El aprendizaje previo del miedo permite la rápida asimilación de nuevos recuerdos de miedo directamente en las redes corticales, parte 3

Diseño experimental

La reproducibilidad de los datos se evaluó con diferentes réplicas (Tabla S1). Los primeros experimentos de inactivación de CNQX en Te2 (Fig. 1A-1C) se realizaron en un mayor número de réplicas porque fueron los primeros experimentos que realizamos y sirvieron para probar la hipótesis principal de nuestro estudio. Los animales fueron asignados a priori a diferentes grupos de comportamiento de manera equilibrada en peso. Se asignaron aleatoriamente animales machos de la misma cría a cada grupo experimental. Primero abordamos la hipótesis principal de nuestro estudio, es decir, la inactivación cortical puede afectar de manera diferente la consolidación de un nuevo recuerdo de miedo en ratas experimentalmente ingenuas y en animales que habían aprendido un evento de miedo previo.

Los animales machos tienen recuerdos extremadamente fuertes porque tienen un instinto de supervivencia y un deseo de reproducirse más fuertes. Los animales que sobreviven en la naturaleza necesitan recordar mucha información geográfica, tipos de alimentos, huellas de depredadores y la ubicación de los miembros del grupo para adaptarse mejor al medio ambiente y proteger la vida.

Por ejemplo, los leones machos necesitan recordar el estado de todo el territorio, las relaciones de membresía y la ubicación de los competidores para proteger el territorio y su estado. Las cebras macho necesitan recordar la ubicación de las fuentes de agua y alimentos en los pastizales para sobrevivir y reproducirse. Una vez, una empresa de refrescos publicó un anuncio que mostraba que un oso polar macho podía recordar a un buzo y su olor único para poder identificarlo la próxima vez que lo vieran.

Por lo tanto, los animales machos necesitan tener una fuerte memoria en términos de proteger su territorio, proporcionar suficiente alimento y reproducir descendencia. Esto también los convierte en temas importantes en la investigación en humanos, por ejemplo, para explorar enfermedades como el deterioro de la memoria y la enfermedad de Alzheimer.

En el mundo humano también podemos inspirarnos en la memoria de los animales machos. La exposición continua a cosas nuevas, el aprendizaje y el pensamiento continuos pueden mejorar nuestra memoria y adaptabilidad, y mejorar nuestro nivel de vida y nuestra eficiencia laboral. Por lo tanto, aprendamos de los animales machos, sigamos acumulando conocimientos y experiencia, tengamos fuertes instintos de supervivencia y deseos reproductivos y creemos un futuro mejor. Se puede ver que necesitamos mejorar nuestra memoria. Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria porque Cistanche deserticola es un material medicinal tradicional chino con muchos efectos únicos, uno de los cuales es mejorar la memoria. La eficacia de la carne picada proviene de los diversos ingredientes activos que contiene, incluidos ácidos, polisacáridos, flavonoides, etc. Estos ingredientes pueden promover la salud del cerebro de diversas maneras.

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En el caso de diferencias estadísticas entre estos grupos, eventualmente realizamos grupos de control adicionales mediante la inyección de solución salina. Se aplicó un enfoque similar a los experimentos optogenéticos, en los que el grupo de control con AAV se realizó sólo después de que se detectaran diferencias estadísticas entre ratas ingenuas y previamente entrenadas. Estos programas experimentales nos permitieron evitar grupos de control innecesarios y el uso de animales innecesarios, una cuestión clave en la legislación europea e italiana sobre experimentación animal (principio de las 3 R).

Procedimientos conductuales

Todos los experimentos se realizaron durante la fase de luz del día (de 8 a. m. a 4 p. m.). Los animales fueron transportados individualmente desde las instalaciones a las salas experimentales dentro de diferentes pequeños cubos transparentes dependiendo de las demandas experimentales.

