El receptor 1 activado por proteasa contribuye a la falla de la microcirculación y al daño tubular en la lesión renal por isquemia-reperfusión en ratones

yu guan,¹daisuke nakano,²lei li,³Haofeng Zheng,³Akira Nishiyama,²Ye Tian,¹y Lei Zhang¹

para aliviar la falla real conhierba cistanche

1. Introducción

losriñónno puede evitar la lesión por isquemia-reperfusión (IR) durante la nefrectomía parcial yriñóntrasplante [1], que se sabe que da como resultado la retención de productos de desecho metabólicos y conduce ariñónlesión (LRA) yLRA-crónicoriñón(IRA-ERC) [2]. Hasta la fecha, no existe ningún tratamiento farmacológico específico disponible clínicamente para la LRA y la LRA-NC [3]. Varios cambios patológicos comunes ocurren en la LRA, como la falla de la microcirculación [4], que incluye congestión y hemorragia, y necrosis tubular aguda [5]. Por lo tanto, los estudios se han centrado en abordar estos cambios patológicos como posibles candidatos terapéuticos. Previamente demostramos que mantener los capilares peritubulares despuésrenalLa lesión por RI redujo la congestión capilar y mejoró la transición de LRA a ERC [6]. La necrosis tubular aguda puede ser difícil de tratar; por lo tanto, la regeneración de los túbulos a través de la proliferación de células tubulares puede ser un enfoque importante para prevenir una mayor pérdida de la función renal [7].

El receptor activado por proteasa-1 (PAR-1) pertenece a la familia de receptores activados por proteasa (PAR) y se sabe que es estimulado por la trombina para inducir la coagulación plaquetaria. Recientemente mostramos que PAR-1 contribuyó al desarrollo de lesión glomerular inducida de forma aguda [8]. Además, se informó que la trombina/PAR-1 desempeña un papel en la proliferación y apoptosis de las células epiteliales. Sobre la base de estas características, planteamos la hipótesis de que PAR-1 aceleraba la gravedad de la LRA al regular la coagulación de la sangre capilar peritubular o la regeneración tubular. En este estudio, examinamos el papel de PAR-1 mediante el uso de Q-94, un modulador alostérico negativo selectivo PAR-1-, en un ratónrenalModelo de lesión IR y células tubulares humanas cultivadas estimuladas con trombina.

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2. Materiales y métodos

2.1. Modelo de ratón IR de riñón agudo.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas experimentales del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de la Capital. losriñónEl modelo de ratón IR se estableció como se describió anteriormente [8]. Brevemente, se anestesiaron ratones macho C57/BL6 de 8-semanas de edad mediante una inyección de pentobarbital sódico (50 mg/kg; ip) y se dividieron al azar en los siguientes grupos: simulado, I/R más vehículo e I/R (vehículo: solución salina 10 mg/kg iv) más Q94 (un antagonista de PAR-1 a 10 mg/kg iv) grupos (n=7–8 en cada grupo). Para el protocolo de lesión por infrarrojos cálidos renales, los ratones se sometieron a uninefrectomía para evaluar el daño a la función renal; después de una semana, el pedículo renal se pinza con clips vasculares libres de daños durante 30 min. Después de la reperfusión durante 48 h, se sacrificaron los ratones; sus muestras de tejido renal se recolectaron y fijaron en una solución de paraformaldehído al 4 por ciento para preparar bloques de parafina. Se obtuvo plasma para medir el nitrógeno ureico en sangre (BUN) y la creatinina.

2.2. Materiales.

Q94 se adquirió de Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido). Otros productos químicos se obtuvieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) a menos que se indique lo contrario.

2.3. Ensayo de Creatinina y BUN.

Se usaron kits de ensayo comerciales (Creatinine Assay Kit ab65340; Abcam, Cambridge, Reino Unido) para medir la creatinina. Los kits de ensayo de BUN se adquirieron de ABSBio™ (Kit de UREA NITROGEN, CNHAO BIO, Beijing, China).

