Preparación y aplicación de glucósido de Cistanche por método de hidrólisis enzimática
May 26, 2023
Abstracto: Exploración de la preparación de glucósido de Cistanche por hidrólisis enzimática y su investigación de aplicación. Utilizando la tasa de extracción del glucósido de Cistanche como indicador de evaluación, se utilizó el método de hidrólisis enzimática para extraer el glucósido de Cistanche, y se determinó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Al construir un modelo de ratón envejecido, los glucósidos de Cistanche deserticola preparados por hidrólisis enzimática se aplicaron a los ratones modelo envejecidos y se observaron las capacidades de aprendizaje y memoria de los ratones modelo envejecidos, así como la detección de los niveles de oxidación del tejido cerebral. Los resultados mostraron que las condiciones óptimas para el experimento ortogonal de hidrólisis enzimática fueron: cuando la proporción de material a líquido fue de 1:10, los tiempos de extracción fueron 3 veces, la temperatura de extracción fue de 80 grados y el tiempo de extracción fue de 1 minuto, la la tasa de extracción de glucósidos de Cistanche deserticola fue la más alta. En comparación con el grupo de control, el efecto del glucósido de Cistanche en ratones modelo envejecidos mejoró significativamente sus capacidades de aprendizaje y memoria (P<0.05); After treatment with cistanche glycoside, the content of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in brain tissue of aging model mice increased significantly (P<0.05), while the content of malondialdehyde (MDA) decreased significantly (P<0.05). In this study, the preparation method of Cistanche glycosides was optimized and the anti-aging ability of Cistanche glycosides was tested. This study laid a theoretical and practical foundation for the further development and clinical application of Cistanche glycosides in the future.
El glucósido de feniletanol es el principal componente activo de Cistanche deserticola
Palabras clave: método de hidrólisis enzimática; glucósido de Cistanche; ratones modelo de envejecimiento; antioxidante; investigación de aplicaciones
1 parte experimental
1.1 Principales materiales, reactivos e instrumentos
Ratones ICR macho sanos, Beijing Huizhi Heyuan Biotechnology Co., Ltd; Cistanche glucósido, Anyang Yishoutang Pharmaceutical Chain Co., Ltd; Estándar de glucósido de Cistanche (pureza mayor o igual al 99.0 por ciento), Wuhan Huashun Biotechnology Co., Ltd; Inner Mongolia Beiqi, Shanxi Beiqi, Inner Mongolia Cistanche glucósido de grado especial, Inner Mongolia Cistanche glucósido de primera clase, Inner Mongolia Cistanche glucósido de segunda clase, Shanxi Heipi Qi grado AA, Shanxi Heipi Qi A grado, Gansu Cistanche glucósido, todos comprados en farmacias locales; Metanol, etanol, alcohol analítico, Nanjing Datang Chemical Co., Ltd; Kits SOD, MDA y CAT, Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.
DFY400 Amoladora oscilante de alta velocidad para medicina tradicional china, Zhejiang Wenling Dade Traditional Chinese Medicine Machinery Co., Ltd; Bomba de vacío de agua circulante SHZ-D, Gongyi Yuhua Instrument Co., Ltd; 101-1Y horno de secado por infrarrojos, fábrica de instrumentos de laboratorio Lantian de Hangzhou; Espectrofotómetro ultravioleta-visible U2001, Hitachi, Japón; Cromatografía líquida de alta resolución Aglient 1100 LC, Agilent Technologies, EE. UU.; 6511 batidoras eléctricas, Shanghai Specimen Model Factory; Medidor de acidez PHS-3C, Shanghai Ridao Scientific Instrument Co., Ltd; Máquina de liofilización DF-500, Baokun Vacuum Technology Co., Ltd.
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1.2 Métodos experimentales
1. 2. 1. Tratamiento y extracción de muestras de glucósido de cistanche
Utilizando la tasa de extracción de glucósidos de Cistanche como índice de evaluación, se utilizó el diseño experimental ortogonal L9 (34) para la investigación. El diseño del esquema específico se muestra en la Tabla 1.