Entrenamiento auditivo: Primera sesión conductual. Animales auditivos condicionados por el miedo (CS1-CS2). En este grupo, las ratas fueron sacadas con cuidado de su jaula y llevadas desde la habitación a la habitación insonorizada. Una vez allí, los animales se colocaron dentro del aparato de acondicionamiento que consistía en una jaula negra rectangular (35 × 40 cm) equipada con una rejilla de varillas de acero inoxidable (1 cm de diámetro, espaciadas 1,5 cm entre sí) conectadas a una instalación de administración de descargas.

Las ratas se dejaron tranquilas durante 1 minuto. Después de este tiempo, se administraron 7 estímulos condicionados (EC) consistentes en un tono puro de 15 kHz de frecuencia (15 s de duración cada uno, 80 dB, intervalo de prueba de 36 s). El último s de cada tono se combinó con una ecografía dolorosa (0,5 mA, 1 s). Al final de la sesión de acondicionamiento, las ratas fueron devueltas a su jaula.

Animales que sólo reciben shock (shock-CS2). En este grupo, las ratas fueron colocadas de manera similar dentro del mismo aparato de acondicionamiento. Inmediatamente después, cada rata fue sometida a 7-descargas en las patas (1 s, 0.5 mA) una inmediatamente después de la otra. Al final de la estimulación, los animales fueron devueltos a su jaula de origen. El tiempo de permanencia en la jaula de acondicionamiento fue inferior a 9 segundos. Estudios anteriores demostraron que este procedimiento permite evitar procesos asociativos entre estímulos dolorosos y estímulos sensoriales [29,30].

Animales condicionados por el miedo al olor (olor-CS2). En este grupo, las ratas fueron colocadas dentro de la misma jaula negra rectangular empleada en los grupos experimentales anteriores y conectadas a una instalación de administración de descargas. Las ratas se dejaron tranquilas durante 2 minutos. Después de este tiempo, se administraron 7 CS que consistían en olores de vainilla (10 s de duración cada uno, intervalo de prueba de 24 s). El último s de cada olor se combinó con una ecografía dolorosa (0,5 mA, 1 s). El módulo de acondicionamiento se colocó cerca de una fuente de ventilación para evitar la persistencia de los estímulos entregados después de su compensación. La jaula se aseguró con una rejilla superior. Los olores se presentaron utilizando un olfatómetro de dilución por flujo. Se dirigió aire limpio (1,5 l/min) a una válvula solenoide que, cuando se operó, pasó el aire a una botella de 15 ml que contenía 10 ml de olor a vainilla.

Animales de solo tono (Tone-CS2). Las ratas de este grupo se colocaron dentro de la misma jaula negra y se les presentó el tono de 15-kHz (7 estímulos, 15 s de duración, 36 s ITI) administrado en ausencia de los EE. UU.

Animales preexpuestos (Tone-CS1-CS2). Las ratas se colocaron dentro de la jaula de acondicionamiento y, 1 minuto después, se les presentó 20 veces el tono 15-kHz solo, y 24 h después, el mismo tono se emparejó con EE. UU. convirtiéndose en el CS1.

Animales condicionados por el miedo al ruido blanco (WN-CS2). En este grupo, las ratas se colocaron dentro de la jaula negra rectangular y se dejaron tranquilas durante 1 minuto. Después de este tiempo, se administraron 7 CS que consistían en un WN (15 s de duración cada uno, 75 dB, 36 s de intervalo entre pruebas). El último s de cada tono se combinó con una ecografía dolorosa (0.5 mA, 1 s). Al final de la sesión de acondicionamiento, las ratas fueron devueltas a su jaula.

Aprendizaje auditivo del miedo: segundo entrenamiento conductual. Dos semanas después de los procedimientos descritos en el párrafo anterior, los animales fueron entrenados en otra tarea diferente de acondicionamiento del miedo auditivo. Las ratas se colocaron en una caja desolladora estándar, como en nuestro trabajo anterior [10], y se dejaron en reposo durante 2 minutos. Después de este tiempo, se entregaron 7 CS que consistían en tonos puros de 3 kHz de frecuencia (8 s de duración cada uno, 80 dB, 22 s de intervalo entre pruebas). El último s de cada tono se combinó con una ecografía dolorosa (0,5 mA, 1 s). Al final de la sesión de acondicionamiento, las ratas fueron devueltas a su jaula.