2.4. Histología.

Antes de incluirlo en parafina, el tejido renal se fijó con paraformaldehído al 4 por ciento. Los bloques de parafina de riñón se cortaron en secciones de 2 μm y se montaron en portaobjetos durante la noche a 25 grados C. Después de la desparafinación, las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio (BX-51/DP-72; Olympus, Tokio, Japón). Como se describió anteriormente [9], el daño de los túbulos renales se diagnosticó en función de varios cambios histopatológicos, como dilatación tubular, congestión/hemorragia, pérdida del borde en cepillo, formación de cilindros tubulares y lisis celular con restos desprendidos en la luz tubular. El daño tubular se puntuó según el porcentaje de túbulos dañados: 0, sin daño; 1,<25%; 2,="" 25–50%;="" 3,="" 51–75%;="" and="" 4,="">75 por ciento La puntuación se realizó de forma ciega.

2.5. Inmunofluorescencia e Inmunohistoquímica.

Las secciones se prepararon como se describe para el ensayo de histología (H&E) y luego se incubaron con 0.3 por ciento de peróxido de hidrógeno durante 30 minutos para bloquear las peroxidasas endógenas después de la desparafinización con xileno. Para la recuperación del antígeno, las secciones se incubaron con proteinasa K (DAKO Cytomation, Glostrup, Dinamarca) durante 10 min. Después de bloquear con suero de cabra al 10 por ciento, las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 grados C (anticuerpo anti-Kim 1, ab47635, Abcam; anticuerpo anti-Ki67, ab15580, Abcam; anticuerpo anti-PAR-1, ab32611 , Abcam). Después de la incubación con el anticuerpo primario, las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario a 25 °C durante 1 h. Se usó sustrato DAB (DAKO) para visualizar los resultados de tinción de inmunohistoquímica (IHC). Las señales de fluorescencia se detectaron usando un anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor 594-. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio de fluorescencia FL (BX51; Olympus) con un filtro apropiado. Se utilizó el software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE. UU.) para analizar las áreas positivas.

2.6. PCR en tiempo real.

Para evaluar la regulación de la expresión de ARNm en estas condiciones, se aisló ARNm de tejido renal. Se utilizó un sistema PCR (7300 Fast Real-Time; Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) y el kit Light Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green I (Applied Biosystems) para detectar los niveles de 18S y PAR-1 ARNm. Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: 18S —5′ -GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′, 5′-CCATCCAATCG GTAGTAGCG-3′; PAR-1—5′-GTTGATCGTTTCCACG GTCT-3′, 5′-GCTGCCTCTGTACCAGGACT-3′. Los niveles relativos de ARNm se determinaron utilizando el método 2−ΔΔCq. El valor de ΔΔCq se calculó utilizando datos del grupo de control.

2.7. Procedimiento quirúrgico y configuración de imágenes multifotónicas in vivo.

Los ratones fueron anestesiados con isoflurano al 2 por ciento (Mylan, Osaka, Japón). Después de la traqueotomía, se canuló la vena yugular para la inyección de colorante fluorescente y la infusión de líquido de mantenimiento, que consistía en 1,0μl/min de albúmina al 2 % en solución salina tamponada con fosfato. El riñón izquierdo de cada ratón se exteriorizó a través de una pequeña incisión en el flanco y se adjuntó a un cubreobjetos. La platina del microscopio y los animales se calentaron usando una almohadilla térmica durante todos los procedimientos experimentales. La microscopía multifotónica intravital se realizó utilizando un sistema de imágenes de fluorescencia confocal multifotónica Olympus FV1000MPE alimentado por un láser Chameleon Ultra-II MP a 860nm (Coherent, Inc., Santa Clara, CA, EE. UU.). El objetivo del microscopio era una lente de inmersión en agua de 25x con una apertura numérica de 1,05. Los ajustes de imagen para el microscopio (ganancia y compensación para los tres canales; azul, verde y rojo) se fijaron durante todo el experimento. Después de un período de recuperación de 30 minutos, se inyectó rodamina B- 70kD dextrano por vía intravenosa y se tomaron imágenes 3-D z-stack a profundidades de 5–50 μm (2 μm de distancia) desde la superficie del riñón.

2.8. Cultivo de células.

Las células de riñón humano 2 (HK2) se obtuvieron del Cell Bank of Academy Sciences (Shanghai, China) y se cultivaron como se describió anteriormente [10]. Las células se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 10 por ciento de suero fetal bovino y 1 por ciento de penicilina-estreptomicina en una atmósfera húmeda de 95 por ciento de aire y 5 por ciento de CO2 a 37 grados.