Pestaña. 1 Tabla de nivel de factor
Pese con precisión 100,0 g de muestra de glucósido de Cistanche, séquelo en un horno de secado, tritúrelo, páselo por un tamiz de malla 60 y extraiga el glucósido de Cistanche del hidrolizado autoenzimático de Scutellaria baicalensis de acuerdo con el esquema de diseño experimental ortogonal en la Tabla 1 [13,14].
1. 2. 2. Determinación del contenido de glucósidos de Cistanche
Utilice un espectrofotómetro UV-visible para determinar el contenido de glucósido de Cistanche. Mida con precisión 0.5 mL de extracto de glucósido de Cistanche y mézclelo con 4.5 mL de agua ultrapura. Agregue 0.5 ml de solución de nitrito de sodio al 5 por ciento y déjelo reposar durante 5 minutos. Luego, agregue 0.5 ml de solución de nitrato de aluminio al 10 por ciento. Mezclar suavemente y dejar reposar durante 6 minutos. Luego, agregue 4 mL de solución de hidróxido de sodio 1,0 mol/L. Mezclar suavemente y dejar reposar durante 15 minutos. Mida a una longitud de onda de 510 nm entre la luz ultravioleta y la visible.
Experimento Cistanche deserticola
1. 2. 3 Análisis HPLC
Con columna Kromasil C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μ m) Temperatura ambiente, volumen de inyección 20 μ L. Caudal 1 ml/min, agua de fase A, acetonitrilo de fase B. Procedimiento de elución: 0-5 minutos, 5 por ciento de fase B, 95 por ciento de fase A; 5-8 minutos, 5 por ciento -8 por ciento fase B, 95 por ciento -92 por ciento fase A; 8-15 minutos, 20 por ciento fase B, 80 por ciento fase A; 15~18 minutos, 20 por ciento ~30 por ciento fase B, 80 por ciento ~70 por ciento fase A; 18-35 minutos, 30 por ciento -45 por ciento fase B, 70 por ciento -55 por ciento fase A; 35~38 minutos, 45 % ~80 % fase B, 55 % ~20 % fase A. La longitud de onda de detección es de 254 nm.
1. 2. 4 Agrupamiento y administración de animales
Se seleccionaron 72 ratones ICR macho sanos y se dividieron aleatoriamente en 4 grupos, con 18 ratones en cada grupo: grupo de control (grupo Con), grupo modelo (grupo Mod), grupo de control positivo (grupo PC) y grupo de glucósidos de cistanche (grupo HQ). ). Los ratones del grupo de control recibieron administración oral de agua bidestilada e inyección subcutánea de solución salina isotónica; A los ratones del grupo modelo se les administró por vía oral agua bidestilada y se les inyectó por vía hipodérmica 400 mg/kg de D-neneneba galactosa; En el grupo de control positivo, se administraron por vía oral 800 mg/kg de piracetam y se inyectaron por vía subcutánea 400 mg/kg de D-neneneba galactosa; A los ratones del grupo de glucósidos de cistanche se les administraron 400 mg/kg de astragalosido (la dosis se determinó en el experimento preliminar; Shanxi Beiqi) por vía oral, y se inyectaron 400 mg/kg de D-neneneba galactosa por vía subcutánea. A todos los ratones experimentales se les administró por vía oral y subcutánea durante 10 semanas consecutivas. Pese cada ratón cada semana y controle de cerca la condición física de cada grupo de ratones. En la novena semana, después de la administración oral y la inyección subcutánea durante 30 minutos, cada grupo de ratones se sometió a pruebas de salto de plataforma y evitación de la oscuridad. En la décima semana, se realizó la prueba del laberinto acuático de Morris en cada grupo de ratones. En la semana 11, se tomó el tejido cerebral de cada grupo de ratones para determinar el contenido de superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y malondialdehído (MDA) en el tejido cerebral.
