Efecto protector del resveratrol sobre la insuficiencia renal inducida por acrilamida
Feb 23, 2022
Fondo: La acrilamida (ACR) tiene una amplia gama de usos. Posee uninsuficiencia renalefecto. El trabajo tuvo como objetivo estudiar el posible papel protector del resveratrol (RVS) sobre la ACR mediada porinsuficiencia renalen ratas Se investigaron los mecanismos subyacentes sugeridos que participan en dicha protección.Materiales y métodos:Treinta ratas albinas adultas Sprague-Dawley se dividieron en tres grupos: control, ACR y RVS. Después de 4 semanas, elriñónfue removido y preparado para estudios histológicos, inmunohistoquímicos y bioquímicos. Se evaluó la actividad de los marcadores tisulares oxidativos (malondialdehído [MDA]) y antioxidantes (glutatión [GSH]).Resultados:glomerular inducida por acrilamidarenalafección en forma de contracción y distorsión de los glomérulos con arrugamiento de sus membranas basales y ensanchamiento de los espacios urinarios. Los cambios tubulares degenerativos estaban marcadamente presentes en los túbulos contorneados proximales. Las células tubulares necróticas exhibieron vacuolización citoplasmática con células epiteliales descamadas dentro de la luz tubular. ACR aumenta el depósito de fibras de colágeno en la membrana basal de los capilares glomerulares e induce el engrosamiento de las membranas basales de losrenalcorpúsculos yrenaltúbulos. La administración de RVS otorga alta protección a losriñón. Los glomérulos yrenallos túbulos eran casi normales. El contenido de fibras de colágeno y la reacción de Schiff del ácido peryódico de la membrana basal delrenallos túbulos estaban un 70 por ciento y un 19 por ciento más bajos vinculados al grupo ACR. Los niveles de creatinina y urea se redujeron en un 51 y un 47 por ciento. RVS indujo tal papel protector a través de su efecto antioxidante ya que el nivel de MDA disminuyó en un 45 por ciento, mientras que el nivel de GSH aumentó en un 83 por ciento en comparación con el grupo ACR. Conclusiones: La acrilamida provoca trastornos estructurales y funcionales delriñón.induceriñóndaño por estrés oxidativo y apoptosis. Con el uso de RVS, normalriñónla arquitectura se conservó con pequeños cambios estructurales. Agregando, funcionalriñónla prueba se normalizó. RVS ejerce su efecto protector a través de sus características antiapoptóticas y antioxidantes. (Folia Morphol 2021; 80, 4: 985–993).
INTRODUCCIÓNLa acrilamida (ACR) es un contaminante ambiental bien conocido que ejerce una variedad de efectos tóxicos sistémicos en las personas después de la exposición ocupacional y dietética [2, 22]. Posee una variedad de propiedades dañinas: carcinogenicidad, genotoxicidad, neurotoxicidad y toxicidad reproductiva [5, 7]. El ACR y sus análogos se utilizan ampliamente en diversas aplicaciones químicas y ambientales y se producen calentando material biológico derivado de tejidos vegetales [25]. La formación de ACR se produce durante el procesamiento de los alimentos debido a la exposición de los carbohidratos a temperaturas superiores a los 200 grados [12]. Se han encontrado altos niveles de ACR en alimentos de consumo habitual, en particular; papas fritas y pan [31].
La acrilamida se absorbe en el tracto gastrointestinal y se dispersa ampliamente en los fluidos corporales y se almacena en el hígado yriñón[28]. Se sabe que el ACR causa cambios estructurales y funcionales en muchos órganos. losrenallas células tubulares sufren cambios vacuolares degenerativos, infiltración de células inflamatorias y edema periglomerular [28]. Además, la administración de ACR en ratas eleva los niveles séricos de urea, creatinina, ácido úrico yrenalcitocina proinflamatoria [1]. El metabolismo de ACR desencadena la liberación de radicales libres (ROS), lo que inicia el estrés oxidativo y conduce a un desequilibrio en el desarrollo y la degradación de ROS [19]. También induce la peroxidación de lípidos y el daño del ADN [1].
