en presencia de CPhG en condiciones hipóxicas. Además, se detectaron los niveles de expresión de ARNm y proteínas de HIF-1, LOXL2, E-cadherina y Twist. Además, se investigaron los mecanismos exactos que subyacen a los efectos de las CPhG en la patogenia del cáncer de hígado.

el beneficio del extracto de cistanche: tratamiento del cáncer de hígado

materiales y métodos

Línea celular. La línea celular de cáncer de hígado HepG2, identificada mediante el método STR, fue proporcionada por la Institución de Investigación Clínica, Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Xinjiang (Urumqi, China). Las células se cultivaron en DMEM con alto contenido de glucosa (HyClone; Cytiva) que contenía un 10 % de suero bovino fetal (FBS; Hyclone; Cytiva) a 37 °C en una incubadora que contenía un 5 % de CO2.

Preparation of CPhGs. C. tubulosa extraction (CPhGs) was obtained from Hetian Dichen Biotech Co., Ltd.. The content of CPhGs was >80 por ciento, entre los cuales el contenido de echinacósido y verbascosa fue de 44,5 y 16,1 por ciento, respectivamente. Los tallos de C. tubulosa (Schrenk) Wight se recolectaron en octubre de 2016 en Xinjiang, China. La planta fue identificada por el Dr. Junping Hu. Todos estos especímenes de comprobantes (n.º 201610) se han depositado en el Herbario de Plantas, Facultad de Farmacia, Universidad Médica de Xinjiang, Xinjiang, China.

Diseño experimental. Se trataron células HepG2 (5x104/ml) con diversas concentraciones de CPhG (5, 25, 50, 100, 200 y 500 µg/ml) durante 48 h a 37 ˚C (24 h después de la siembra) a la dosis de detección de CPhGs‑L/M/H. Las células HepG2 (5x104/ml) se dividieron en los siguientes grupos: i) grupo de control, cultivadas en DMEM con alto contenido de glucosa; ii) grupo DMSO, cultivado en DMSO al 0,1 por ciento (v/v); iii) grupo CoCl2 (grupo modelo de hipoxia), cultivado en DMEM sin suero que contiene CoCl2 100 µM; iv) OXA

grupo (grupo de control positivo), cultivado en OXA 5 µM (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.); v) grupo OXA más CoCl2, cultivado en OXA 5 µM combinado con CoCl2 100 µM; y vi) grupos CPhGs, tratados con CPhGs‑L/M/H (25, 50 y 100 µg/ml, respectivamente) combinados con 5 µM OXA y 100 µM CoCl2.

Ensayo de viabilidad celular. La viabilidad celular se determinó mediante un ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) y como se describió anteriormente (18). Las células (2.0x103 células/pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos. Posteriormente, ~24 h después de la siembra, las células se trataron durante 48 h según las condiciones de tratamiento en cada grupo. Luego, el medio se reemplazó con 100 µl de DMEM alto en glucosa, seguido de la adición de 10 µl de reactivo CCK-8; las células se incubaron durante 1 hora a 37 °C. La densidad óptica se midió con un lector de microplacas de detección múltiple (Thermo Fisher Scientific, Inc.) a 450 nm. Se prepararon seis réplicas para cada condición.

Determinación de la tasa de apoptosis. La tasa de apoptosis se determinó utilizando un kit de detección de apoptosis de anexina V/PI (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.). Se inocularon células HepG2 (5x105) en placas de 6 pocillos a 37 ˚C en CO2 al 5 %. Posteriormente, ~24 h después del tratamiento, las células se cultivaron en DMEM sin suero durante 4 h. Luego, las células se digirieron con tripsinización al 0,25 por ciento (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), seguido de al menos tres lavados con PBS preenfriado. Tras la centrifugación a 167,7 xg durante 5 min a 4 °C, las células se resuspendieron con tampón de unión 1X y la concentración se ajustó a 1~5x106/ml y luego se tiñeron con 5 µl de anexina V‑FITC y 5 µl de PI durante 15 min. a temperatura ambiente. Luego, las células se sometieron a citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo BD LSRFortessa (BD Biosciences) y FlowJo

Software 10.6.2 (Tree Star, Inc.).