Miedo a la retención de la memoria. La retención de la memoria auditiva del miedo adquirida recientemente en el CS2 (3 kHz) se probó 4 días después. Para los experimentos de optogenética, la prueba de memoria reciente se realizó con láser 24 h después del aprendizaje CS2-US en analogía con el intervalo de tiempo en el que realizamos la inactivación cortical mediante la administración del CNQX (es decir, 24 h después capacitación). Se habituó a las ratas a un aparato diferente al utilizado para el condicionamiento y se las colocó en una habitación diferente para evitar una conducta de miedo condicionada a señales contextuales [10,62].

El nuevo aparato consistía en una jaula de plástico transparente con un lado pintado de negro encerrada dentro de una caja atenuadora de sonido equipada con un extractor de aire, que eliminaba el aire oloroso del recinto y proporcionaba un ruido de fondo de 60 dB. A los animales se les permitió explorar la jaula durante 5 minutos al día durante la sesión de habituación. El día de la prueba de retención de la memoria del miedo, después de 2 minutos de exploración libre, administramos 4 CS2 de 3 kHz (8 s—22 ITI) sin seguido de ninguna ecografía.

Si la demanda experimental lo requería, se probó en ratas la retención de la memoria remota del miedo, adquirida 2 semanas antes de la segunda prueba de condicionamiento auditivo del miedo. Con este objetivo, 7 días después de la prueba de retención de la memoria del miedo con el tono de 3-kHz, se colocó a los animales en un entorno nuevo (una jaula con rayas blancas y negras) y luego se les presentó el tono de 15-kHz. Se presentaron cuatro tonos a intervalos de 36 segundos.

Entrenamiento contextual: Primera sesión conductual. Grupo de condicionamiento contextual del miedo (CtxA-CtxB). En este grupo, las ratas fueron sacadas con cuidado de su jaula, colocadas en un cubo y transportadas desde la sala de alojamiento a la habitación insonorizada. Una vez allí, los animales se colocaron dentro del aparato de acondicionamiento que consistía en la jaula negra rectangular antes mencionada, equipada con una rejilla de varillas de acero inoxidable conectada a una instalación de administración de descargas. Las ratas se dejaron tranquilas durante 1 minuto. Después de este tiempo, se administraron 5 US (0.5 mA, 1 s) con intervalos de tiempo de 51 s. Al final de la sesión, los animales fueron devueltos a su jaula de origen.

Grupo de sólo descarga (shock-CtxB). Las ratas, una vez colocadas dentro del aparato de acondicionamiento, recibieron inmediatamente 5-descargas en las patas (1 s, 0.5 mA), una inmediatamente después de la otra. El tiempo de permanencia en la jaula de acondicionamiento fue inferior a 7 segundos. Estudios anteriores demostraron que este procedimiento permite evitar procesos asociativos entre estímulos dolorosos y estímulos sensoriales [29,30].

Grupo de sólo descarga (shock-CtxB). Las ratas, una vez colocadas dentro del aparato de acondicionamiento, recibieron inmediatamente 5-descargas en las patas (1 s, 0.5 mA), una inmediatamente después de la otra. El tiempo de permanencia en la jaula de acondicionamiento fue inferior a 7 segundos. Estudios anteriores demostraron que este procedimiento permite evitar procesos asociativos entre estímulos dolorosos y estímulos sensoriales [29,30].

Nuevo condicionamiento contextual del miedo y retención reciente de la memoria del miedo. Dos semanas después de los procedimientos descritos en el párrafo anterior, todos los grupos fueron entrenados para asociar un nuevo entorno contextual (el módulo de la caja Skinner, colocado en una habitación diferente) con una ecografía dolorosa (0.5 mA, 1 s) . Cada animal se colocó dentro de la nueva cámara y se dejó tranquilo durante 2 minutos. Luego, fue expuesto a 5 US separados por intervalos de 30 s.