Se estudiaron los efectos de muchos compuestos antioxidantes y antiinflamatorios, como el aceite de oliva, la vitamina E y el 5-ácido aminosalicílico, para prevenir y tratar la inflamación inducida por ACR.insuficiencia renal[9, 19]. El resveratrol (RVS) es una fitoalexina que se encuentra en al menos72 especies de plantas, muchas de las cuales son consumidas por los humanos, incluidas las moras, los cacahuetes y las uvas [8]. RVS tiene actividad antiinflamatoria, antiplaquetaria, antioxidante y anticancerígena, así como la capacidad de reducirDaño en el riñóncausada por compuestos químicos [8, 10]. Sin embargo, no está claro si RVS puede defenderse contra la inducción de ACR.insuficiencia renalO no. Por lo tanto, estudiamos el efecto dañino oxidativo y apoptótico del ACR sobre elriñóne investigó el papel protector de RVS sobre talesinsuficiencia renalen ratas
Palabras clave:resveratrol, acrilamida, riñón, renal, insuficiencia renal
MATERIALES Y MÉTODOS
animalesEn nuestro estudio se incluyeron treinta ratas albinas adultas Sprague-Dawley que pesaban entre 170 y 200 g. Los animales se mantuvieron en espaciosas jaulas de malla de alambre en una habitación especial con luz natural directa y ventilación natural. Las ratas tenían libre acceso a alimento estándar para ratas y agua. Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las pautas estándar para el cuidado y uso de animales de laboratorio. El estudio fue autorizado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de El Cairo, Egipto.Los procedimientos seguidos fueron siguiendo los estándares éticos de la organización responsable y con la Declaración de Helsinki de 1975 revisada en 1983.
Diseño experimentalLas ratas se distribuyeron en tres grupos (10 en cada grupo): control (a las que se les administró agua destilada en una dosis de 1 ml), grupo ACR y grupo RVS (ACR concomitante más RVS).
quimicosLa acrilamida se obtuvo en un contenedor de polvo adquirido por Biostain Company (Reino Unido) con un peso de 500 g. Se disolvió en agua destilada, en una concentración de 10 g/L. Se administró a una dosis de 1 ml de agua destilada que contenía 40 mg/kg/día por vía oral por sonda gástrica [9]. El resveratrol (pureza, > 99 por ciento) se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Se disolvió en dimetilsulfóxido y se diluyó en solución salina fisiológica al 0,9 por ciento. Se administró a una dosis diaria de 20 mg/kg/día por vía oral mediante sonda gástrica [18]. Al final del experimento (después de 4 semanas), se pesó cada animal y se extrajo una muestra de sangre de la vena de la cola utilizando un tubo capilar heparinizado fino. losriñónse extrajo, se lavó con solución salina y se dejó secar en un papel picado.
Estudio microscópico de luzRiñónlas muestras se fijaron en formalina al 10 por ciento, se deshidrataron en alcohol etílico, se aclararon en xilol y se incluyeron en cera de parafina. Se cortaron secciones de 5 µm de espesor y se montaron en portaobjetos de vidrio. Otras secciones se montaron en portaobjetos cargados positivamente para inmunohistoquímica. Las secciones se sometieron a lo siguiente: — Se prepararon secciones teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) y tricrómico de Masson de acuerdo con Suvarna et al. [24]; — evaluación histoquímica: tinción con ácido peryódico de Schiff (PAS): las secciones teñidas con PAS se prepararon de acuerdo con Suvarna et al. [24]; análisis inmunohistoquímico de la proteína X asociada a Bcl-2- (BAX) [20]. Se prepararon secciones de parafina. Luego, se añadió una cantidad adecuada de suero a las secciones durante 30 min. La peroxidasa endógena se inactivó con una solución de metanol que contenía H2O2 (1:50) durante 10 min y se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las secciones de tejido se bloquearon con suero al 1,5 por ciento durante 30 min. Las secciones se incubaron con el anticuerpo primario Bax (proteína BAX antihumana, DakoCytomation, Dinamarca), seguido del anticuerpo secundario (biotinilated link universal del kit comercial LSAB: DakoCytomation, Dinamarca). Posteriormente, las muestras se incubaron con enzimas AB durante 30 min y se enjuagaron en PBS. Las señales positivas se detectaron utilizando sustratos cromogénicos de peroxidasa. El control negativo incluía PBS en lugar del anticuerpo secundario.
