Efectos protectores del ácido alfa-lipoico contra la mucositis gastrointestinal inducida por 5-fluorouracilo en ratas, parte 1
Jul 04, 2023
Abstracto: El ácido alfa lipoico (ALA) se utiliza ampliamente en fórmulas multivitamínicas y productos antienvejecimiento. El propósito de este estudio fue investigar los posibles beneficios protectores del ALA en la mucositis gastrointestinal inducida por 5-fluorouracilo (5-FU) en ratas albinas Wistar. Se extirparon tejidos del estómago, intestino delgado e intestino grueso y se obtuvieron sueros sanguíneos para identificar índices bioquímicos como TNF-, IL-1 , MDA, GPx, SOD, MMP-1, {{ 8}}, -8 y TIMP-1. También se realizó un estudio histopatológico. Los resultados revelaron niveles elevados de TNF-, IL-1, MDA, MMP-1, -2, -8 y TIMP-1 en ambos tejidos y sueros. y estos valores cayeron dramáticamente después del tratamiento con ALA. Las actividades reducidas de SOD y GPx en los grupos con mucositis se revirtieron en los grupos tratados con ALA. El daño producido por la mucositis en el estómago y el intestino delgado retrocedió en el grupo tratado con ALA, según evaluación histopatológica. En consecuencia, la implementación de la suplementación con ALA en la terapia 5-FU puede actuar como una intervención protectora para los pacientes de cáncer con mucositis gastrointestinal. A la luz de los hallazgos, el ALA, un antioxidante derivado de los alimentos con propiedades pleiotrópicas, puede ser un tratamiento eficaz para la mucositis gastrointestinal inducida por 5-FU y prevenir el estrés oxidativo, la inflamación y el daño tisular en pacientes con cáncer que reciben {{ 24}}Terapia FU.
El glucósido de cistanche también puede aumentar la actividad de SOD en los tejidos del corazón y el hígado, y reducir significativamente el contenido de lipofuscina y MDA en cada tejido, eliminando de manera efectiva varios radicales de oxígeno reactivos (OH-, H₂O₂, etc.) y protegiendo contra el daño causado en el ADN. por radicales OH. Los glucósidos de feniletanoide de Cistanche tienen una fuerte capacidad de eliminación de radicales libres, una mayor capacidad reductora que la vitamina C, mejoran la actividad de SOD en la suspensión de esperma, reducen el contenido de MDA y tienen un cierto efecto protector sobre la función de la membrana del esperma. Los polisacáridos de cistanche pueden mejorar la actividad de SOD y GSH-Px en eritrocitos y tejidos pulmonares de ratones experimentalmente senescentes causados por D-galactosa, así como reducir el contenido de MDA y colágeno en pulmón y plasma, y aumentar el contenido de elastina, han un buen efecto de eliminación de DPPH, prolonga el tiempo de hipoxia en ratones senescentes, mejora la actividad de SOD en suero y retrasa la degeneración fisiológica del pulmón en ratones experimentalmente senescentes Con degeneración morfológica celular, los experimentos han demostrado que Cistanche tiene una buena capacidad antioxidante y tiene el potencial de ser un fármaco para prevenir y tratar las enfermedades del envejecimiento de la piel. Al mismo tiempo, el echinacósido en Cistanche tiene una capacidad significativa para eliminar los radicales libres DPPH y puede eliminar las especies reactivas de oxígeno, prevenir la degradación del colágeno inducida por los radicales libres y también tiene un buen efecto de reparación en el daño del anión de radicales libres de timina.