La retención de la memoria contextual del miedo se probó 4 días después del procedimiento de condicionamiento del miedo colocando a las ratas nuevamente en la cámara de la caja Skinner durante 3 minutos. Para los experimentos de optogenética, la prueba de memoria reciente se realizó con láser 24 h después del aprendizaje CtxB-US en analogía al intervalo de tiempo en el que realizamos la inactivación cortical mediante la administración del CNQX (es decir, 24 h después del entrenamiento). Si la demanda experimental lo requería, se probó en ratas la retención de la memoria de miedo remoto colocando a los animales en el contexto emparejados con los EE. UU. 2 semanas antes de la nueva asociación.

Los animales fueron transportados en 2 cubos diferentes a las cámaras de acondicionamiento según los diferentes procedimientos contextuales.

Medida de congelación. En todos los procedimientos experimentales, la evaluación de la retención de la memoria del miedo se determinó como una respuesta de congelación [10], analizada como la ausencia total de movilidad somática excepto los movimientos respiratorios. Para cada animal, 2 observadores independientes que no conocían los grupos de animales midieron fuera de línea la cantidad de tiempo (en segundos) transcurrido en congelación.

Procedimientos quirúrgicos

Para administrar las sustancias seleccionadas en los sitios objetivo, las ratas fueron anestesiadas con isoflurano: la inducción se realizó al 4% [vol/vol] en 2 L/min de aire medicinal y se extendió a una exposición continua al 2% [vol/vol]). cuando las ratas fueron montadas en el aparato estereotáxico.

Se hizo una incisión en el cráneo y se perforaron pequeños orificios para permitir la penetración de una aguja de infusión de calibre 28-. Se utilizó una jeringa 10-ul Hamilton montada en una bomba de infusión para administrar sustancias. Después de las infusiones, la aguja se dejó colocada durante 3 minutos más. Luego se cerró la incisión con clips de acero inoxidable para heridas y se le administró al animal una inyección subcutánea del analgésico/antiinflamatorio ketoprofeno (2 mg/kg de peso corporal), y se mantuvo al animal caliente y bajo observación hasta que se recuperó de la anestesia.

Como en estudios anteriores [10,32-34], la canulación de los animales fue innecesaria y los compuestos activos se administraron directamente por vía estereotáxica. Este procedimiento es ventajoso porque se evita el trauma quirúrgico inherente al procedimiento de canulación permanente, restringiendo así el trauma a la penetración de una sola aguja [10,32–34]. De hecho, la anestesia general no afecta significativamente a la consolidación de la memoria [10,32–34]. Para garantizar que el momento de la administración de los compuestos relacionados con la prueba de aprendizaje fuera exacto, de modo que las ratas recibieran los compuestos seleccionados aproximadamente 1 hora y aproximadamente 1 día después del entrenamiento, se indujo anestesia con isoflurano 5 minutos antes del momento de la inyección planificada, por ejemplo, a los 55 minutos. min en ratas tratadas 60 min después del entrenamiento y 23 h y 55 min en animales inyectados a las 24 h después del entrenamiento. Cada rata fue acondicionada y luego operada por separado. Los animales pertenecientes a los diferentes grupos conductuales fueron manipulados de forma intercalada.

El inhibidor selectivo de los receptores AMPA/kainato de glutamato CNQX ({{0}}Ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] se disolvió en solución salina estéril (NaCl, 0.9%) y se ajustó a pH 7,4 con HCl. El inhibidor de la síntesis de proteínas anisomicina (Merck, 125 ug/ul) se disolvió en HCl equimolar, se diluyó con solución salina estéril y se ajustó a pH 7,4 con NaOH. Se utilizó solución salina estéril (NaCl al 0,9%) como control del vehículo. Estas sustancias se inyectaron bilateralmente a una velocidad de 0,1 ul/min y un volumen de 0,5 ul por sitio en las siguientes coordenadas estereotáxicas tomadas del atlas de Paxinos y Watson [26], con el campo cortical Te2 referido al atlas de Zilles [25]:

Corteza auditiva secundaria (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Corteza cingulada anterior (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) PA: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

El volumen de inyección (0.5 ul por sitio) se seleccionó en base a estudios previos en los que se inyectaron compuestos activos en Te2 [10,34] y ACC [55,63] en ratas adultas.

