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Plumbagin suprime la melanogénesis inducida por MSH en células de melanoma de ratón B16F10 al inhibir la actividad de la tirosinasa, parte 2

May 09, 2023

3. Discusión

Plumbagin es un metabolito secundario derivado de plantas y muestra varias funciones biológicas, que incluyen actividades antiinflamatorias, anticancerígenas, antialérgicas y antibacterianas [8,9]. Sin embargo, no se sabía si la plumbagina tenía un efecto inhibitorio sobre la melanogénesis relacionada con la hiperpigmentación y el melanoma. En este estudio, demostramos que plumbagin suprime fuertemente la melanogénesis en las células de melanoma B16F10, y este trabajo podría brindar una oportunidad para desarrollar cosméticos para el cuidado de la piel basados ​​en las actividades antiinflamatorias, antialérgicas, antibacterianas y antimelanogénesis de plumbagin.

Según estudios relevantes, la cistanche es una hierba común conocida como "la hierba milagrosa que prolonga la vida". Su principal componente es el cistanosido, que tiene diversos efectos como antioxidante, antiinflamatorio y promotor de la función inmunológica. El mecanismo entre la cistanche y el blanqueamiento de la piel radica en el efecto antioxidante de los glucósidos de cistanche. La melanina en la piel humana se produce por la oxidación de la tirosina catalizada por la tirosinasa, y la reacción de oxidación requiere la participación de oxígeno, por lo que los radicales libres de oxígeno en el cuerpo se convierten en un factor importante que afecta la producción de melanina. Cistanche contiene cistanosido, que es un antioxidante y puede reducir la generación de radicales libres en el cuerpo, inhibiendo así la producción de melanina.

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Debido a que la regulación positiva de la melanogénesis a menudo se observa en el melanoma maligno con niveles de tirosinasa sobreexpresados ​​en la sangre y en los tejidos tumorales, es evidente que la melanogénesis es un objetivo potencial para la quimioterapia de los melanomas malignos [1]. En el presente estudio, encontramos que la plumbagina suprime directamente la actividad de la tirosinasa independientemente de la maquinaria transcripcional asociada con la melanogénesis (Figura 6). Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que plumbagin puede ser un componente potencial de una estrategia preventiva y terapéutica para el manejo del melanoma maligno. De hecho, se han informado los efectos anti-melanoma, quimiosensibilizadores y radiosensibilizadores de la plumbagina en la terapia del melanoma [17-21].

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En estudios previos sobre los efectos anticancerígenos y antiinflamatorios de la plumbagina, se utilizaron aproximadamente 5–10 µM de plumbagina (más alta que la concentración utilizada en este estudio) en modelos in vitro [17,22 ,23]. Por lo tanto, investigamos el efecto tóxico de la plumbagina en las células proliferativas, incluidos los queratinocitos normales (HaCaT) y las células epiteliales del cristalino (B3), que pueden dañarse con los cosméticos para el cuidado de la piel. Nuestros resultados demostraron que concentraciones más bajas, aproximadamente 0.5–1 µM de plumbagina, no son tóxicas para los queratinocitos normales y las células epiteliales del cristalino, pero son lo suficientemente efectivas como para reducir la actividad de la tirosinasa y la síntesis de melanina. Además, también encontramos que la plumbagina suprime la melanogénesis de manera más eficaz que la arbutina 1 mM o el ácido kójico 0,2 mM, que son agentes blanqueadores de la piel bien conocidos. Estos resultados sugieren que plumbagin es seguro para usar como componente para desarrollar cosméticos para blanquear la piel.

En el presente estudio, estudiamos los efectos inhibidores de la plumbagina en la reacción de la enzima tirosinasa utilizando ensayos de actividad de tirosinasa celular y libre de células basados ​​en la oxidación de L-DOPA. Sin embargo, no sugerimos un mecanismo molecular preciso sobre cómo la plumbagina inhibe la actividad de la tirosinasa. Este mecanismo debe investigarse más a fondo para determinar si plumbagin interactúa directamente con la tirosinasa e inhibe su actividad oxidasa o si tiene efectos indirectos que conducen a una disminución de la actividad de la tirosinasa.