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1. Introducción
El ácido alfa lipoico (ALA) está presente en una amplia gama de alimentos, incluidas las verduras (espinacas, brócoli, tomates) y las carnes (especialmente las vísceras), así como en varios suplementos nutricionales [1,2]. El ALA tiene numerosos efectos antioxidantes, incluida la activación de mecanismos antioxidantes endógenos y la quelación de iones metálicos como el hierro, el zinc y el cobre [3,4]. Como molécula de organosulfuro, el ALA puede eliminar las especies reactivas de oxígeno (ROS) y aumentar la actividad de las enzimas antioxidantes de los tejidos, como la glutatión peroxidasa (GPx) y la superóxido dismutasa (SOD) [5–7]. Debido a sus propiedades antioxidantes, se ha descubierto que el ALA reduce la muerte celular dependiente de ALA en el cáncer de pulmón [8], cáncer de mama [9] y cáncer de colon [10]. Además, investigaciones anteriores han demostrado que el ALA posee propiedades antiinflamatorias [11–16]. ALA funciona para reducir la inflamación mediante la modulación de la expresión de citocinas inflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-) y la interleucina-1 (IL-1) [17,18]. Los beneficios farmacológicos del ALA se han probado en una amplia variedad de campos relacionados con la medicina, incluidos modelos cardiovasculares, neuroprotectores, cognitivos y antienvejecimiento [19].
El cáncer es la principal causa de mortalidad en todos los países y un impedimento importante para la longevidad [20]. Los efectos secundarios de los medicamentos quimioterapéuticos son uno de los factores debilitantes más importantes en la lucha contra el cáncer, y la mucositis es una de las enfermedades más frecuentes que se encuentran en los pacientes con cáncer [21]. La mucositis es una condición inflamatoria patológica caracterizada por ulceración e inflamación de la mucosa del sistema gastrointestinal [22]. La mucositis aumenta el uso de analgésicos opioides debido al dolor y acelera la transición a la nutrición parenteral total debido a problemas nutricionales [23]. La mucositis y las dificultades relacionadas con la mucositis disminuyen la calidad de vida del paciente, mientras que el desarrollo de condiciones potencialmente mortales y las respuestas negativas a la terapia son motivo de preocupación debido al tratamiento deficiente de la lesión [24].
El fármaco quimioterapéutico que se utiliza con mayor frecuencia en las neoplasias malignas gastrointestinales es el análogo de pirimidina 5-fluorouracilo (5-FU). 5-FU ejerce sus efectos anticancerígenos al inhibir la timidilato sintasa (TS) e integrar sus metabolitos en el ARN y el ADN [25]. Sin embargo, este agente induce mucositis gastrointestinal, un efecto secundario debilitante grave [26]. En particular, la degradación del equilibrio oxidante-antioxidante, el aumento de los niveles de citoquinas proinflamatorias y la actividad de las enzimas proteolíticas juegan un papel importante en el desarrollo de estos efectos adversos. Aunque se han utilizado medicamentos antioxidantes y antiinflamatorios en un intento de abordar este problema, aún no se ha identificado un método terapéutico particularmente sólido [27,28].
Hasta la fecha, varios estudios han informado sobre el uso de 5-FU y ALA juntos en diferentes tipos de cáncer; estos incluyen tumores cervicales y colorrectales [29,30]. Además, serían ventajosos los medicamentos auxiliares que podrían incorporarse en los procedimientos de tratamiento para evitar que los pacientes con cáncer sufran los efectos adversos de la mucositis gastrointestinal inducida por 5-FU. Así, el propósito de este estudio fue determinar los efectos biológicos del uso de ALA en ratas con un modelo de mucositis creado por 5-FU, además de examinar su posible uso como agente candidato en protocolos de tratamiento.
2. Materiales y métodos
2.1. animales
Los animales fueron tomados de las Unidades de Experimentos con Animales de la Universidad del Cercano Oriente. Las ratas (Wistar albinas, ambos sexos) se mantuvieron bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 h desde el inicio a una temperatura ambiente de 22 ± 2 ◦C en una instalación con humedad controlada (50 ± 5 por ciento). La alimentación fue ad libitum sin ninguna restricción a su comida estándar para ratas y agua potable. Las ratas se alojaron en una jaula de plexiglás (4 ratas por jaula con dimensiones de 60 × 40 × 40 cm). El protocolo de estudio fue autorizado por el Comité Ético de Experimentos con Animales Locales de la Universidad de Near East (Aprobación No. 2019/01 el 17 de enero de 2019 y 2020/11 el 27 de noviembre de 2020), y las pautas éticas mencionadas en la Declaración de Helsinki de 1964 y sus enmiendas posteriores. fueron seguidos.