Para inactivar el hipocampo dorsal, se inyectaron compuestos activos en un volumen de 0.6 ul por sitio en las siguientes coordenadas estereotáxicas:

Hipocampo dorsal: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Las lesiones irreversibles del hipocampo dorsal se indujeron mediante la administración de NMDA (Tocris, 18 ug/ul, disuelto en solución salina estéril, 0,4 ul por sitio) a razón de 0.1 ul/ min en puntos en las coordenadas antes mencionadas. Se utilizaron las mismas coordenadas para los controles a los que se les inyectó solución salina y para los animales operados de forma simulada.

Se inyectaron Retrobeads rojas (Lumafluor, dilución 1:2 en solución salina, 0.6 ul) en BLA de acuerdo con las siguientes coordenadas: AP: -2,8; L: ±5,4; VD: −8,3.

Al final de los experimentos, se verificaron histológicamente los recorridos de la aguja en el caso de las inyecciones de CNQX, anisomicina o solución salina o la extensión de las lesiones en el caso de las inyecciones de NMDA. Las ratas fueron anestesiadas profundamente y perfundidas intracardialmente con formaldehído al 4%. Sus cerebros fueron seccionados a 30 μm en un criostato. Se prepararon secciones en serie teñidas con Nissl utilizando el procedimiento convencional y las secciones se verificaron histológicamente bajo un microscopio magnificado a 2,5X.

Experimentos optogenéticos

Inyección de virus. El virus adenoasociado AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-cereza y el vector de control AAV5:CaMKII -cereza se obtuvieron del Vector Core de la Universidad de Carolina del Norte (Chapel Hill, Carolina del Norte, Estados Unidos de América). La frase Viraltiter fue 5:8. El título viral fue 5,8 × 10^12 vg/ml para ambos virus. El uso del promotor CaMKII permite la expresión transgénica favoreciendo a las neuronas piramidales. Los virus se alojaron en un congelador de -80˚C. Las infusiones virales dirigidas al Te2 o al ACC se realizaron en las coordenadas estereotáxicas anteriores en volúmenes de 0,5 ul para cada orificio. El virus se inyectó a una velocidad de 0,1 ul/min y la aguja se dejó en su lugar durante 5 minutos más. Las inyecciones virales se realizaron 4 semanas antes de los experimentos de optogenética.

Iluminación.

Las fibras ópticas (Plexon, núcleo de 200/230 μm; 10 mm de longitud) se implantaron bilateralmente en el BLA (AP=−2,8, L=± 5,4, V=−8,2 mm de bregma). La inhibición optogenética de las proyecciones de Te2 a BLA o de las proyecciones de ACC a BLA se obtuvo utilizando el sistema de estimulación optogenética PlexBright acoplado a un diodo láser (Laserglow Technologies). La luz amarilla (589 nm) se genera y pasa a través de una fibra óptica. La densidad de potencia estimada en la punta de la fibra óptica fue de 10 a 15 mW para la iluminación de los sitios de proyección. Durante la retención de la memoria de miedo, la emisión de luz se inició 4 s antes del inicio del tono, persistió durante todo el tono y se detuvo 4 s después de la compensación del tono. Los animales pertenecientes a grupos de condicionamiento de miedo contextual recibieron estimulación luminosa durante toda la exploración del contexto (3 min). Las ratas se familiarizaron con el cable de conexión durante 2 días antes de la prueba de retención de memoria.

Inmunohistoquímica. Al finalizar los experimentos de optogenética, las ratas fueron anestesiadas profundamente y perfundidas por vía intracardíaca con PAF al 4% para examinar la difusión del virus. Los cerebros se diseccionaron, se almacenaron durante la noche a 4ºC y finalmente se transfirieron a sacarosa al 30%. Se cortaron secciones coronales (30 μm) en un criostato y se recogieron en PBS. Las secciones flotantes se incubaron en una solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, se incubaron en anticuerpo monoclonal primario de ratón anti mCherry (dilución 1:500, Abcam) en la solución de bloqueo durante la noche a temperatura ambiente. Posteriormente, las secciones se lavaron con PBS y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo anti-ratón fluorescente secundario AlexaFluor-568 (1:600, Invitrogen) diluido en PBS. Las secciones se lavaron en PBS, se montaron con medios de montaje que contenían DAPI (Vector) y se cubrieron con un cubreobjetos.

