Análisis fitoquímico, In-vitro Antiproliferativo, Antioxidante Parte 1

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Fondo:Rumex rothschildianus es el único miembro de una sección única del género Rumex, en la familia Polygonaceae. Esta especie es una pequeña anual dioica muy rara, endémica de Palestina que se utiliza tradicionalmente como alimento y para el tratamiento de diversas enfermedades. Por lo tanto, la investigación actual tuvo como objetivo evaluar los componentes químicos, antioxidantes, anti-a-amilasa, anti-a-glucosidasa, anticipar y efectos citotóxicos de cuatro fracciones solventes de hojas de R. rothschildianus.

Métodos:Se extrajo polvo seco de hojas de R. rothschildianus en cuatro solventes con diferentes polaridades. Se realizaron varias pruebas fitoquímicas cualitativas y cuantitativas para determinar los componentes de los extractos. El análisis colorimétrico se utilizó para la determinación cuantitativa de fenoles, flavonoides y taninos. Se realizaron ensayos in vitro para evaluar las actividades antioxidantes, anti-α-amilasa, anti-α-glucosidasa y anticipadoras de los extractos, así como la citotoxicidad mediante el ensayo MTS contra la línea celular de carcinoma de cuello uterino (HeLa) y la línea celular de cáncer de mama. (MCF7).

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Resultados:La fracción de acetona de las hojas de R. rothschildianus mostró la mayorantioxidanteactividad, por tener el mayor contenido de flavonoides y fenoles, con un valor ICso de 6,3±0,4 ug/ml, frente a 3,1±0,9 ug/ml de Trolox, y respecto actividad de inhibición de la lipasa la fracción de acetona mostró la actividad más potente con un valor ICso de 26,3±{{10}},6 ug/ml, en comparación con el control positivo de orlistat ICso 12,3 ug/ml. El mismo extracto fue el inhibidor más potente de a-amilasa y a-glucosidasa, con valores de ICso de 19,1±0,7 ug/ml y 54,9±0,3 ug/ml, respectivamente, en comparación a 28,8, 37,1±0,3 ug/y de acarbosa, respectivamente. La fracción de hexano mostró una inhibición del 99,9 por ciento de las células HeLa y una inhibición del 97,4 por ciento de las células MCF7.

Conclusión:La fracción de acetona de las hojas de R. rothschildianus podría proporcionar una fuente de compuestos bioactivos para el tratamiento del estrés oxidativo. De manera similar, la fracción de hexano indica el prometedor potencial antitumoral de R. rothschildianus. Claramente, estas indicaciones iniciales necesitan una mayor purificación de los compuestos potencialmente activos y, en última instancia, estudios in vivo para determinar su eficacia.

Palabras clave:Rumex rothschildianus, Antioxidante, Lipasa, Amilasa, Trolox, Fitoquímica, Actividad antiproliferativa

Fondo

Las plantas se han utilizado como terapias desde la antigüedad. Las raíces, las semillas, la corteza, las hojas y las flores se han utilizado con fines curativos. En la actualidad, las medicinas sintéticas están disponibles y son efectivas en el tratamiento de una amplia gama de enfermedades; sin embargo, algunas personas siguen prefiriendo las hierbas medicinales porque se considera que son menos dañinas para el cuerpo humano [1,2]. Las plantas medicinales son por definición la fuente de compuestos fitoquímicos que poseen actividades terapéuticas. Estas propiedades se basan en la presencia de diferentes metabolitos secundarios, como fenoles, terpenoides y alcaloides [3]. Rumex rothschildianus Aarons. es el único miembro de una sección única del género Rumex, en la familia Polygonaceae. Esta especie es una pequeña dioica anual muy rara, endémica de Palestina. Tiene una altura media de 45 cm y se caracteriza por tallos erectos que sostienen hojas radicalmente pecioladas, cortas hastatas en la base y cortas acuminadas en el ápice. Las flores tienen un diámetro de 3-4 mm, mientras que las flores pistiladas tienen unos 2 mm de diámetro con una capa membranosa coriácea [4]. Rumex spp. están muy extendidas en diferentes regiones de Turquía y están representadas por 22 especies. Algunas de las especies más comunes son R.patientia L, R. Crispus L, R. acetosa LR caucasicus rech, R. alpinus LR alpinus y R. caucasicus son plantas perennes distribuidas en Anatolia central y oriental a una altitud de {{10 }} m sobre el nivel del mar. El género Rumex se ha utilizado ampliamente en la medicina tradicional en Turquía para tratar trastornos como el estreñimiento, la diarrea y el eccema [5, 6]. El género también tiene algunos efectos laxantes, diuréticos, antipiréticos, cicatrizantes y antiinflamatorios. Mucha gente en la parte oriental de Turquía usa las hojas tiernas de Rumex spp. como conservante en el queso, además de dar aroma a los alimentos [7].