Treinta y dos ratas Wistar Albino de ambos sexos que pesaban entre 200 y 250 g se distribuyeron en cuatro grupos de ocho ratas cada uno (n=8): grupos de control, ALA, mucositis y mucositis más ALA. El grupo de control recibió solo solución salina (SF) intraperitoneal (ip) una vez al día durante una semana. El grupo de ALA recibió solo ALA en una dosis de 100 mg/kg ip una vez al día durante una semana a partir del día 1 [31,32]. El grupo de Mucositis fue tratado con SF (ip) el día 1 y 400 mg/kg de 5-FU ip desde el día 2 hasta el final del experimento [33]. El grupo de mucositis más ALA recibió 100 mg/kg ip ALA el día 1 y 400 mg/kg ip 5-FU el día 2. Luego, se continuó con la administración de 100 mg/kg/día ip ALA hasta el final del experimento. . Los animales fueron monitoreados durante una semana sin experimentar mortalidad durante ese tiempo. Los animales de todos los grupos fueron sacrificados al final del período de investigación mediante la administración de una combinación de sobredosis de ketamina/xilazina. Los ensayos de laboratorio se realizaron en el Laboratorio de Diagnóstico y el Laboratorio de Histopatología del Animal Hospital, Near East University.
2.2. Recolección de Muestras de Sangre y Tejidos
Se obtuvieron muestras de sangre y se enviaron al laboratorio en tubos separadores de suero. Las muestras de suero se separaron a 2000 × g durante 10 min y se mantuvieron a -80 ◦C hasta su posterior análisis. Para eliminar el exceso de sangre, se recogieron tejidos de estómago, intestino delgado e intestino grueso y se lavaron con solución tampón de fosfato (pH=7,4). Luego, luego de ser entregados al laboratorio, se sometieron a un procedimiento de homogeneización. La homogeneización de tejidos se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante usando tampón RIPA (artículo n.° 10010263, lote n.° 0490889-1, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, EE. -Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) en hielo. Después de la homogeneización, las muestras se centrifugaron a 1600 × g durante 10 min a más 4 ◦C. Se utilizó la técnica de determinación de proteínas de Bradford para cuantificar los niveles de proteínas en muestras de tejido y, a continuación, los sobrenadantes se congelaron a -80 ◦C para su posterior investigación.
2.3. Mediciones de índices bioquímicos
Actividades de alanina transaminasa (ALT), aspartato transaminasa (AST), fosfatasa alcalina (ALP), lactato deshidrogenasa (LDH), lipasa (LIP), amilasa (AMY), creatinina, nitrógeno ureico en sangre (BUN), proteína total (TP) , y los niveles de albúmina se midieron como índices bioquímicos en muestras de suero utilizando un analizador químico clínico BS-240 VET automatizado (Mindray, Shenzhen, China).
2.4. Medición de citocinas en sueros y tejidos
Las concentraciones de TNF- e IL-1 en muestras de suero y tejido se midieron utilizando kits de ensayo de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) específicos para ratas disponibles en el mercado (ELR-TNF- y ELR-IL1 -, RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.