2.9. Ensayos WST-1 para evaluar la proliferación celular.

Las células HK2 se sembraron en 6-placas de pocillos a una densidad de 1 × 104 células/pozo. Después de estimular las células HK2 con trombina, se realizaron ensayos WST- 1 de acuerdo con el protocolo del fabricante (catálogo #C0035; Beyotime, Shanghái, China) para determinar la capacidad proliferativa de las células. Después de 2h de incubación con 100μL de reactivo WST-1 en cada pocillo, se midió la absorbancia de las muestras utilizando un lector de microplacas a una longitud de onda de 450nm.

2.10. Ensayo de caspasa-3.

La actividad de caspasa-3 se midió utilizando un kit de actividad de caspasa-3 disponible comercialmente (n.º de catálogo C1116; Beyotime, Shanghái, China) [11]. Después de la incubación con el reactivo del kit de actividad de caspasa-3, se detectó la absorbancia de las muestras usando un lector de microplacas (Spectra-Max M2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.) a 405 nm de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2.11. Datos y Análisis Estadístico.

Se utilizó un análisis de varianza de una vía para comparar múltiples grupos, seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Para comparar dos grupos individuales, utilizamos la prueba t de Student. Se consideró que p < 0:05="" indicaba="" resultados="" estadísticamente="">

Cistanche tubulosapreviene la enfermedad renal

3. Resultados

3.1. Expresión de PAR-1 en el Riñón IR.

Primero confirmamos la expresión de PAR-1 y los efectos de IR en su nivel de expresión en elriñón. Observamos un aumento de casi 2-veces en el nivel de expresión del ARNm de PAR-1 en comparación con el de los ratones de cirugía simulada a las 48 h (Figura 1(a)). También medimos la expresión de PAR-1 por inmunofluorescencia a las 48 h después de la IR. PAR-1 se expresó en la membrana del borde en cepillo de las células tubulares. El nivel de fluorescencia PAR-1 FL aumentó en comparación con los ratones del grupo simulado (Figuras 1(b) y 1(c)). Estos datos sugieren que tanto la localización de PAR-1 en las células tubulares como su nivel de expresión aumentaron después de la IR en el riñón.

3.2. Función Renal y Alteraciones Histopatológicas. evaluamosriñónfunción mediante la detección de los niveles de BUN y creatinina en el plasma. I/R indujo un aumento en los niveles de BUN y creatinina en comparación con ratones sometidos a cirugía simulada. Además, el aumento inducido por IR en el nivel de BUN disminuyó significativamente en los ratones tratados con Q94- (Figura 2(a)). El nivel de creatinina sérica se inhibió en los ratones tratados con Q94- en comparación con los ratones sometidos únicamente a cirugía IR (Figura 2(b)). Estos datos sugieren que la administración de Q94 puede protegerriñónfunción después de la lesión IR.

También evaluamos los cambios histopatológicos renales mediante la tinción con H&E. La IR renal aumentó significativamente la formación de yesos, la dilatación tubular y la pérdida del borde en cepillo y la congestión/hemorragia en los ratones tratados con vehículo en comparación con los ratones simulados. El tratamiento con Q94 suprimió notablemente estos cambios inducidos por IR (Figuras 2(c) y 3(a)). El análisis de los resultados de la tinción con H&E entre los grupos reveló la puntuación de congestión/hemorragia y la puntuación de daño tubular para cada grupo. Los ratones del grupo Q94 exhibieron una puntuación mucho más baja (Figuras 2 (e) y 3 (c)). También teñimos a Kim-1 como unriñónmarcador de lesión de las células tubulares renales por IHC [12]. Las áreas positivas de Kim-1-aumentaron en el área tubular renal en ratones con insulto IR, que fueron significativamente suprimidas por Q94 (Figuras 2(d) y 2(f)). Estos datos sugieren que Q94 puede suprimirriñóndaño tubular inducido por lesión IR.

3.3. Flujo anormal de células sanguíneas en imágenes in vivo.

PAR-1 y su ligando trombina juegan papeles importantes en la congestión; Q94 mejoró significativamente la congestión. Por lo tanto, realizamos imágenes intravitales mediante microscopía multifotónica. Esto permite la observación del compañero de células sanguíneas en el capilar peritubular en tiempo real en ratones vivos (Figura 3 (c)). El plasma se visualizó mediante dextrano de 70 kDa conjugado con rodamina B (Figura 3(d)). Se usaron células sanguíneas que no generan fluorescencia FL en respuesta al láser para excitar la rodamina B y se representaron como sombras. Como se muestra en la Figura 3(e), la IR renal interrumpió el seguimiento regular de las células sanguíneas e indujo una falla en la microcirculación. Q94 mejoró el compañero de células sanguíneas capilares peritubulares.