Se ha llevado a cabo una variedad de investigaciones sobre las especies de Rumex, como el informe de actividades antimicrobianas para algunas especies. Algunos fitoquímicos bioactivos se han encontrado previamente en Rumex vicarious L, como carotenoides, tocoferoles, polifenoles, flavonoides y ácido ascórbico, que tienen un papel como antioxidantes y agentes desintoxicantes naturales. La ingesta dietética de fitoquímicos antioxidantes, como los carotenoides,fenoles, yflavonoidespuede proteger contra enfermedades no transmisibles en humanos, como cáncer, trastornos cardiovasculares y otros problemas de salud relacionados con el estrés oxidativo [5, 8]. Se sabe que los radicales libres dañinos desempeñan un papel importante en muchos problemas de salud importantes, como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, la artritis reumatoide, las cataratas,enfermedad de alzheimer, y otras enfermedades degenerativas relacionadas con el envejecimiento. Los antioxidantes son componentes beneficiosos que neutralizan estos radicales libres antes de que puedan atacar las células y, por lo tanto, previenen el daño a las proteínas, lípidos ycarbohidratos. Se ha propuesto una variedad de antioxidantes tanto naturales como sintéticos para el tratamiento de enfermedades humanas. Tal interés en el papel de los antioxidantes en la salud humana ha impulsado la investigación en los campos de la ciencia de los alimentos y las hierbas medicinales, evaluando la función de las hierbas como antioxidantes. La acción antioxidante incluye la capacidad de eliminación de radicales libres, la inhibición de la peroxidación lipídica, la capacidad quelante de iones metálicos y también la capacidad reductora [9,10].

El cáncer es uno de los problemas de salud más globales. El desarrollo y el descubrimiento de nuevos medicamentos contra el cáncer siguen siendo extremadamente importantes debido a varios factores. Estos factores incluyen tratamientos que pueden causar efectos secundarios importantes o pueden ser bastante costosos. Las alternativas biológicamente más seguras y más asequibles siguen siendo muy deseables [11-14].

Varias especies de plantas se consideran fuentes potenciales de moléculas bioactivas, como la atropina de las hojas de belladona, la cocaína de las hojas de coca, la vincristina de la planta de vinca y muchas otras que aún juegan un papel importante en la medicina moderna [15,16].

Los efectos terapéuticos útiles pueden provenir de la mezcla de productos secundarios presentes en las plantas medicinales. Estos compuestos son en su mayoría metabolitos secundarios, como alcaloides, esteroides, taninos, flavonoides y fenoles, que se sintetizan y depositan en partes específicas de estas plantas [17,18]. El presente estudio investiga las actividades in vitro anti-a-amilasa, anti- -glucosidasa, antilipasa, antiproliferativa y antioxidante de diferentes fracciones extraídas de las hojas de R. rothschildianus.

Métodos

Material vegetal, productos químicos e instrumentos.

Las hojas de R. rothschildianus se recolectaron de las regiones occidentales de Palestina, entre febrero y marzo de 2018. Fueron identificadas por el Dr. Nidal Jaradat, del Laboratorio de Farmacognosia de la Universidad Nacional An-Najah, bajo el código de muestra del comprobante Pharm-PCT{{3} }. Todos los productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich. Un espectrofotómetro-UV/Visible (grado Jenway 7135, Stafford-shire, Reino Unido), papeles de filtro (Whitman No. 1, Washington, EE. UU.), dispositivo agitador (Memmert 531-25-1, Estocolmo, Suecia), aparato rotavap (Heidolph -VV 2000, Schwa-bach, Alemania), trituradora (Aero Plus 500 W Mixer Grinder, I01, Wan Chai, China), balanza electrónica (Radwag, AS 220/c/2, Torunska, Polonia), liofilizador-BT85 (Tecnología Millrock, China) y crio-desecador (Tecnología Mill-rock, BT85, Kingston, EE. UU.).

Preparación de extractos y fraccionamiento

El polvo seco de las hojas de R. rothschildianus se extrajo agregando solventes secuencialmente en función de su polaridad, comenzando con el solvente no polar hexano y luego acetona (un solvente orgánico aprótico polar), metanol (alcohol polar) y finalmente agua destilada (un solvente prótico polar). Para cada extracción, se colocaron alrededor de 25 g de hojas secas molidas en 0.51 hexano durante 72 horas en un dispositivo agitador a 100 rotaciones por minuto a 25 grados. En primer lugar, el hexano se reemplazó con 0,5 l de acetona y, posteriormente, el reemplazo implicó volúmenes equivalentes de metanol y agua. Las incubaciones en los disolventes fueron como se ha descrito anteriormente para el hexano. Cada fracción orgánica se filtró y se concentró al vacío en un evaporador rotatorio, mientras que la fracción acuosa se secó en un liofilizador. Finalmente, todas las fracciones crudas se almacenaron a 4 grados [19,20].