4. Materiales y Métodos

4.1. Reactivos y Anticuerpos

Plumbagin, -MSH (M4135), arbutina (A4256), ácido kójico (K3125), L-DOPA (333786) y tirosinasa (T3824) purificados de hongos se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Anticuerpos contra MITF (#12590), p-AKTS473 (#4060), p-AKTT308 (#13038), p-CREB (#9198), p-ERK1/2 (#4370), ERK1/2 (#9102), H2AX (n.º 9718), PARP (n.º 5625) y caspasa-3 (n.º 9665) se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE. UU.). La tirosinasa (sc-7833) y la tubulina (sc-9104) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EE. UU.).

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4.2. Ensayo de cultivo celular y viabilidad celular

Se cultivaron células B16F10 (células de melanoma de ratón), B3 (células epiteliales de cristalino humano) y HaCaT (queratinocitos humanos) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10 % y glucosa 25 mM. Las células se incubaron en una atmósfera húmeda de 95 por ciento de aire y 5 por ciento de CO2 a 37 ◦C. Para medir la viabilidad, las células se incubaron con varias concentraciones de plumbagina disuelta en dimetilsulfóxido (DMSO) durante 48 o 72 h. Después de la incubación, las células cultivadas se lavaron con PBS y luego se incubaron con solución de tinción de cristal violeta al 0,5 por ciento durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para medir la densidad óptica, las células teñidas se incubaron con una solución de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 1 por ciento durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se midió la densidad óptica de cada pozo a 570 nm (OD570) usando un lector de absorbancia (BioTek, Winooski, VT, EE. UU.).

4.3. inmunotransferencia

Las células cultivadas se lisaron usando IGEPAL al 1 por ciento (octilfenoxipolietoxietanol), NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 7,9), NaF 10 mM y un cóctel inhibidor de proteasa en tampón de lisis. Las muestras de proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE), y las proteínas separadas se transfirieron luego a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). Las membranas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios (1:1000) a 4 ◦C y luego se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (1:10 000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas se visualizaron utilizando un kit ECL Prime (GE Healthcare Pittsburgh, PA, EE. UU.).

4.4. Medición del contenido de melanina intracelular y extracelular

El contenido de melanina se determinó y cuantificó utilizando un método descrito previamente con una ligera modificación [2,24]. Para el análisis del contenido de melanina, se cultivaron células B16F10 en DMEM sin rojo de fenol que contenía suero bovino fetal al 10 por ciento. Se cultivaron células B16F10 con tratamiento -MSH en ausencia o presencia de plumbagina durante 3 o 4 días. Las células cultivadas o los medios se recogieron y los sedimentos se disolvieron en NaOH 1N que contenía DMSO al 10 por ciento a 80 ◦C durante 1 hora. El contenido de melanina se midió usando un lector de absorbancia a 475 nm (OD475), y luego el contenido de melanina se normalizó a la concentración de proteína celular.

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4.5. Aislamiento de ARN y RT-PCR cuantitativa

El ARN total se extrajo de las células B16F10 usando TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) y se usaron 2 µg de ARN total para la síntesis de ADNc usando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Waltham, MA, EE. UU.). La PCR cuantitativa se realizó utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Las secuencias de los cebadores de PCR (50-30 ) fueron las siguientes: TCAAGTTTCCAGAGACGGGT y CATCATCAGCCTGGAATCAA para MITF; ATAGGTGCATTGGCTTCTGG y TCTTCACCATGCTTTTGTGG para TYR; CATTTCCAG CTGGGTTTCTC y TGGTCTGTGAATCCTTGGAA para TYRP1.