3.4. Proliferación de células tubulares después de una lesión por IR.

Se ha informado que la regeneración proliferativa de las células tubulares juega un papel importante en la restauración de la estructura tubular y la función renal después de una lesión por IR. Se sabe que PAR-1 modifica la proliferación de células epiteliales cuando se activa con la trombina. Por lo tanto, detectamos la proliferación de células tubulares renales en un ensayo IHC Ki-67. A las 48 h después de la IR, aumentó el número de células tubulares positivas para Ki-67- proliferantes. Q94 aumentó aún más el aumento del número de células tubulares positivas para Ki-67-después de la IR en comparación con los ratones tratados solo con IR (Figuras 4(a) y 4(b)). Además, comprobamos si la capacidad de proliferación celular se vio afectada por la inhibición de PAR-1 en experimentos in vitro utilizando células HK2 incubadas con trombina, un agonista de PAR-1. La actividad proliferativa de las células HK2 se midió mediante el ensayo WST-1. Como se muestra en la Figura 4(c), la proliferación de células HK2 se suprimió drásticamente después del tratamiento con trombina. Sin embargo, esta inhibición inducida por la trombina casi fue abolida por Q94. Estos datos indican que PAR-1 regulaba negativamente la proliferación de células tubulares renales, que fue casi abolida por el antagonista Q94 PAR-1.

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3.5. Apoptosis de células tubulares renales.

Examinamos más a fondo la apoptosis de las células renales utilizando caspasa-3, que es la caspasa ejecutora más importante y se activa tanto por vías intrínsecas como extrínsecas durante la apoptosis [13]. Utilizando células HK2 cultivadas e incubadas con trombina, encontramos que la trombina aumentaba la actividad de la caspasa-3. Además, la administración de Q94 suprimió la actividad de la caspasa-3 (Figura 4(d)). Estos datos sugieren que la apoptosis inducida por trombina de las células HK2 fue inhibida por el antagonista Q94 PAR-1.

4. Discusión

RiñónLa lesión por RI se caracteriza por congestión/hemorragia, necrosis tubular aguda, inflamación y depósito de formación de yeso [5]. Aquí, mostramos que la inhibición de PAR-1 mejoró tanto el cambio asociado con la sangre como los cambios tubulointersticiales. Es bien sabido que PAR-1 y su ligando, la trombina, juegan un papel importante en la coagulación plaquetaria, y la interferencia de este sistema, como la trombomodulina [14, 15], puede prevenir la LRA. Mostramos que la inhibición de PAR- 1 suprimió la congestión y mejoró el flujo sanguíneo en los capilares peritubulares en ratones con lesión renal por infrarrojos, lo que sugiere que el sistema PAR-1 deterioró la microcirculación. Además, el nivel de expresión de PAR-1 aumentó en los túbulos después de la lesión por IR renal, lo que indica que el sistema dependiente de PAR-1-en los túbulos también exagera la lesión por IR renal. Está bien establecido que la regeneración de las células tubulares es un proceso importante en la reconstrucción de la estructura tubular y en la recuperación de la función renal después de una lesión por IR [16, 17]. Dependiendo del grado de lesión, esta capacidad de reparación no es ilimitada [18]. Por lo tanto, se necesitan con urgencia opciones de tratamiento para atenuar el daño en las células tubulares o acelerar su proliferación. Nuestro estudio in vitro mostró que PAR- 1/trombina regulaba negativamente la proliferación de células tubulares, que a su vez se aceleraba tras la inhibición de PAR-1. Además, se demostró que la lesión por IR en ratones aumenta la proliferación tubular a las 48 h, con un aumento adicional después de la inhibición de PAR-1. Encontramos que PAR-1 estaba aumentado en la membrana del borde en cepillo de los túbulos proximales. Como se ha informado que la función de la barrera de filtración glomerular disminuye durante la lesión por IR renal [19], la trombina filtrada de los glomérulos puede activar el aumento de PAR- 1, interrumpiendo así la regeneración tubular.