Análisis de imágenes y medidas morfométricasUtilizando el sistema informático analizador de imágenes Leica LAS V3.8 (Suiza), se evaluaron los siguientes parámetros: los diámetros de losrenalglomérulos y túbulos contorneados proximales, el ancho de larenalespacio, y la altura del epitelio tubular proximal de revestimiento. Además, el número de glomérulos estructuralmente alterados se evaluó como un porcentaje del número total de glomérulos. También se evaluó el contenido de las fibras de colágeno. En secciones histológicas teñidas con PAS, se determinó adicionalmente la densidad óptica de la membrana basal de los túbulos contorneados proximales y las capas parietales de las cápsulas de Bowman. En el área de tinción inmunohistoquímica de BCL2 también se midió el porcentaje de la reacción inmune.
Estudio bioquímicoLas muestras de sangre extraídas de las ratas antes del sacrificio se utilizaron para la evaluación bioquímica en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad de El Cairo, Egipto.
Los niveles séricos de urea y creatininafueron estimados por el método colorimétrico convencional utilizando los kits de ensayo Quanti Chrom TM (DIUR-500 y DICT-500), basados en los métodos mejorados de Jung y Jaffe, respectivamente [32]. Los valores medios de estos parámetros bioquímicos se calcularon y se sometieron a análisis estadístico.
Nivel tisular de malondialdehído (MDA) y glutatión reducido (GSH).losrenalel tejido se homogeneizó en 5–10 ml de tampón frío (fosfato de potasio 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) por gramo de tejido y luego se centrifugó a 100,000 g durante 15 min a 4 grados. El sobrenadante se eliminó para el ensayo y se almacenó en hielo. El ensayo de malondialdehído se realizó con la prueba de ácido tiobarbitúrico (TBA) en el sobrenadante, de acuerdo con el método sugerido por Buege y Aust [4].MDA reacciona con TBA para dar un compuesto rojo que absorbe a 535 nm. La medición de GSH se basó en la reducción de 5,5-ditiobis (2-ácido nitrobenzoico) (DTNB) con GSH reducido para producir un compuesto amarillo [6].
análisis estadísticoLos valores medios de los relativosriñónel peso, las medidas histomorfométricas y los niveles bioquímicos se analizaron utilizando SPSS versión 22. La estimación estadística se realizó mediante ANOVA seguido de comparaciones por pares de Bonferroni.
RESULTADOS
Evaluación microscópica de luzEl examen del grupo de control mostró una arquitectura intacta de larenalcorteza. losrenalla corteza está formada porrenalcorpúsculos y túbulos contorneados proximales y distales (fig. 1A). El examen de larenalla corteza del grupo ACR reveló marcados cambios estructurales. losrenallos glomérulos mostraron una contracción, distorsión, segmentación y vacuolización de moderadas a marcadas con espacios urinarios ensanchados. losrenallos túbulos estaban dilatados con marcada disminución de su altura epitelial y ensanchamiento de sus luces. Sus células de revestimiento mostraron vacuolización citoplasmática, fragmentación celular y se observó formación de cilindros intraluminales en muchos túbulos contorneados. El intersticio mostraba vasos sanguíneos congestionados con engrosamiento de la íntima y también se apreciaba infiltración celular masiva (fig. 1B-D). El examen del grupo RVS reveló la apariencia casi normal de la mayoría de los glomérulos y túbulos. Se encontró una mínima infiltración celular inflamatoria intersticial (Fig. 1E).
Contenido de fibras de colágenoEl contenido de las fibras fue mínimo en el grupo de control. El contenido aumentó alrededor de las capas parietales de las cápsulas de Bowman y las membranas basales de lasrenaltúbulos en los grupos ACR (9-pliegue) y RVS (2-pliegue) cuando se relacionan con el grupo de control. El contenido en el grupo RVS fue un 70 por ciento más bajo en relación con el grupo ACR (Fig. 2A-C, Tabla 1).