1. 2. 5 Medición de la capacidad de aprendizaje y memoria en ratones envejecidos
1) Experimento de evitación
Antes del experimento, los ratones se colocaron en el instrumento y se aclimataron durante 3 minutos. Después de adaptarse por completo al instrumento y al entorno oscuros, los ratones se volvieron a colocar en la jaula de reproducción. A continuación, los ratones fueron sometidos a una descarga eléctrica continua mientras estaban de pie en el suelo. Después de que ocurrió la descarga, los ratones huyeron instintivamente del suelo a la plataforma y todo el proceso de entrenamiento duró 5 minutos. Una vez finalizado el experimento, se contó el número total de veces que los ratones recibieron descargas eléctricas, que es el número de errores de evitación de la oscuridad.
Cistanche viva del desierto
2) Experimento de plataforma de salto
El dispositivo experimental de la plataforma de salto es de 45 cm × 35 cm × Una caja de vidrio orgánico de 25 cm con una partición en el interior, y una almohadilla de goma con un diámetro de 9,5 cm y una altura de 4,5 cm se coloca en el lado izquierdo de la izquierda y la derecha rejillas El fondo de la caja está cubierto con rejillas de cobre como electrodos de estimulación. Cuando se somete a una estimulación con descargas eléctricas, el ratón escapará a una plataforma segura y luego saltará de la plataforma. Cuando los pies del ratón entran en contacto con la red eléctrica y reciben una descarga eléctrica, es una respuesta de error. Registre la cantidad de errores y la latencia del mouse en 3 minutos. Después de 24 horas, la prueba midió nuevamente las habilidades de aprendizaje y memoria de los ratones en función de la cantidad de errores y la latencia.
3) Experimento del laberinto de agua
Antes del experimento, los ratones se colocaron en un laberinto de agua y se les permitió nadar libremente durante 2 minutos para adaptarse al entorno.
Experimento de posicionamiento de navegación [15]: Registre el momento en que los ratones encuentran la plataforma.
Experimento de exploración espacial [16]: registra los tiempos de los ratones que cruzan la plataforma.
1. 2. 6 Determinación del contenido de antioxidantes en el tejido cerebral de 6 ratones envejecidos
Después de separar el tejido cerebral del ratón según métodos convencionales, se midió el contenido de SOD, MDA y CAT en el tejido cerebral de cada grupo de ratones según los pasos de operación de los kits SOD, MDA y CAT.
1.3 Estadísticas y análisis de datos
En este estudio, todos los datos se analizaron estadísticamente mediante hojas de cálculo de Excel y el software SPSS19.0, y las diferencias entre grupos se evaluaron mediante pruebas t pareadas. Cuando p<0.05, it indicates statistical significance; When P<0.01, it indicates significant statistical significance.
2 Resultados y Discusión
2.1 Experimento ortogonal
La Tabla 2 muestra los resultados del experimento ortogonal para los glucósidos de Cistanche. Puede verse en la Tabla 2 que el proceso de extracción óptimo es A3B1C2D3, con una temperatura de extracción de 80 grados, un tiempo de extracción de 1 minuto, una relación sólido-líquido de 1:10 y tres tiempos de extracción. Se logra la mayor tasa de extracción de glucósidos de Cistanche.
Pestaña. 2 Experimento ortogonal de glucósido de Cistanche
2.2 Determinación del contenido de glucósidos de Cistanche
La espectrofotometría UV visible se utilizó para detectar el extracto de 8 muestras de glucósidos de cistanche. Los resultados se muestran en la Figura 1, y existen diferencias significativas en el contenido de glucósido de cistanche entre diferentes regiones o variedades. Entre ellos, Shanxi Beiqi tiene el contenido más alto de glucósido de cistanche, mientras que Shanxi Heipi Qi tiene el contenido más bajo de glucósido de cistanche de grado AA.
Fig. 1 Determinación de diferentes tipos de glucósidos de Cistanche
2.3 Detección por HPLC de glucósidos de Cistanche
De acuerdo con las condiciones cromatográficas determinadas en la Sección 1.2.3, el diagrama de HPLC de los glucósidos de Cistanche se muestra en la Figura 2. El tiempo de retención de los glucósidos de Cistanche es de 10,64 minutos y la concentración de masa es de 1.{{ 7}}.0 μ G/mL, con buena linealidad y un valor R de 0.999 8.