De manera similar se recolectaron cerebros de ratas que recibieron inyecciones de NMDA. Las secciones flotantes, después de varios enjuagues, se incubaron con anticuerpo monoclonal primario de ratón anti-Neun (dilución 1:1, 000, Merck) en la solución de bloqueo durante la noche a temperatura ambiente. Posteriormente, las secciones se lavaron con PBS y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo anti-ratón de caballo biotinilado (dilución 1:200, Vector). El complejo avidina-biotina (complejo ABC 1:100, Vector, 2 h y media de incubación) se acopló a diaminobencidina (0,03%, Merck) para teñir Neun. Luego se enjuagaron las secciones en PBS y se transfirieron a portaobjetos recubiertos de gelatina, se deshidrataron y se cubrieron con un cubreobjetos.

Las secciones Te2 de ratas inyectadas con retroperlas se incubaron con anticuerpo policlonal primario de conejo anti-Fos (1:2,000, señalización celular) en la solución de bloqueo durante la noche a temperatura ambiente. Posteriormente, las rodajas se lavaron con PBS y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con anti-conejo Alexa 488 (1:1,000, Invitrogen, en PBS). Finalmente, las secciones inmunomarcadas se lavaron en PBS, se montaron en portaobjetos recubiertos de gelatina y se cubrieron con un medio de montaje suplementado con DAPI.

Microscopía

El etiquetado de mCherry se examinó utilizando un microscopio confocal Zeiss Airyscan: se utilizaron dos láseres (405 y 561 nm), cada uno correspondiente al espectro de emisión máximo para DAPI (tinción de Nissl para núcleos celulares) y Alexa 568 (mCherry). ), respectivamente. Para analizar la difusión del virus en los lugares de inyección, se adquirieron micrografías de Te2 y ACC como imágenes en mosaico (cada una se adquirió utilizando un objetivo de 10 ×). Los terminales de los axones en BLA se analizaron utilizando un objetivo de 40 × como una pila en z de 10 secciones, espaciadas 1 μm (159 μm cuadrados; fracción de zoom, 1,0).

Para los animales inyectados con retroperlas que se sometieron a inmunomarcaje con cFos, las imágenes se adquirieron con un aumento de 40× (159 μm cuadrados; fracción de zoom, 1,0) con 3 láseres diferentes, correspondientes al espectro de emisión máximo. para DAPI (tinción de Nissl para núcleos celulares), AlexaFluor 488 (cFos) y Texas Red (Retrobeads), respectivamente. Se adquirieron secciones de 0,7 μm a lo largo de una pila z de 10- μm. El número de núcleos que expresan cFos, marcados con perlas y doble positivo (marcadas con perlas cFos+) se cuantificó para cada animal en la región Te2 en las coordenadas anteroposteriores de 6,7 a 7,3 mm del bregma [10]. Luego se promediaron los datos para producir la media de cada animal y los resultados se compararon estadísticamente. Las imágenes de secciones con tinción DAB de Neun se analizaron utilizando el software Neurolucida conectado a un microscopio a través de una cámara CCD en color [10].

Análisis de datos y criterios de exclusión.

La n para cada grupo se estableció a priori de acuerdo con nuestros estudios previos [10,16,17], trabajos previamente publicados en el campo (ver como referencias para ACC [6,22,55] y Te2 [10,59]), y mediante estimaciones de potencia G, según la siguiente tabla (Tabla 1):

Para cada análisis, estimamos un número medio final de 8 a 10 animales para cada grupo. Los grupos se ejecutaron con controles internos en la misma sesión experimental (Tabla S1). Dada la variabilidad de los procedimientos quirúrgicos y conductuales, incluimos a priori un mayor número de sujetos experimentales (hasta un 15% más) que en algunos casos cumplían los criterios experimentales y fueron incluidos, evitando así una exclusión arbitraria. En el caso de los estudios del hipocampo, para evaluar los efectos de las inyecciones de NMDA y CNQX en distintos intervalos de tiempo, equilibramos el número total de animales de control entre ratas con vehículo y operaciones simuladas entre los diferentes grupos.