4.6. Ensayo de actividad de tirosinasa celular

La actividad de la tirosinasa celular se determinó usando un método previamente descrito con modificaciones [25,26]. Las células B16F10 cultivadas se incubaron con -MSH en ausencia o presencia de plumbagin, y luego las células se lavaron y lisaron con PBS que contenía 1 por ciento de desoxicolato de sodio y 0, 5 por ciento de Triton X{{8} }. Después de determinar la concentración de proteína, se incubaron 50 µg de proteína con L-DOPA 2,0 mM y PBS 0,1 M (pH 6,8) durante 1 ha 37 ◦C. La oxidación de L-DOPA se midió a 475 nm (OD475) usando un lector de absorbancia. La actividad se midió utilizando la siguiente fórmula: actividad de tirosinasa (porcentaje)=(OD475 de muestra/OD475 de control) × 100.

4.7. Ensayo de actividad de tirosinasa libre de células

Para determinar el efecto inhibitorio de la plumbagina sobre la actividad de la tirosinasa, se incubó tirosinasa de hongo purificada durante 2 h con una mezcla de reacción que contenía 0.1 M PBS (pH 6.8) y 2 mM de L-DOPA en ausencia o presencia de plumbagina. . La oxidación de L-DOPA a dopacromo se midió a 475 nm (OD475) con un lector de absorbancia. La actividad se midió utilizando la siguiente fórmula: actividad de tirosinasa (porcentaje)=(OD475 de muestra/OD475 de control) × 100.

4.8. Ensayo de actividad de captación de radicales DPPH

Para determinar la actividad eliminadora de radicales de la plumbagina, se preparó y usó una solución de {{0}},2 mM de DPPH en metanol. Cada muestra se diluyó con agua destilada a concentraciones finales de 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 y 5 mg/mL (plumbagina), o { {13}}.005, 0.01, 0,05, 0,1, 0,2 y 0,5 mg/ml (vitamina C). Después de la reacción, se midió la densidad óptica (OD) a 517 nm (OD517) usando un lector de absorbancia. La actividad de eliminación de radicales libres se calculó mediante la siguiente fórmula: actividad de eliminación de radicales DPPH (porcentaje)=10 − ((ODs/ODc) × 100), donde ODs representa la absorbancia de las muestras y ODc representa la absorbancia de las muestras. control de vehículos.

4.9. Análisis estadístico

Todos los datos se analizaron utilizando una prueba t de Student no pareada para dos comparaciones experimentales y un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples usando Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU.). Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). Las diferencias entre los valores medios se consideraron estadísticamente significativas cuando el valor de p asociado fue inferior a 0,05.

5. Conclusiones 

Los principales hallazgos de este estudio son que la plumbagina (i) suprime la síntesis de melanina inducida por -MSH al inhibir la actividad de la tirosinasa; (ii) no afecta la maquinaria transcripcional ligada a MITF ni las cascadas de transducción de señales, incluida la activación de AKT y ERK1/2 asociada con la melanogénesis; y (iii) no provoca toxicidad en queratinocitos normales (HaCaT) y células epiteliales del cristalino (B3) cuando su concentración es inferior a 5 µM. En conjunto, la plumbagina anula la síntesis de melanina inducida por -MSH al inhibir la actividad de la tirosinasa independientemente del eje transcripcional CREB-MITF. Estos resultados, por lo tanto, sugieren un plumbagin de producto natural prometedor y seguro para disminuir la hiperpigmentación al usarlo en el desarrollo de cosméticos para blanquear la piel.

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Expresiones de gratitud:Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Konkuk en 2016.
Contribuciones de autor:Ji-Hong Lim concibió y diseñó los experimentos; Taek-In Oh, Jeong-Mi Yun, Eun-Ji Park y Young-Seon Kim realizaron los experimentos; Ji-Hong Lim, Taek-In Oh y Yoon-Mi Lee analizaron los datos; Ji-Hong Lim y Yoon-Mi Lee escribieron el manuscrito.
Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

abreviaturas

-MSH hormona estimulante de los melanocitos alfa
tirosinasa TYR
L-DOPA L-3,4-dihidroxifenilalanina
MITF factor de transcripción asociado a microftalmía
Proteína 1 relacionada con la tirosinasa TYRP1
CREB cAMP proteína de unión al elemento de respuesta
PKA proteína quinasa A
ERK1/2 quinasa regulada por señal extracelular 1/2

Referencias

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