El rendimiento de cada fracción se calculó mediante la siguiente fórmula:

Evaluación fitoquímica preliminar

Se realizaron pruebas de tamizaje fitoquímico de hojas de R. rothschildianus en cuatro fracciones para identificar metabolitos secundarios activos. Los resultados cualitativos se expresaron como (más) para la presencia y (-) para la ausencia de fitoquímicos bioactivos[10,21].

Determinación del contenido fenólico total (TPC)

El procedimiento para determinar TPC se basó en el de Cheung et al. El TPC se expresó en miligramos de equivalentes de ácido gálico por gramo de peso seco de hojas (mg AG/g de peso seco). Se preparó una solución de carbonato de sodio al 7,5 por ciento recién preparada colocando 7,5 g de Na2CO3 en un matraz volumétrico y ajustando el volumen a 100 ml con agua destilada. Se preparó una solución estándar de referencia (solución de ácido gálico) disolviendo 100 mg de ácido gálico en agua destilada hasta un volumen final de 100 ml. A partir de esto, se realizó una dilución seriada para obtener soluciones de ácido gálico a 100, 70, 50, 40 y 10 ug/ml）. Las soluciones madre de las fracciones de hojas se prepararon disolviendo 100 mg de extracto vegetal en agua destilada y se ajustaron a un volumen total de 100 ml. Las mezclas de reacción se prepararon mezclando 0,5 ml de cada solución de fracción con 2,5 ml de reactivo de Folin-Ciocalteu al 10 por ciento, que se disolvió en agua con 2,5 ml de bicarbonato de sodio al 7,5 por ciento. Los tubos de muestra se incubaron durante 45 min a 45 grados. Luego, se midió la absorbancia de cada uno en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 765 nm. Las muestras de trabajo se prepararon por triplicado para cada prueba analítica, a partir de las cuales se calcularon los valores de desviación estándar y media [21].

Determinación del contenido total de flavonoides (TFC)

El TFC en las cuatro fracciones de hojas de R. rothschildianus se evaluó usando una curva de calibración de rutina (compuesto estándar de referencia). Los resultados se expresaron como miligramos de rutina equivalente por gramo de peso seco de extracto de hojas (mg RU/g de peso seco). Se estableció una curva de calibración para la rutina utilizando diluciones en serie generadas a partir de una solución madre de 1{{10}}0 ug/ml. Para preparar la solución madre, se disolvieron 10 mg de rutina en 10 ml de agua destilada y luego se diluyó a 100 ml. Posteriormente, la solución madre se diluyó para proporcionar rutina a concentraciones de 10, 30, 40, 50, 70 y 100 ug/ml. Para la preparación de la solución de trabajo, se mezclaron 0,5 ml de cada solución de fracción con 3 ml de metanol, 0,2 ml de AlCl3 al 10 %, 0,2 ml de acetato de potasio 1 M y 5 ml de agua destilada, y luego se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. Los pasos anteriores se repitieron para cada una de las fracciones, luego de lo cual se midió la absorbancia a una longitud de onda de 415 nm. Para un control en blanco, se preparó una solución de trabajo con agua destilada en lugar del extracto de muestra. Las muestras se prepararon por triplicado para cada prueba analítica, a partir de las cuales se calcularon los valores de media y desviación estándar [22].

Determinación del contenido de taninos totales (TTC) El protocolo de Sun et al. se utilizó para determinar TTC en las cuatro fracciones foliares de R. rothschildianus, siendo el procedimiento más utilizado. Se utilizó catequina como compuesto de referencia para construir una curva de calibración. Se preparó un stock de 100 ug/ml en metanol, a partir del cual se generó una serie de diluciones para dar concentraciones de catequina de 10, 30, 50, 70 y 100 ug/ml. Se preparó recientemente una solución al 4 por ciento de vainillina en metanol. Se prepararon soluciones madre de las fracciones a 100 ug/ml utilizando metanol como disolvente. Para la solución de trabajo, se mezclaron 0,5 ml de cada solución de fracción con 3 ml de solución de vainillina y 1,5 ml de HCl concentrado. La mezcla se dejó reposar durante 15 min y luego se midió la absorbancia a 500 nm utilizando una solución de trabajo preparada con metanol en lugar del extracto de muestra como blanco. Todas las muestras de trabajo se analizaron por triplicado, a partir de las cuales se calcularon los valores de desviación estándar y media. El tanino total en cada fracción se expresó en términos de equivalentes de catequina (mg de CAE/g de peso seco de hojas)[23].