El análisis de comportamiento, las inspecciones histológicas y los recuentos celulares se realizaron a ciegas. Los animales con una localización inadecuada del recorrido de la aguja o la lesión en el caso de lesiones irreversibles con NMDA fueron excluidos del análisis de datos (Tabla S1). En los estudios farmacológicos, excluimos 57 animales de un total de 465 animales debido a una colocación incorrecta de la aguja (22/255 para Te2, 31/179 para ACC y 4/31 para hipocampo). En los estudios de rastreo, en 21 animales, eliminamos 3 sujetos en los que la inyección de retroperlas no alcanzó el BLA. En los estudios de optogenética de Te2, en un total de 30 animales, excluimos a 1 rata porque la ubicación de las fibras ópticas no estaba por encima de la región objetivo, 1 rata. Después de todo, el virus estaba ausente en Te2 y en 2 ratas porque la difusión del virus fue respectivamente inferior al 4,7% y al 5,3% del área de Te2 en los lugares de inyección. En las ratas incluidas en el análisis estadístico, la difusión mínima del virus fue del 39,6% en la coordenada estereotáxica más anterior y del 50,2% en la coordenada estereotáxica más posterior.

De manera similar, en los experimentos de optogenética del ACC, de un total de 32 animales, se eliminaron 2 ratas porque la colocación de las fibras ópticas no estaba por encima de la región objetivo. Se excluyeron dos ratas porque el virus en ACC estaba ausente, 1 animal porque el virus estaba en la corteza motora secundaria adyacente y 1 rata porque la difusión del virus era inferior al 2,3% del área de ACC en los sitios de inyección. En las ratas restantes, la difusión mínima del virus fue del 33,3% en la coordenada estereotáxica más anterior y del 42,2% en la coordenada más posterior.

En los estudios de lesiones NMDA, las lesiones se dirigieron principalmente a la región CA1 del hipocampo dorsal. La extensión mínima (rojo) y máxima (rosa) de las lesiones del hipocampo sobre toda el área del hipocampo dorsal fueron respectivamente 23,2% y 53,5% en la coordenada estereotáxica más anterior y 28,3% y 62,3% en la coordenada más posterior. De un total de 73 animales, se eliminaron 4 ratas porque la lesión estaba ausente, mientras que se descartaron 3 animales más porque la extensión de las lesiones era inferior al 5,0% (es decir, 4,8%, 4,3%, 3,1 %) relativo al área del hipocampo en las 2 coordenadas.

El análisis del contorno del área se realizó mediante inspección visual y cuantificación manual utilizando la herramienta de contorno de región del software ZEN 3.0. Luego, los valores del área se normalizaron sobre el área total de la región. Las coordenadas estereotáxicas de Te2, ACC y el hipocampo se basaron en el atlas de Paxinos [26] y, en el caso de Te2, el campo cortical se basó en el atlas de Zilles [25].

análisis estadístico

Todos los datos se presentan como media ± SEM. Todos los datos pasaron la prueba de igualdad de varianzas de Levene. Por lo tanto, se emplearon estadísticas paramétricas en todos los experimentos. Los datos de 2 grupos se compararon mediante 2-pruebas t de Student no apareadas con colas. Las comparaciones de grupos múltiples se evaluaron mediante una prueba ANOVA de 1-vías con la prueba post hoc de Tukey. Para abordar las diferencias entre grupos y dentro de ellos, calculamos un modelo ANOVA de diseño mixto 3 × 2 con un grupo (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) como grupo variable de los sujetos y condición (antes y después de condicionamiento reciente + inyección) como variable dentro de los sujetos. Cuando la interacción grupo × condición fue significativa, realizamos un análisis de efectos principales simple y ajustamos cada valor de p con la corrección de Bonferroni. Para cada modelo ANOVA mixto, evaluamos el supuesto de esfericidad mediante la prueba de esfericidad de Mauchly.