Ensayo de cicatrización de heridas. Los efectos inhibitorios de las CPhG sobre la migración celular se examinaron mediante un ensayo de cicatrización de heridas (19). Las células se sembraron en placas de 6 pocillos hasta que se obtuvo una monocapa confluente al 100 por ciento. Posteriormente, las células se lesionaron con una punta de pipeta de 200 µl, se lavaron con PBS y se incubaron con tratamientos en un medio sin suero. Después del tratamiento farmacológico, la velocidad de cicatrización de heridas se midió a las 0, 12, 24 y 48 h, respectivamente. Las imágenes de la herida se obtuvieron utilizando un microscopio fluorescente (Nikon Ti‑S, Japón) con un aumento de x10. El cierre de la herida se midió por la distancia de la herida en cada período y se expresó como porcentaje de la distancia inicial de la herida a las 0 h.

Ensayos de Transwell. La invasión celular se evaluó mediante ensayos Transwell. Las células (1x105 células/ml) se suspendieron en 200 µl de DMEM alto en glucosa sin FBS. A continuación, las células se sembraron en pocillos superiores revestidos con Matrigel cubiertos con una membrana de filtro de tereftalato de polietileno (tamaño de poro, 8,0 µm). En la cámara inferior se colocó un total de 500 µl de DMEM alto en glucosa que contenía FBS al 10 por ciento. Se usaron hisopos de algodón para eliminar las células en la superficie superior del filtro después de 48 horas a 37 °C. Las células que invadieron a través de la membrana se fijaron con paraformaldehído al 4 por ciento durante 30 min. Posteriormente, las células se tiñeron con cristal violeta al 0,1 por ciento durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células invasoras se observaron bajo un microscopio fluorescente (Nikon Ti-S) con un aumento de x100.

PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT‑qPCR). El ARN total se extrajo de las células HepG2 con el reactivo TRIzol® (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) y la síntesis de ADNc se llevó a cabo con el kit de reactivos PrimeScript RT (Takara Bio, Inc.) según el protocolo del fabricante. La qPCR se realizó en un sistema de PCR en tiempo real 7500 (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) usando TB green™ Premix Ex Taq™ (Takara Bio, Inc.) según el protocolo del fabricante. Los cebadores utilizados para qPCR se enumeran en la Tabla I. Las condiciones de PCR consistieron en desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 5 segundos y hibridación a 60 °C durante 30 segundos. Finalmente, los resultados de la amplificación se analizaron mediante el método 2‑ΔΔCq (20).

Análisis de Western Blot. Las proteínas se extrajeron de las células tratadas durante 48 h mediante homogeneización en tampón de lisis RIPA (Thermo Fisher Scientific, Inc.) que contenía inhibidores de proteasa y fosfatasa. El contenido de proteína celular se determinó usando el método BCA. A continuación, las proteínas (40 µg) se separaron mediante SDS-PAGE en un gel al 10 % y se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se bloqueó en leche descremada al 5 % durante 1 hora a 4 °C y se incubó con los siguientes anticuerpos primarios: ‑actina (1:5,000; n.º de cat. bs‑0061R; BIOSS), HIF ‑1 (1:1,000; n.º de cat. ab179483; Abcam), LOXL2 (1:500; n.º de cat. ab179810; Abcam), E‑cadherina (1:1,000 ; n.° de cat. bs‑10009R; BIOSS) y Twist1 (1:500; n.° de cat. bs‑2441R; BIOSS) durante la noche a 4 ˚C. A continuación, la membrana se incubó con anticuerpos secundarios IgG H&L anti-conejo de cabra (1:2000; n.º de cat. ab205718; Abcam) durante 4 ha temperatura ambiente. Después de lavar con TBS-0,05 por ciento de Tween-20, las transferencias se visualizaron utilizando el sistema de quimioluminiscencia mejorada (Amersham; Cytiva). La intensidad relativa de las bandas se semicuantificó mediante análisis densitométrico utilizando el software ImageJ2x (versión 2.1.4.7; Rawak Software Inc.), y los gráficos densitométricos de los resultados se normalizaron a la intensidad de la actina.

Análisis estadístico. Se utilizó el software SPSS 19.0 (SPSS, Inc.) para el análisis de datos. Los datos se presentan como media ± desviación estándar y se analizaron mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey. PAGS<0.05 was="">se considera que indica una diferencia estadísticamente significativa. Todos los experimentos se realizaron al menos por triplicado.