Histoquímica del riñónEn el grupo de control, las membranas basales de losrenaltúbulos y las capas parietales de las cápsulas de Bowman demostraron una reacción PAS débil. Agregando, los bordes en cepillo apicales de la contorneada proximal
Los túbulos (PCT) estaban intactos y ocluyendo parcialmente la luz tubular (Fig. 3A). Las membranas basales delrenaltúbulos y las capas parietales de las cápsulas de Bowman del grupo ACR mostraron una intensa reacción PAS (42 por ciento más alta que el grupo de control). Además, los bordes en cepillo apicales del PCT estaban atenuados (Fig. 3B). Con el uso de RVS, la reacción de PAS se volvió comparable a la del grupo de control y fue un 19 por ciento más baja que la del grupo ACR (Fig. 3C, Tabla 1).
Tinción inmunohistoquímica BAXBAX mostró una reacción débil en el grupo de control (Fig. 4A). El porcentaje de área de células inmunopositivas BAX aumentó 4.5- veces en el grupo ACR emparejado con el grupo de control (Fig. 4B, C, Tabla 1). Con el uso de RVS, el porcentaje de área de las células inmunopositivas disminuyó un 56 por ciento en comparación con el grupo ACR; sin embargo, el porcentaje de área en el grupo RVS fue 1.4- veces más alto que el grupo control (Fig. 4D, Tabla 1).
Marcadores bioquímicos y oxidativos/antioxidativosLos niveles séricos de creatinina y urea aumentaron en el grupo ACR en 2.75-veces, 1.9-veces en comparación con el grupo de control. Con el uso concomitante de RVS, los niveles de creatinina y urea disminuyeron en un 51 por ciento, 47 por ciento aliado al ACR. Sin embargo, los niveles de creatinina y urea en el grupo RVS fueron 83 por ciento, 55 por ciento más altos que el grupo control (Tabla 1).
Los valores del marcador oxidativo (MDA) en el grupo ACR aumentaron 14-veces, mientras que el marcador antioxidante (GSH) disminuyó 13-veces en comparación con el grupo de control. Con el uso de RVS, el nivel de MDA disminuyó en un 45 por ciento, mientras que el nivel de GSH aumentó en un 83 por ciento en comparación con el grupo ACR. Aún así, el nivel de ambos marcadores se alejó del grupo control (Tabla 1).
Cambios morfométricos glomerulares y PCTEl porcentaje de glomérulos afectados en el grupo ACR aumentó 8.8-veces en comparación con el grupo de control. Con el uso de RVS, el porcentaje de glomérulos afectados disminuyó un 71 por ciento equivalente algrupo ACR; sin embargo, el porcentaje en el grupo RVS fue 1.6-veces mayor que el grupo control (Tabla 2).
En el grupo ACR, el diámetro glomerular disminuyó un 58 por ciento con un aumento en el ancho del espacio urinario 2.4- veces comparado con el grupo de control. Con el uso de RVS, el diámetro glomerular aumentó 1.26-veces con una disminución en el ancho del espacio urinario 57 por ciento comparado con el grupo ACR. El diámetro glomerular y el ancho del espacio urinario en los grupos RVS y control fueron similares (Tabla 2). En el grupo ACR, el diámetro de la PCT aumentó un 31 por ciento, mientras que la altura de su revestimiento epiel telio disminuyó un 62 por ciento en comparación con el grupo de control. Con el uso de RVS, el diámetro de los PCT disminuyó un 18 %, mientras que la altura de su epitelio de revestimiento aumentó 1.4- veces en comparación con el grupo ACR. Ambos parámetros fueron comparables en los grupos RVS y control (Tabla 2).
DISCUSIÓNglomerular inducida por acrilamidarenalafección en forma de contracción y distorsión de los glomérulos con arrugamiento de sus membranas basales y ensanchamiento de los espacios urinarios. Además, los cambios tubulares degenerativos estaban marcadamente presentes en el PCT. Las células tubulares necróticas exhibieron vacuolización citoplasmática con células epiteliales descamadas dentro de la luz tubular. Además, ACR indujo una infiltración celular inflamatoria masiva con congestión de los vasos sanguíneos glomerulares. Fibrosis inducida por acrilamida que se estableció mediante un depósito 9-veces mayor de fibras de colágeno en la membrana basal de los capilares glomerulares. Tales fibras de colágeno pueden ser el resultado del factor de crecimiento epidérmico que estimula la proliferación de fibroblastos y la síntesis de colágeno [14].Las membranas basales delrenalcorpúsculos yrenalLos túbulos del grupo ACR mostraron una intensa reacción PAS (42 por ciento más alta que el grupo de control). El engrosamiento de la membrana basal tubular es una característica común de la atrofia y puede estar asociado con hialinosis [14]. El engrosamiento también es una posible causa de la reducción del transporte activo en PCT que causa microalbuminuria [14].
