Posibles biomarcadores de lágrimas para el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson: un estudio piloto Ⅰ
Mar 02, 2023
Resumen: La enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa más común después de la enfermedad de Alzheimer. En este estudio, el perfil del proteoma lagrimal de pacientes con EP idiopática (iPD, n=24), portadores de la mutación E46K-SNCA (n=3) y control sano (CT, n {{4 }}) sujetos fueron analizados para identificar biomarcadores candidatos para el diagnóstico de la EP. Se llevó a cabo un estudio piloto observacional, prospectivo y de casos y controles, explorando las muestras de lágrimas de los participantes mediante cromatografía de nanolíquidos-espectrometría de masas (nLC-MS/MS) y evaluando su deterioro neurológico. Los datos proteómicos obtenidos están disponibles en ProteomeXchange con identificador 10.6019/PXD028811.
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Estos análisis llevaron a la identificación de 560 proteínas lagrimales, algunas de las cuales estaban desreguladas en pacientes con EP y que se han implicado en respuestas inmunitarias, inflamación, apoptosis, degradación de colágeno, síntesis de proteínas, defensa, transporte de lípidos y función lisosomal alterada. De estas proteínas, seis estaban relacionadas con procesos neurodegenerativos y mostraron una excelente capacidad para clasificar pacientes y controles. Estos hallazgos revelaron que ciertas proteínas estaban reguladas al alza en las lágrimas de los pacientes con EP, principalmente proteínas involucradas en la función lisosomal. Por lo tanto, en este estudio, las proteínas lagrimales se identificaron como implicadas en la neurodegeneración que puede estar relacionada con un fenotipo de enfermedad agresiva en pacientes con EP.
Palabras clave: biomarcadores; Enfermedad de Parkinson; película lagrimal; lisosoma
1. Introducción
La enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa más común después de la enfermedad de Alzheimer (EA), y se caracteriza por lentitud de movimiento (bradicinesia), aumento del tono muscular (rigidez), temblores y alteración del control postural. En la enfermedad de Parkinson confirmada patológicamente, hay una cantidad variable y depósito de alfa-sinucleína mal plegada (-syn) en forma de cuerpos de Lewy (LB) y neuritas de Lewy en el sistema nervioso central (SNC). Es probable que esta variabilidad en la acumulación de estas estructuras refleje la heterogeneidad clínica de esta enfermedad [1–3]. De hecho, varios trastornos clínicos se encuentran en el espectro de las enfermedades con cuerpos de Lewy (LBD), incluidos pacientes con EP idiopática (IPD) y genética y pacientes que sufren demencia con LB. Uno de los principales desafíos en el abordaje de las enfermedades neurodegenerativas es encontrar marcadores clínicos que permitan la clasificación temprana de los pacientes y ayuden a monitorear la progresión de la enfermedad.
Factores como el estrés oxidativo, la proteólisis y las concentraciones alteradas de ácidos grasos o fosfolípidos se han asociado con cambios estructurales en -syn, y las modificaciones postraduccionales también pueden alterar el tamaño, la estructura o la carga proteica de -syn [4]. Las mutaciones desreguladoras y las multiplicaciones en el gen -syn (SNCA) causan formas familiares autosómicas dominantes de EP [5]. Quizás la mutación más patogénica que se sabe que induce la EP es la mutación E46K en -syn (E46K-SNCA), que subyace a un grupo de LBD genéticas y agresivas con características clínicas y patológicas que recuerdan a la demencia con LB [6,7]. Aunque las mutaciones en -syn son raras, brindan una oportunidad única para identificar a los pacientes con EP y comprender mejor la progresión de estas patologías.
Se sabe que los pacientes con EP desarrollan alucinaciones, cambios en el movimiento de los ojos y los párpados y alteración de la composición de las lágrimas en cantidades reducidas [8,9]. Además del daño en la superficie ocular, estos pacientes pueden experimentar cambios en la acomodación, disminución de la agudeza visual, formación de escotomas (áreas donde su campo de visión está parcialmente disminuido o completamente degenerado) y adelgazamiento de las capas de la retina, particularmente debido a una reducción en el número de fibras nerviosas [10,11]. Las deficiencias en la neurotransmisión y el metabolismo de las monoaminas también influyen en los cambios patológicos del sistema visual de los pacientes con EP [12].
Estos cambios son bastante típicos ya que las monoaminas están involucradas en la transmisión de información visual en la retina [13]. Además, los pacientes con EP pueden experimentar alteraciones en la inervación de la parte anterior del ojo que finalmente pueden alterar la composición de las lágrimas. Muchos neurotransmisores y sustancias tróficas se secretan en las lágrimas y se originan en el humor acuoso o en los nervios que atraviesan la córnea [14].
Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a estas asociaciones aún no se han dilucidado por completo. Como la EP afecta varios sistemas no motores y nervios periféricos, la secreción lagrimal podría estar alterada en estos pacientes, y la composición de la proteína lagrimal podría presentar un perfil característico en estos pacientes que podría servir como biomarcador diagnóstico. En este sentido, el análisis de las proteínas lagrimales de pacientes con E46K-SNCA y iPD podría ayudar a identificar biomarcadores candidatos útiles para el diagnóstico y progresión de la EP.
Por ello, el presente estudio tuvo como objetivo analizar el perfil del proteoma lagrimal en pacientes con EPi y portadores de la mutación E46K-SNCA para encontrar un biomarcador que pudiera ayudar en el diagnóstico futuro de la EP, utilizando muestras no invasivas.
2. Materiales y métodos
2.1. cohorte de estudio
Diseñamos un estudio piloto observacional, prospectivo, de casos y controles en el que se inscribieron 24 pacientes con EPi, 3 portadores de la mutación E46K-SNCA y 27 sujetos sanos (TC). Esta investigación ha sido realizada por personal médico cualificado tras recibir la aprobación del Comité Ético de la OSI Ezkerralde-Enkaterri-Cruces CEIC E18/47. El estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con los principios de la Declaración de Helsinki sobre la investigación biomédica en seres humanos. Antes de la recogida de muestras, se obtuvo el consentimiento informado firmado de todos los sujetos después de haberles explicado la naturaleza y las posibles consecuencias del estudio. Los pacientes fueron reclutados en las Unidades de Servicio de Neurología y Oftalmología del Hospital Universitario de Cruces (Barakaldo, Bizkaia, España) en consultas externas, en base a los criterios de inclusión y exclusión acordados. Los pacientes con ENI cumplían los criterios del Banco de Cerebros del Reino Unido de Parkinson para el diagnóstico de la EP y no presentaban ninguna mutación conocida.
Los criterios de inclusión para los TC fueron ser mayores de 40 años, de cualquier sexo y sin antecedentes clínicos de ningún trastorno neurológico. Se incluyeron en el estudio personas con (o con antecedentes de) cualquier trastorno/afección sistémico u ocular. Los criterios de exclusión consistieron en cirugía ocular en los tres meses anteriores, medicación ocular crónica (p. ej., para el glaucoma), antecedentes de alergias, uso de cualquier medicación tópica (que no sean lágrimas artificiales) o medicación oral que contenga corticosteroides, atopia y pacientes con síndrome de Sjögren. síndrome.
Los usuarios de lentes de contacto también fueron excluidos para evitar posibles interferencias en la interpretación de los resultados. Las pruebas oculares preliminares y la toma de muestras se realizaron el mismo día, mientras que los pacientes con EP también fueron vistos en otro día por miembros del equipo de investigación expertos en trastornos del movimiento para evaluar las Escalas de Parkinson.
2.2. Examen Oftalmológico
El examen clínico oftalmológico incluyó la prueba de Schirmer I (SCH), que determina si el ojo produce suficientes lágrimas para mantenerlo húmedo. La prueba permite que el agua de las lágrimas viaje a lo largo de una tira reactiva de papel, y los valores normales son mayores o iguales a 10 mm de humedecimiento del papel después de 5 min. La inestabilidad de la película lagrimal se evaluó utilizando el tiempo de ruptura lagrimal (TBUT) con fluoresceína. TBUT es el tiempo que tarda en aparecer la primera mancha seca en la córnea después de un parpadeo completo. Un valor inferior a 10 s suele reflejar cierta inestabilidad de la película lagrimal. Se consideró criterio de exclusión cualquier enfermedad sistémica o cualquier otra condición/uso de medicamentos que pudiera interferir con la interpretación de los resultados.
2.3. Examinación neurológica
Un neurólogo experto en el campo de los trastornos del movimiento registró la edad de los pacientes con EP en el momento de la recolección de lágrimas, la duración de la enfermedad y su puntaje en la Escala de calificación de la enfermedad de Parkinson unificada (UPDRS) y la escala de Hoehn Yahr. Estas pruebas sirven como criterios de estratificación para seguir la progresión de la enfermedad. Se aseguró la confidencialidad de los datos de los pacientes mediante el uso del Biobanco Vasco.