Resultados

Efectos de las CPhG sobre la viabilidad celular. Las células HepG2 se trataron con diversas concentraciones de CPhG (5, 25, 50, 100, 200 y 500 µg/ml) durante 48 h (24 h después de la siembra). Como se muestra en la Fig. 1, hubo una disminución significativa en la viabilidad de las células tratadas con 200 y 500 µg/ml de CPhG en comparación con la del grupo de control (P<0.05). these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" could="" modulate="" cell="" viability="" in="" a="" dose‑dependent="">

Los CPhG potencian los efectos de OXA sobre el cáncer de hígado. Posteriormente se evaluaron los efectos de las CPhG sobre la viabilidad de las células HepG2 moduladas por OXA (fig. 2). Después de ~48 h, la combinación de CPhG y OXA disminuyó significativamente la viabilidad de las células HepG2 en comparación con la OXA plus.grupo CoCl2. Específicamente, CPhGs‑M más OXA más CoCl2 y CPhGs‑H más OXA más CoCl2 inhibieron significativamente la viabilidad de las células HepG2 en comparación con el grupo OXA más CoCl2 (P<0.05 and=""><0.01,>

Los CPhG inhiben la migración y la invasión de células de cáncer de hígado. Para seguir estudiando el potencial invasivo y la capacidad migratoria de las células de cáncer de hígado después del tratamiento con CPhG y OXA, se realizaron ensayos de cicatrización de heridas y Transwell. El ensayo de curación de heridas indicó que, en comparación con el grupo de DMSO, la migración de células HepG2 se redujo después del tratamiento con CoCl2, OXA y CPhG (200 o 500 µg/ml) (P<0.05; fig.="" 3a="" and="" b).="" for="" the="" transwell="" assay,="" the="" invasive="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="" inhibited="" in="" the="" co-treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2)="" compared="" with="" that="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 3c="" and="" d).="" conversely,="" in="" the="" co‑treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2),="" the="" invasive="" potential="" and="" migratory="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="">

Efectos de CPhGs y OXA sobre la apoptosis. Después del tratamiento con la combinación de CPhGs y OXA para

48 h, las células HepG2 se tiñeron con Anexina V-FITC y PI, seguido de citometría de flujo para determinar la apoptosis celular. Como se muestra en la Fig. 4A, los grupos de cotratamiento (CPhGs-L/M/H más OXA más CoCl2) exhibieron una elevación gradual en la proporción de células apoptóticas con el aumento en la concentración de CPhG. La mayoría de las células tratadas con CPhG y OXA se localizaron en la región Q4, lo que indica que la combinación de CPhG y OXA indujo la apoptosis en la etapa inicial. En comparación con el grupo OXA más CoCl2, se detectó una elevación significativa en la tasa de apoptosis de las células en los grupos tratados con OXA, CoCl2 y dosis moderadas o altas de CPhG (P<0.01; fig.="" 4b).="" these="" findings="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" oxa="" and="" cphgs="" may="" contribute="" to="" the="" apoptosis="" of="" hepg2="">

mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist following CPhGs and OXA co‑incubation. There were no statistical differences in the mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist between the control and DMSO groups (P>0.05; Fig. 5A‑D). Por el contrario, CoCl2 indujo un aumento significativo en los niveles de expresión de ARNm de LOXL2, HIF-1 y Twist en comparación con los del DMSOgrupo (P<0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group,="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" loxl2,="" hif‑1α="" and="" twist="" were="" significantly="" enhanced="" in="" the="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups=""><0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" by="" contrast,="" cocl2="" induced="" a="" significant="" downregulation="" in="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" dmso="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" all="" concentrations="" of="" cphgs="" combined="" with="" oxa="" and="" cocl2="" were="" able="" to="" upregulate="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" these="" results="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" cphgs="" and="" oxa="" effectively="" inhibited="" the="" emt="" under="" hypoxic="">

Niveles de expresión de proteínas de HIF‑1, LOXL2, E‑cadherina y Twist tras la coincubación de CPhG y OXA. Los resultados de la transferencia Western revelaron que los niveles de expresión de proteínas de HIF‑1, LOXL2 y Twist aumentaron en condiciones hipóxicas en comparación con los del grupo DMSO. Por el contrario,

los niveles de expresión de la proteína E-cadherina se redujeron en condiciones hipóxicas (P<0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" notably,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" cphgs‑m="" +="" oxa="" +="" cocl2="" or="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" compared="" with="" dmso="" group,="" cocl2="" treatment="" significantly="" decreased="" the="" expression="" level="" of="" e‑cadherin.="" in="" the="" cphgs="" groups,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6b).="" these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" treatment="" could="" effectively="" inhibit="" the="" downregulation="" of="" e‑cadherin,="" and="" the="" upregulation="" of="" hif‑1α,="" loxl2="" and="" twist="" induced="" by="">

Discusión

La hipoxia es una característica común en el microambiente del cáncer; esto se asocia principalmente con el hecho de que la proliferación decélulas cancerosas es más rápida en comparación con la formación vascular de neovasos aberrantes. Además, otros procesos biológicos, como la proliferación, la metástasis y la sensibilidad a los fármacos, se ven afectados por la hipoxia (21). El microambiente hipóxico del tumor es crucial para la patogénesis y la progresión del cáncer, y también es importante en la resistencia a los medicamentos y la vascularización del cáncer de hígado (22).