2.5. Medición de metaloproteinasas de matriz (MMP) e inhibidores tisulares de metaloproteinasa-1 (TIMP-1) en sueros y tejidos
Las MMP y TIMP-1, que están involucradas en una variedad de procesos biológicos, como el cáncer y la inflamación, se midieron tanto en homogeneizados de tejidos como en sueros utilizando las instrucciones del fabricante y las recomendaciones de ensayos ELISA específicos para ratas disponibles en el mercado (MMP{ {2}} E-EL-R0617; Elabscience, Wuhan, China; MMP-2 ELR-MMP2; MMP-8 ELR-MMP8; TIMP-1 ELR-TIMP-1 RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, EE. UU.). Las concentraciones séricas de MMP y TIMP-1 se expresaron como pg/mL, mientras que los niveles tisulares se expresaron como pg/mg de proteína.
2.6. Medición de malondialdehído (MDA), GPx y SOD en tejidos
Los niveles de MDA en los tejidos se evaluaron utilizando kits de ensayo disponibles comercialmente para determinar el estado de peroxidación de lípidos (TBARS Assay Kit, artículo n.º 10009055, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, EE. UU.). El principio de medida se basa en la reacción con ácido tiobarbitúrico (TBA) en agua hirviendo durante 60 min en medio ácido y la medida de la absorbancia de la mezcla de reacción a 532 nm (Ohkawa et al., 1979). Se usó un lector de microplacas sintonizable VersaMax para medir la absorbancia (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.). Las concentraciones de MDA en los tejidos se expresaron como nmol de MDA/mg de proteína.
En tejidos, la actividad de GPx y SOD se evaluó utilizando kits de ensayo listos para usar. (RANSEL RS505, RANSOD SD125, Randox Laboratories Ltd., Crumlin, Reino Unido) mediante el uso de un analizador químico clínico BS-240 VET automatizado (Mindray, Shenzhen, China). Las cantidades de GPx y SOD en las muestras de tejido (estómago, intestino delgado e intestino grueso) se expresaron como U/mg de proteína.
2.7. Evaluación Histopatológica
Los tejidos del estómago, intestino delgado e intestino grueso obtenidos inmediatamente después del período experimental se fijaron en formalina neutra al 10 por ciento (v/v) durante 24 h a temperatura ambiente. Después de la fijación, los tejidos se colocaron en un dispositivo de seguimiento de tejidos, Leica TP1020 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania). A continuación, los tejidos extraídos del dispositivo de seguimiento de tejidos se incluyeron en parafina. Se cortaron secciones de 5- µm de espesor de los tejidos con la ayuda de un micrótomo Leica RM2255 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania), y se realizó la tinción de rutina con hematoxilina y eosina (HE). Las secciones se examinaron histomorfológicamente con un microscopio óptico Leica DM500 junto con el sistema de análisis de imágenes digitales integrado Leica Microsystem Framework (Leica Application Suite versión 3.0 Serie 38132019, Leica ICC50 HD, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Nußloch, Alemania).
2.8. Análisis estadístico
Se utilizó el software GraphPad Prism para el análisis estadístico (versión 7.04, GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Todos los datos se expresaron como media ± desviación estándar (X ± SD). Se utilizó una prueba de análisis de varianza (ANOVA) para comparar grupos de datos, seguida de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Además, se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para comparar las puntuaciones histomorfológicas entre los grupos. Se consideró estadísticamente significativa una diferencia de p < 0,05.
3. Resultados
3.1. ALA afecta positivamente los índices bioquímicos
La Tabla 1 muestra la actividad de las enzimas séricas y las concentraciones de metabolitos. En comparación con el grupo de control, el grupo de mucositis tuvo niveles sustancialmente más altos de albúmina, ALT, AST, ALP, LDH, amilasa, lipasa, BUN, creatinina y TP (p < 0.05 –0.0001). Sin embargo, hubo una diferencia significativa en los niveles de albúmina, AST, ALT, ALP, LDH, BUN, creatinina, amilasa, BUN y creatinina entre el grupo de ALA más mucositis y el grupo de mucositis (p < 0,05–0,001). Los niveles de ALP, ALT, AST, LDH y amilasa también fueron sustancialmente diferentes entre los grupos de mucositis y ALA (p < 0,05–0,0001). En consecuencia, se observó que los niveles de enzimas hepáticas, enzimas pancreáticas y metabolitos se redujeron drásticamente en el grupo de mucositis cuando se agregó ALA al tratamiento.