2.4. Colección de muestras de lágrimas
Todas las muestras de lágrimas se recogieron utilizando tubos microcapilares de vidrio de 10 µl calibrados (BLAUBRAND intraMark, Wertheim, Alemania). Las muestras de lágrimas se obtuvieron del menisco lagrimal temporal inferior, minimizando la irritación de la superficie ocular o el margen del párpado, y sin instalación de anestesia. Las muestras de lágrimas se recogieron de ambos ojos de cada participante y se colocaron inmediatamente en tubos Eppendorf preenfriados. Tras la recogida de lágrimas, las muestras se almacenaron a −80 ◦C hasta su análisis.
2.5. Análisis de proteómica
Los análisis proteómicos se llevaron a cabo en el Servicio de Proteómica de CIC bioGUNE (Derio, Bizkaia, España), utilizando el protocolo Filter Aided Sample Preparation (FASP) [15] para el procesamiento y digestión de las muestras. Se añadió tripsina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) en una proporción de tripsina:proteína de 1:50, y la mezcla se incubó durante la noche a 37 ◦C, se secó en un RVC{{4} } Concentrador Speedvac (Christ, Viena, Austria). Los péptidos obtenidos se desalinizaron y se resuspendieron en ácido fórmico (FA) al 0,1 por ciento (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) utilizando puntas de etapa C18 (Millipore, St. Louis, MO, EE. UU.).
Las muestras se analizaron en un novedoso espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo de espectrometría de movilidad de iones atrapados híbrido (timsTOF Pro con PASEF, Bruker Daltonics, Bremen, Alemania), acoplado en línea a un cromatógrafo de líquidos nanoElute (Bruker, Coventry, Reino Unido). Este espectrómetro de masas aprovecha un nuevo modo de exploración denominado fragmentación en serie de acumulación paralela (PASEF), que multiplica la velocidad de secuenciación sin pérdida de sensibilidad, y se ha demostrado que proporciona una velocidad analítica y una sensibilidad excepcionales para los análisis proteómicos [16].
Las muestras (200 ng) se cargaron directamente en una columna analítica Bruker nano elute FIFTEEN C18 de 15 cm (Bruker, Coventry, Reino Unido) y se resolvieron a 400 nL/min. La columna se calentó a 50 ◦C en un horno. La identificación y cuantificación de proteínas se llevó a cabo utilizando el software PEAKS (Bioinformatics Solutions Inc., Waterloo, CA, EE. UU.) Las búsquedas se realizaron en una base de datos de entradas canónicas Uniprot/Swissprot humanas (sin considerar isoformas), con tolerancias de precursores y fragmentos de 20 ppm y 0,05 Da.
Se realizó una cuantificación de proteínas sin etiqueta basada en el área utilizando el módulo PEAKS Q disponible en el software PEAKS. Solo las proteínas identificadas con al menos dos péptidos a una tasa de descubrimiento falso (FDR) < 1 por ciento y presentes en al menos el 70 por ciento de las muestras de uno de los grupos experimentales bajo análisis se consideraron para análisis adicionales. Los datos se cargaron en la plataforma Perseus [17] y se procesaron posteriormente (transformación log2, imputación) antes de la aplicación de la prueba t de Student para el análisis diferencial de expresión de proteínas. Los datos de proteómica se resumen en el Archivo de materiales complementarios S1, y los datos de proteómica de espectrometría de masas se depositaron en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE [18], con los identificadores de conjuntos de datos PXD028811 y 10.6019/PXD028811.
2.6. Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando el paquete IBM SPSS Statistics para Windows, 23.0v (IBM-SPSS, Armonk, Nueva York, NY, EE. UU.). La normalidad de los datos continuos se evaluó con una prueba de Shapiro-Wilk. Los valores de p calculados determinan la probabilidad de que la asociación entre las proteínas en el conjunto de datos y una vía canónica dada, una red funcional o un regulador corriente arriba se explique solo por casualidad, según la prueba exacta de Fisher, con un valor de p < {{5 }}.05 siendo considerado significativo.
Se utilizaron regresiones logísticas univariadas para identificar las características estadísticamente significativas asociadas con la discriminación de pacientes con EP. Después de la selección de variables, se utilizaron regresiones logísticas multivariadas para construir un modelo de discriminación de PD y para identificar las variables clínicas y proteómicas relevantes para la identificación de PD. Los modelos logísticos permiten estimar la relación entre una variable dependiente discreta y un conjunto de variables independientes continuas o discretas. Los modelos permiten la clasificación de pacientes con o sin EP, calculando la probabilidad de pertenecer a cada grupo. El valor p de cada covariable describe la significancia estadística de la asociación entre la respuesta y cada término incluido en el modelo.
para más información: Ali.ma@wecistanche.com