Método de actividad antioxidante

El ensayo de captación de radicales libres 2,2-difenil-picrilhidrazilo (DPPH) se utilizó para medir la actividad antioxidante en las diferentes fracciones de las hojas de R. rothschildianus. Se preparó una solución madre de 1000 ug/ml de cada fracción vegetal en metanol. Además, también se preparó una solución de 1000 ug/ml de Trolox (el estándar de referencia). Se preparó una serie de diluciones a partir de las soluciones madre para cada fracción, dando seis diluciones en serie a 2, 5, 10, 20, 50 y 100 ug/ml. Se mezcló un ml de cada dilución de extracto con 1 ml de 0,002 g/ml de DPPH en metanol. Se añadió un ml de metanol para dar un volumen de trabajo final de 3 ml. La solución de DPPH se preparó recientemente, ya que era muy sensible a la luz. El blanco de control de las series de concentraciones fue DPPH en metanol en proporción 1:2, sin adición de extracto. Todas las soluciones de trabajo se incubaron a temperatura ambiente (25 grados) en la oscuridad durante aproximadamente 30 min. A continuación, se midieron las densidades ópticas con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 517 nm. Se utilizó la siguiente ecuación para calcular el porcentaje de inhibición de DPPH para cada fracción de planta, con Trolox como compuesto estándar:

donde, Ag es la absorbancia registrada de la solución en blanco y Ats es la absorbancia registrada de la solución de muestra analizada [21].

Ensayo de inhibición de la lipasa pancreática porcina

Se prepararon soluciones madre de 500 ug/ml a partir de cada fracción de planta en DMSO al 10 por ciento. A partir de estos, se hizo una serie de diluciones de cinco concentraciones de 50, 100, 200, 300 y 400 ug/ml. Justo antes de su uso, se preparó una solución madre de 1 mg/ml de lipasa pancreática porcina en tampón Tris-HCl. El sustrato, butirato de p-nitrofenilo (PNPB), se preparó disolviendo 20,9 mg en 2 ml de acetonitrilo. Para cada solución de trabajo, se mezclaron 0,1 ml de lipasa pancreática porcina con 0,2 ml de fracción vegetal de cada miembro de la serie de diluciones. Se añadió Tris-HCl para que el volumen final de las soluciones de trabajo fuera de 1 ml y se incubaron a 37 grados C durante 15 min. Después de la incubación, se añadieron 0,1 ml de solución de butirato de p-nitrofenilo a cada tubo de ensayo. A continuación, la mezcla se incubó durante 30 minutos más a 37 grados. La actividad de la lipasa pancreática se determinó midiendo la hidrólisis de PNPB en p-nitrofenolato a 410 nm, usando un espectrofotómetro UV. Se repitió el mismo procedimiento usando orlistat como compuesto estándar de referencia. El porcentaje de inhibición de lipasa por fracciones vegetales se calculó con la siguiente ecuación:

donde, Ap es la absorbancia registrada de la solución en blanco y Ats es la absorbancia registrada de la solución de muestra analizada [24]. Ensayo inhibidor de a-amilasa

Se disolvieron 100 mg de cada fracción en unos pocos milímetros de DMSO al 10 por ciento, y luego se disolvieron hasta 100 ml en 0,02 M Na HPOq/ NaH-PO4, NaCl 0,006 M, pH 6,9 para dar finalmente soluciones madre con concentraciones de 1000 ug/ml. A partir de estos, se prepararon las siguientes diluciones de 10, 50, 70, 100 y 500 ug/ml, utilizando DMSO al 10 por ciento como diluyente. Un volumen de 0,2 ml de 2 unidades/ml de amilasa pancreática porcina se mezcló con 0,2 ml

fracción vegetal y se incubó durante 10min a 30 grados. Después de la incubación, se añadieron 0,2 ml de una solución de almidón al 1 por ciento recién preparada en agua y los tubos se incubaron durante al menos tres minutos más. En este punto, la reacción se detuvo mediante la adición de 0,2 ml de reactivo de color de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNSA) y se diluyó con 5 ml de agua destilada, antes de calentarse a 90 grados durante 10 min en agua. bañera. A continuación, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se midió la absorbancia a 540 nm. El control en blanco se preparó utilizando las mismas cantidades descritas anteriormente, pero reemplazando la fracción vegetal con 0,2 ml de tampón. Se usó acarbosa como referencia estándar siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. La actividad inhibidora de la a-amilasa se calculó utilizando la siguiente ecuación:

donde, Ag: es la absorbancia de la muestra en blanco y Ar es la absorbancia de la muestra de prueba [25].

Este artículo está extraído de Jaradat et al. BMC Medicina y Terapias Complementarias (2021) 21:107