En el presente estudio, las células HepG2 se trataron con varias concentraciones de CPhG, entre las cuales CPhG (200 µg/ml) podría inducir significativamente una disminución de la viabilidad celular. En particular, los CPhG podrían modular la viabilidad celular de manera dependiente de la dosis. En condiciones hipóxicas, la combinación de OXA y CPhG (50 o 100 µg/ml) inhibió significativamente la viabilidad de las células HepG2 en comparación con el tratamiento con OXA solo. Se observó una tendencia dependiente de la dosis similar en los ensayos de migración e invasión de células de cáncer de hígado. Actualmente, se han realizado amplios estudios para investigar las funciones de la apoptosis de las células cancerosas en la patogenia de la enfermedad hepática (23-26). Se han desarrollado varias estrategias para tratar el cáncer de hígado mediante la promoción de la apoptosis (27‑29); por lo tanto, la interferencia en

La apoptosis de las células HepG2 puede servir como un candidato prometedor para la prevención y el tratamiento del cáncer de hígado. La apoptosis de las células HepG2 mejoró significativamente después del tratamiento con la combinación de CPhGs-M/-H y OXA en comparación con las células tratadas con OXA solo. Por lo tanto, se indicó que los CPhG podrían mejorar significativamente los efectos antitumorales de OXA.

HIF‑1 puede regular al alza los niveles de expresión de E‑cadherina, N‑cadherina y Vimentina, así como algunos factores de transcripción, como Snail1/2, Zeb1 y Twist1. Posteriormente, esto podría conducir a una pérdida de polaridad celular, aflojamiento de las uniones célula-célula, alteraciones en la proteína del citoesqueleto y la migración e invasión de células cancerosas, lo que podría resultar en la translocación de células cancerosas al sistema circulatorio a través de la membrana basilar. y posterior metástasis (30). En el presente estudio, se utilizó CoCl2 para inducir un modelo de hipoxia, que desencadenó un aumento en la viabilidad de las células HepG2, así como la migración e invasión celular. Además, los niveles de expresión de mRNA y proteína de HIF-1 aumentaron significativamente, lo que indica que CoCl2 indujo la generación de un

microambiente hipóxico. El tratamiento con la combinación de CPhG y OXA inhibió notablemente los niveles de expresión de ARNm y proteínas de HIF-1 inducidos por la hipoxia. Estos hallazgos sugirieron que las CPhG podrían atenuar el microambiente del cáncer de hígado de manera dependiente de la dosis.

La E‑cadherina es una molécula de adhesión dependiente de Ca2 plus, que tiene un papel clave en la adhesión célula a célula, el mantenimiento de la integridad de la estructura tisular y la transmisión de señales. En casos de regulación a la baja o incluso pérdida de la función de adhesión, las células cancerosas pueden exhibir una proliferación y desdiferenciación descontroladas, lo que puede promover una mayor invasión de células cancerosas y la posterior metástasis (31). Además, la E-cadherina es crucial para inhibir la EMT de las células cancerosas, que está estrechamente relacionada con la diferenciación, la invasión, la metástasis y el pronóstico de múltiples neoplasias malignas epiteliales. Los factores de transcripción inductores de EMT (EMT‑TF), como Twist, Snail y Zeb, son cruciales para la EMT. Se ha informado que la hipoxia activa vías de señalización que inducen la expresión de EMT‑TF; en particular, podría promover directamente la EMT a través de la activación transcripcional de estos factores (32). El giro es una hélice-anillo-hélice altamente conservada

factor de transcripción que se ha identificado recientemente en los últimos años. La expresión High Twist se ha detectado en numerosos tipos de células cancerosas (33). Por lo tanto, es fundamental investigar la asociación entre la expresión de Twist y la migración o metástasis de células cancerosas, así como la prevención clínica y el tratamiento de metástasis (34). En el presente estudio, se reveló que los niveles de expresión de proteína y ARNm de E‑cadherina estaban regulados a la baja en presencia de hipoxia, mientras que los niveles de expresión de proteína y ARNm de Twist estaban elevados. Estos hallazgos fueron consistentes con los resultados de los ensayos de invasión y migración, lo que implica que la hipoxia puede contribuir a la aparición de EMT. Después del tratamiento con OXA, los niveles de expresión de la proteína E-cadherina se redujeron; esto indicó que OXA exhibió poca eficiencia en la inhibición del crecimiento de células de cáncer de hígado, mientras que podría promover la EMT. Sin embargo, en combinación con CPhG, la sensibilidad de las células HepG2 a OXA mostró una marcada mejora en presencia de hipoxia. Además, el cotratamiento con CPhG y OXA podría inhibir la viabilidad celular, la migración y la invasión de células HepG2. El presente estudio solo detectó