El borde en cepillo del PCT en el grupo ACR se interrumpió. La pérdida del borde en cepillo es el signo morfológico más temprano de alteración de la función tubular proximal [17, 27]. Además, la pérdida del borde en cepillo afecta el poder de reabsorción de la PCT con pérdida de glucosa, sales y grandes cantidades de agua en la orina [17, 27]. Esto explica principalmente los cambios serológicos observados (los niveles séricos elevados de urea y creatinina). El diámetro de la PCT aumentó un 31 por ciento en el grupo ACR, que en su mayoría es un mecanismo compensatorio para conservar lafunción renal [15].
El estrés oxidativo es el principal mecanismo patogénico a través del cual la ACR inducedaño renal. El estrés oxidativo es un cambio en el equilibrio entre oxidantes y antioxidantes a favor de los oxidantes [3]. Muchos investigadores demostraron el papel del ACR en el estrés oxidativo sobre elriñón[23]. Los valores del marcador oxidativo (MDA) en el grupo ACR aumentaron 14-veces, mientras que el marcador antioxidante (GSH) disminuyó 13-veces. El estrés oxidativo crea radicales libres de oxígeno (ROS) que reaccionan con numerosas biomoléculas en la célula, lo que eventualmente conduce al daño oxidativo [16]. ROS es eliminado por varios mecanismos de defensa celular que involucran no enzimáticos (GSH). Las proteínas GSH peroxidasa convierten el peróxido de hidrógeno en agua y lípidos.peróxidos a sus respectivos alcoholes [30]. El uso prolongado de ACR disminuyó las actividades GSH. Esta consecuencia en la producción aumentada de O2– y H2O2 que da como resultado la producción de OH– [11]. Muchos investigadores creyeron que el nivel de MDA es prueba suficiente de estrés oxidativo [13] y un valor más alto de MDA reveló un aumento en la peroxidación de lípidos.
La apoptosis es también otro mecanismo patogénico a través del cual la ACR indujorenalafecto [23]. La reacción BAX aumentó 4.5-veces en el grupo ACR. BAX ejerce actividad proapoptótica [29]. El resveratol, como uno de los flavonoides, otorga una alta protección a lariñóncomo los glomérulos yrenallos túbulos eran casi normales. En comparación con el grupo ACR, el contenido de fibras de colágeno y la reacción PAS delrenaltúbulos disminuyó en un 70, 19 por ciento. Sumando, los niveles de creatinina y urea se redujeron en un 51, 47 por ciento. Muchos investigadores registraron el efecto protector antioxidante exógeno de RVS sobre elriñón[21]. RVS indujo dicho papel protector a través de su efecto antioxidante, ya que el nivel de MDA disminuyó en un 45 por ciento, mientras que el nivel de GSH aumentó en un 83 por ciento en comparación con el grupo ACR. El RVS previene la producción de superóxido a partir de la óxido nítrico sintasa endotelial desacoplada y aumenta la expresión de varias enzimas antioxidantes [30]. La actividad antioxidante de muchos flavonoides se debe a la eliminación directa de radicales libres de oxígeno o especies de oxígeno excitadas, así como a la inhibición de enzimas oxidativas que producen ROS [26]. Otro mecanismo protector del RVS es a través de su efecto antiapoptótico. Con el uso de RVS, el porcentaje de área de las células BAX inmunopositivas disminuyó un 56 por ciento en comparación con el grupo ACR.
CONCLUSIONESEn conclusión, la ACR provoca trastornos estructurales y funcionales delriñón. induceDaño en el riñóna través del estrés oxidativo y la apoptosis. Con el uso de RVS, lo normalriñónla arquitectura se conservó con pequeños cambios estructurales. RVS ejerce su protección a través de sus características antiapoptóticas y antioxidantes.