Nuestros resultados sugieren que el sistema PAR-1/trombina suprimió la proliferación de células tubulares y aumentó la apoptosis. Sin embargo, otro estudio mostró efectos opuestos de PAR-1 cuando se activa con la proteína C [20, 21]. Este papel aparentemente conflictivo de PAR-1 puede depender del método de su activación. En nuestro estudio, una posible explicación de su papel atribuido fue que PAR-1 fue activado por trombina filtrada. El tamaño de la proteína C supera los 60 kDa, similar al de la albúmina [22, 23] y mucho mayor que el de la trombina (36 kDa). Además, su concentración plasmática (<100 nm)="" is="" less="" than="" 10%="" of="" thrombin="" (="">1 μM), lo que indica que la proteína C sufre menos filtración y produce una señal más débil en comparación con la trombina.

Los episodios trombóticos son un factor de riesgo para los pacientes con insuficiencia renal terminal [24]. Un estudio demostró que la deficiencia de PAR-1 protege contra la ERC diabética [25]. En nuestro estudio, observamos el efecto de la inhibición de PAR-1 sobre la función renal en una fase temprana después de la RI. En estudios posteriores, tenemos la intención de desarrollar una crónicariñónModelo de enfermedad inducida por IR [2] para evaluar el vínculo potencial entre PAR-1 con ERC.

En conclusión, demostramos que PAR-1 exacerbaba el fallo de la microcirculación y regulaba negativamente la proliferación de células tubulares. Por el contrario, la inhibición de PAR-1 contribuyó a mejorar la microcirculación y la proliferación de células tubulares y después de la RI, sirviendo como un mecanismo destacado de recuperación renal, y debe considerarse una nueva estrategia en el tratamiento de la LRA.

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1Departamento de Urología, Hospital de la Amistad de Beijing, Universidad Médica Capital, Beijing, China

2Departamento de Farmacología, Universidad de Kagawa, Kagawa, Japón

3División de Trasplante de Riñón, Departamento de Cirugía, Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen,

Guangzhou, China

La correspondencia debe dirigirse a Ye Tian; kidney@ccmu.edu.cn y Lei Zhang; leizhangkidney@gmail.com Recibido el 1 de enero de 2021; Revisado el 25 de enero de 2021; Aceptado el 8 de febrero de 2021; Publicado 23 febrero 2021

Editor académico: Junyan Liu

Derechos de autor © 2021 Yu Guan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo laLicencia de atribución de Creative Commons, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite correctamente la obra original.

La lesión renal inducida por isquemia-reperfusión (IR-) es difícil de evitar durante el trasplante renal y la nefrectomía parcial asistida por robot. La lesión por IR renal se caracteriza por daño tubular, insuficiencia de la microcirculación e inflamación, que aumentan de manera coordinada la lesión renal; sin embargo, no existe un tratamiento específico para estas condiciones. El receptor activado por proteasa-1 (PAR-1) y su ligando, la trombina, están involucrados en la coagulación y se demostró que están asociados con la lesión de las células epiteliales. Aquí, planteamos la hipótesis de que PAR-1 exageraba el daño de las células tubulares inducido por IR renal y la falla de la microcirculación y que la inhibición farmacológica de PAR-1 por parte de Q94 podría prevenir estas lesiones. El IR cálido renal aumentó la expresión de PAR-1 en los túbulos renales. Q94 atenuó los cambios inducidos por IR renal y el daño histopatológico. La falla de la microcirculación se analizó por congestión en la histopatología y el flujo de células sanguíneas examinado por microscopía multifotónica intravital fue suprimido por el tratamiento con Q94. Q94 también aumentó drásticamente la proliferación de células tubulares a pesar del menor daño renal. La trombina suprimió la proliferación celular e indujo la apoptosis en los túbulos; estos efectos fueron prevenidos por el tratamiento con Q94. En conjunto, PAR-1 se asoció con lesión por IR renal. La inhibición de PAR-1 mejoró la lesión posiblemente al mejorar la microcirculación renal y la supervivencia/proliferación de células tubulares.

Data AVirginiaIllinoisabdominalesEncendíy

Los autores confirman que los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo.

Cenvolarcts of Interest

Todos los autores han declarado que no tienen intereses en competencia.

AutHors' Centributiens

Yu Guan y Daisuke Nakano escribieron el manuscrito y realizaron experimentos con animales. Lei Li realizó experimentos in vitro. Haofeng Zheng realizó el análisis estadístico. Akira Nishiyama revisó el manuscrito. Lei Zhang y Ye Tian diseñaron este estudio.

Acknowledgment

Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 82000712) y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (Nº 2020M670385).

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