Fig. 2 Diagrama de HPLC del glucósido de Cistanche
2.4 Precisión y estabilidad
Tome el mismo lote de solución de prueba de glucósido de Cistanche e inyéctelo 6 veces consecutivas para determinar el área máxima del glucósido de Cistanche. Los resultados mostraron que la precisión RSD de los glucósidos de Cistanche fue inferior al 2,5 por ciento (n=6), lo que indica una buena precisión de los glucósidos de Cistanche.
Tome el mismo lote de solución de prueba de glucósido de Cistanche y mida el área del pico del glucósido de Cistanche a las {{0}}, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 y 24 horas respectivamente. Los resultados mostraron que la RSD de la estabilidad del glucósido Cistanche fue inferior al 2,0 por ciento (n=6), lo que indica que el glucósido Cistanche tenía una buena estabilidad en 24 horas.
2. 5 Efecto del glucósido de Cistanche sobre el peso corporal de ratones modelo que envejecen
La referencia [17-19] encontró que la dosis de glucósidos de Cistanche utilizada en este estudio no produjo toxicidad sistémica en ratones. Como se muestra en la Figura 3, el peso de todos los grupos de ratones aumentó antes de la sexta semana. En comparación con el grupo de control, el peso de los ratones del grupo modelo disminuyó significativamente durante el mismo período (P<0.01), while the weight of the positive control group and astragalus group mice slightly decreased. After the 6th week, the weight of the control group mice continued to increase, while the weight of the model group mice no longer increased. The positive control group and the Cistanche glycoside group slightly increased.
Fig. 3 El efecto del glucósido de Cistanche sobre el peso corporal de los ratones modelo que envejecen
2.6 Resultados del experimento de comportamiento
2. 6. Observación del efecto de Cistanche Cistanche Glycoside en ratones modelo envejecidos a través del experimento de evitación de la oscuridad
Como se muestra en la Figura 4A, el período de latencia de los ratones en cada grupo se prolongó el segundo día en comparación con el primer día. En comparación con el grupo de control, el tiempo de latencia de los ratones del grupo modelo se redujo significativamente (P<0.05); Compared with the model group, the latency time of mice in the positive control group and the Cistanche glycoside group was significantly increased (P<0.05). As shown in Figure 4B, the number of errors in each group of mice decreased on the second day compared to the first day. Compared with the control group, the number of errors in the model group mice significantly increased (P<0.05); Compared with the model group, the positive control group and the Cistanche glycoside group significantly reduced the number of errors in mice (P<0.05).
2. 6. Observación del efecto de Cistanche Cistanche Glycoside en ratones modelo envejecidos a través de un experimento de plataforma de dos pasos
Como se muestra en la Figura 5, el tiempo de latencia de la plataforma de salto en cada grupo de ratones se prolongó el segundo día en comparación con el primer día. En comparación con el grupo de control, el tiempo de la etapa de salto de los ratones del grupo modelo se redujo significativamente (P<0.05); Compared with the model group, the latency time of the jumping platform in the positive control group and the Cistanche glycoside group of mice was significantly increased (P<0.05). As shown in Figure 4B, the number of errors in each group of mice decreased on the second day compared to the first day. Compared with the control group, the number of errors in the model group mice significantly increased (P<0.05); Compared with the model group, the positive control group and the Cistanche glycoside group significantly reduced the number of errors in mice (P<0.05).