Expresión de Twist y E‑cadherina; por lo tanto, los estudios futuros tienen como objetivo centrarse en más marcadores relacionados con la EMT, para evaluar el efecto inhibitorio de las CPhG sobre la EMT inducida por hipoxia en el cáncer de hígado.

Se ha informado que HIF-1 promueve la expresión de LOXL2 y mejora la migración e invasión de células cancerosas hepáticas, lo que puede estar estrechamente relacionado con el mal pronóstico del cáncer de hígado (30). En un estudio anterior, los niveles de expresión de LOXL2 en tejidos de cáncer de hígado adyacentes aumentaron notablemente en comparación con los de los tejidos cancerosos (35). Además, estaba estrechamente relacionado con la invasión y metástasis del cáncer de hígado. El silenciamiento del gen LOXL2 mediante ARN de interferencia pequeño inhibió la proliferación de células HepG2 y SMCC-7721, lo que provocó la detención del ciclo celular de las células cancerosas y un aumento de la apoptosis (36). Shao et al (35) investigaron la correlación entre LOXL2 en muestras de cáncer de hígado y factores clinicopatológicos, VM y pronóstico entre 201 casos que recibieron cirugía para su tratamiento. Se planteó la hipótesis de que LOXL2 desempeñaba un papel importante en la patogenia y la progresión del cáncer de hígado, lo que podría servir como objetivo para el desarrollo de fármacos. Además, Peng et al (37) demostraron que LOXL2 podría activar las vías de señalización de Snail/E-cadherina y Src quinasa/Focal quinasa de adhesión, lo que puede contribuir a la patogénesis y progresión de la EMT de las células de cáncer gástrico. En el presente estudio, en condiciones hipóxicas, los niveles de expresión de ARNm y proteínas de LOXL2 aumentaron, mientras que su expresión disminuyó después del tratamiento con OXA. Además, el tratamiento con una combinación de CPhG y OXA dio como resultado una regulación a la baja obvia de la expresión de LOXL2, lo que puede ayudar de manera efectiva a los efectos antitumorales de OXA en el cáncer de hígado.

Hay algunas limitaciones para el estudio actual. El presente estudio debería haber utilizado dos líneas celulares de cáncer de hígado más, incluida la línea celular SMCC‑7721, pero no se pudieron usar porque no fue posible comprar estas líneas celulares porque se identificaron erróneamente y se derivaron de células HeLa. Además, el presente estudio no analizó los efectos antioxidantes de diferentes concentraciones de CPhG en las células.

En conclusión, las CPhG podrían alternar el microambiente tumoral hipóxico de las células de cáncer de hígado mediante la modulación de la vía de señalización HIF‑1. Además, la sensibilidad de las células de cáncer de hígado a OXA aumentó significativamente en respuesta al tratamiento con una combinación de CPhG y OXA. Estos hallazgos pueden proporcionar una nueva estrategia de tratamiento para mejorar la sensibilidad del cáncer de hígado a la quimioterapia.

Expresiones de gratitud

No aplica.

Fondos

El presente estudio fue apoyado por el Laboratorio Clave de Componentes Activos de Fármacos Naturales y Tecnología de Liberación de Fármacos de Xinjiang (subvención n.º XJDX1713), el Proyecto de Candidato de Reserva para el Líder de Innovación Científica y Tecnológica en la Región Autónoma de Xinjiang Uygur (subvención n.º 2019XS14), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención n.º 81860735) y Bethune Charitable

Fundación 'Bethune·Quest-construcción de capacidad de investigación científica farmacéutica' (subvención nº B-19-H-20200622).

Disponibilidad de datos y materiales.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Contribuciones de los autores

LMW y JWZ realizaron los experimentos, redactaron el manuscrito y confirmaron la autenticidad de todos los datos sin procesar. JPH y JHY diseñaron el presente estudio. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Aprobación ética y consentimiento para participar

No aplica.

Consentimiento del paciente para la publicación

No aplica.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Referencias

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