3.2. ALA disminuye la producción de citocinas proinflamatorias
Los niveles de citoquinas proinflamatorias TNF- e IL-1 en muestras de suero, estómago, intestino delgado e intestino grueso se pueden ver en la Figura 1. Los niveles de TNF- e IL-1 en sueros y todos los tejidos de los animales en el grupo de Mucositis fueron significativamente más altos en comparación con los grupos Control, ALA y Mucositis más ALA (p < 0.05–0.0{ {17}}{{20}}1). Sin embargo, los niveles de TNF- e IL-1 en el suero y en todos los tejidos se redujeron significativamente en el grupo de Mucositis más ALA en comparación con el grupo de Mucositis (p < 0.05–0.0001). Entre los grupos Control y Mucositis más ALA, hubo una diferencia sustancial en los niveles de TNF- en el intestino delgado y grueso. (p < 0,01). También hubo diferencias significativas en los niveles de TNF- en el intestino grueso y delgado entre los grupos de ALA y Mucositis más ALA. (p < 0,01, p < 0,001, respectivamente). Además, hubo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos Control y Mucositis más ALA en términos de niveles de IL-1 en el estómago (p < 0,05). Por lo tanto, ALA pareció suprimir significativamente los niveles de citocinas proinflamatorias en la mucositis.
3.3. El tratamiento con ALA reduce la peroxidación lipídica y aumenta las actividades de las enzimas antioxidantes en los tejidos
Se cuantificaron los niveles de MDA, GPx y SOD para evaluar la peroxidación y el estado antioxidante a nivel tisular (Figura 2). Los niveles de MDA en el estómago, el intestino delgado y el intestino grueso del grupo con mucositis fueron significativamente más altos que en los grupos de control, ALA y mucositis más ALA (p < 0.05–0 .0001). Además, los niveles de MDA en el intestino grueso del grupo Mucositis más ALA fueron sustancialmente diferentes de los de los grupos Control y ALA (p < 0,0001).
Las ratas de los grupos de control y ALA tenían niveles de SOD significativamente más altos en todos los tejidos que las ratas del grupo de mucositis (p < {{0}}.05–0.{{8 }}{{10}}01). Los niveles de SOD en las muestras de intestino grueso fueron significativamente diferentes en los grupos de ALA y Mucositis más ALA (p < 0,01). En las muestras de estómago, los niveles de SOD fueron significativamente más bajos en los grupos de ALA y Mucositis más ALA (p < 0,05). Además, los niveles de SOD en el intestino delgado de las ratas del grupo Mucositis fueron sustancialmente más bajos que los niveles de SOD en el grupo ALA (p < 0,05). Sin embargo, los niveles de SOD en el estómago y el intestino grueso de los animales en los grupos Mucositis y Mucositis más ALA fueron sustancialmente diferentes (p < 0,05–0,0001).
3.4. El tratamiento con ALA aumenta los niveles de MMP tisulares y TIMP-1
Las actividades de MMP{{0}}, MMP-2, MMP-8 y TIMP-1 (Tabla 2) en suero, estómago, intestino delgado e intestino grueso fueron significativamente mayor en el grupo Mucositis en comparación con los grupos Control y ALA (p < 0.05–0.0001). El aumento en los niveles de MMP-1, MMP-2, MMP-8 y TIMP-1 en los sueros y el estómago, el intestino delgado y el intestino grueso de las ratas con mucositis se suprimieron significativamente en Mucositis más ALA en ratas (p < 0,05–0,0001), aunque no hubo diferencias significativas en los niveles séricos de MMP-8 entre los grupos Mucositis más ALA y Mucositis.