En comparación con el grupo de control, P<0.05; Compared with the control group, P<0.01; Compared with the model group, the '#' is P<0.05; Compared with the model group, P<0.01, the same below
Fig. 4 Experimentos de evitación de la oscuridad para observar el efecto del glucósido de Cistanche en ratones modelo que envejecen. tiempo de latencia （A）; Número de errores (B)
Fig. 5 El efecto del glucósido de Cistanche en el modelo de ratones envejecido observado mediante el experimento de salto de plataforma. tiempo de latencia （A）; Número de errores
2. 6. 3 Experimento del laberinto acuático de Morris para observar el efecto de los glucósidos de Cistanche en ratones modelo que envejecen
Como se muestra en la Figura 6, a medida que aumenta el número de días de entrenamiento, el tiempo que tarda cada grupo de ratones en encontrar la plataforma disminuye gradualmente. En comparación con el grupo de control, el tiempo para que los ratones del grupo modelo encontraran la plataforma aumentó significativamente (P<0.05), while the time for the positive control group and the Cistanche glycoside group mice to find the platform slightly increased.
En comparación con el grupo de control, P<0.05
Fig. 6 El efecto del glucósido de Cistanche en el modelo de ratones envejecido observado mediante el experimento de navegación de posicionamiento
Como se muestra en la Figura 7, a medida que aumenta el número de días de entrenamiento, aumenta gradualmente el número de veces que cada grupo de ratones cruza la plataforma. En comparación con el grupo de control, el número de veces que los ratones del grupo modelo cruzaron la plataforma disminuyó significativamente (P<0.05), while the number of times the positive control group and the Cistanche glycoside group mice crossed the platform slightly decreased.
Fig. 7 El efecto del glucósido de Cistanche en el modelo de ratones envejecido observado por el experimento de exploración espacial
2. 7 Efecto de los glucósidos de Cistanche sobre los niveles de antioxidantes en el tejido cerebral de ratones modelo que envejecen
Como se muestra en la Figura 8, en comparación con el grupo de control, las actividades de las enzimas SOD y CAT en el tejido cerebral de los ratones del grupo modelo se redujeron significativamente (P<0.05). The SOD and CAT enzyme activities in the brain tissue of the positive control group and the Cistanche glycoside group mice were slightly increased, while the MDA content in the brain tissue of the model group mice was significantly increased (P<0.05). The MDA content in the brain tissue of the positive control group and the Cistanche glycoside group mice was slightly reduced.
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3 Conclusión
Este estudio utilizó la tasa de extracción del glucósido de Cistanche como indicador de evaluación y extrajo el glucósido de Cistanche mediante el método de hidrólisis enzimática. El contenido de glucósido de Cistanche se determinó por HPLC. Se extrajeron las siguientes conclusiones:
1) Cuando la proporción de material a líquido es 1:1{{10}}, la frecuencia de extracción es 3 veces, la temperatura de extracción es de 80 grados y el reactivo de extracción es de 1 minuto , la tasa de extracción de glucósidos de Cistanche es la más alta. El contenido de glucósido de cistanche en 8 variedades diferentes se determinó utilizando un espectrofotómetro UV visible. Los resultados mostraron diferencias significativas en el contenido de glucósidos de cistanche entre diferentes regiones o variedades. Entre ellos, Shanxi Beiqi tenía el contenido más alto de glucósido de cistanche, mientras que Shanxi Heipi Qi tenía el contenido más bajo de glucósido de cistanche en el grado AA. Con el fin de establecer aún más un sistema de separación y purificación para el glucósido de Cistanche, se estableció una huella dactilar del glucósido de Cistanche mediante HPLC. Los resultados mostraron que el tiempo de retención del glucósido de Cistanche fue de 10,64 minutos, la concentración de masa fue de 1,0~40,0 μ G/mL, con buena linealidad y un valor R de 0.999 8, y el método de HPLC tiene buena estabilidad y precisión.
2) Efecto del glucósido de Cistanche deserticola preparado por hidrólisis enzimática en ratones modelo de envejecimiento, observar las capacidades de aprendizaje y memoria de ratones modelo de edad y detectar los niveles de oxidación del tejido cerebral. Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo de control, los glucósidos de Cistanche mejoraron significativamente las capacidades de aprendizaje y memoria de los ratones modelo de edad después del tratamiento (P<0.05); Compared with the control group, the activity of SOD and CAT enzymes in the brain tissue of aging model mice significantly increased (P<0.05) after treatment with Cistanche glycosides, while the content of MDA significantly decreased (P<0.05).
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