Los parámetros estadísticos (es decir, el valor exacto de n para cada grupo, SEM, la prueba estadística, el tamaño del efecto y el valor p exacto) se informan en las leyendas. Para tamaños de muestra iguales, los tamaños del efecto para las pruebas t no pareadas se determinaron calculando la d de Cohen o la d de Glass según la similitud de las DE, mientras que, para tamaños de muestra diferentes, la g de Hedges. Las correlaciones entre los recuentos celulares y la congelación se calcularon utilizando el coeficiente de Pearson. Para determinar si los datos cumplieron con los supuestos del enfoque estadístico, rechazamos la hipótesis nula en el nivel P < 0.05. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS Statistics 22 (IBM).

Información de soporte

S1 Fig. Ampliación de las trayectorias de las agujas de Te2 (A) y la corteza ACC (B) inyectadas con CNQX, seleccionadas como ejemplos. (C) Cuando se los representó en el mismo contexto 2 semanas después del procedimiento, los animales que solo recibieron descargas mostraron una respuesta de miedo baja, lo que demuestra que el procedimiento no provocó una congelación condicionada en el contexto donde se administró la descarga. (D) Se obtuvieron resultados similares a los de la Fig. 1 al contraequilibrar los 2 tonos empleados como CS (CS1, 3 kHz y CS2, 15 kHz) (prueba t de Student, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glass d=4.14). (E) En las ratas condicionadas por olor-CS, la congelación ante el olor, 2 semanas después del acondicionamiento, fue alta incluso si se probó en un entorno diferente en relación con el contexto del acondicionamiento, lo que demuestra que el miedo estaba específicamente asociado con esta entrega de señales. Barras de escala, 300 μm. ��P < 0,01. Todos los datos son medios y SEM. Los datos resumidos de S1 Fig se pueden encontrar en la información de respaldo en el archivo denominado S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S2 Fig. La inyección de CNQX perjudicó la retención de recuerdos auditivos recientes de miedo en ratas donde la generalización del miedo se redujo mediante un tono solo antes de la exposición o empleando un tono de ruido blanco como CS1. Un ANOVA de diseño mixto 3 × 2 (efecto principal del grupo: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0. 236, efecto principal de la condición: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, grupo × interacción de condición F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) mostró que la congelación al tono de 3 kHz antes de su asociación con los EE. UU. era menor en animales que recibieron la preexposición al tono de 15 kHz antes del emparejamiento de 15 kHz-EE. UU. (n=10, p=0.001) o en ratas condicionadas a un ruido blanco (n=13 , p=0.008) en comparación con los animales CS1-CS2 (n=22) que mostraron una respuesta de generalización de miedo variable. Sin embargo, después del aprendizaje CS-US y las inyecciones de cnqx en la corteza Te2, la memoria del miedo reciente se vio afectada en todos los grupos (p > 0,05). Efecto principal simple dentro de los grupos (antes y después del aprendizaje CS-US seguido de la inyección cnqx): CS1-CS2, p=0.025; Tono-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0,05, ��P < 0,01. Todos los datos son medios y SEM. Los datos resumidos para S2 Fig se pueden encontrar en Información de soporte en el archivo llamado S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S3 Fig. (A) Ejemplo aleatorio de inyección de retroperlas dirigida a BLA. (B y C) Ejemplos de colocaciones de fibra óptica sobre el BLA de animales inyectados con vectores AAV en Te2 (B) y corteza ACC (C). Barras de escala, 500 μm.

Expresiones de gratitud

Agradecemos al Dr. E. Manassero por su continuo apoyo y asesoramiento.

Contribuciones de autor

Conceptualización: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Curación de datos: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Análisis formal: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Adquisición de financiación: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Investigación: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metodología: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Supervisión: Benedetto Sacchetti.

Validación: Benedetto Sacchetti.

Escritura – borrador original: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Escritura – revisión y edición: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Referencias
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