La espermidina alivia el daño mitocondrial miocárdico de los recién nacidos inducido por hipoxia intrauterina en ratas mediante la inhibición del estrés oxidativo y la regulación del control de calidad mitocondrial Parte 1

Abstracto

Fondo: La hipoxia intrauterina (IUH) aumenta el riesgo de enfermedades cardiovasculares en la descendencia. Como eliminador de especies reactivas de oxígeno (ROS), la poliamina espermidina (SPD) es esencial para la supervivencia y el crecimiento embrionario y fetal. Sin embargo, se requieren más estudios sobre la protección de SPD y los mecanismos para el daño cardíaco inducido por IUH en la descendencia.

El glucósido de cistanche también puede aumentar la actividad de SOD en los tejidos del corazón y el hígado, y reducir significativamente el contenido de lipofuscina y MDA en cada tejido, eliminando de manera efectiva varios radicales de oxígeno reactivos (OH-, H₂O₂, etc.) y protegiendo contra el daño causado en el ADN. por radicales OH. Los glucósidos de feniletanoide de Cistanche tienen una fuerte capacidad de eliminación de radicales libres, una mayor capacidad reductora que la vitamina C, mejoran la actividad de SOD en la suspensión de esperma, reducen el contenido de MDA y tienen un cierto efecto protector sobre la función de la membrana del esperma. Los polisacáridos de cistanche pueden mejorar la actividad de SOD y GSH-Px en eritrocitos y tejidos pulmonares de ratones experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactosa, así como reducir el contenido de MDA y colágeno en pulmón y plasma, y ​​aumentar el contenido de elastina, han un buen efecto de eliminación de DPPH, prolonga el tiempo de hipoxia en ratones senescentes, mejora la actividad de SOD en suero y retrasa la degeneración fisiológica del pulmón en ratones experimentalmente senescentes Con degeneración morfológica celular, los experimentos han demostrado que Cistanche tiene una buena capacidad antioxidante y tiene el potencial de ser un fármaco para prevenir y tratar las enfermedades del envejecimiento de la piel. Al mismo tiempo, el echinacósido en Cistanche tiene una capacidad significativa para eliminar los radicales libres DPPH y tiene la capacidad de eliminar las especies reactivas de oxígeno y prevenir la degradación del colágeno inducida por los radicales libres, y también tiene un buen efecto de reparación en el daño del anión de radicales libres de timina.

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Objetivos: Este estudio tuvo como objetivo investigar los efectos preventivos del tratamiento prenatal SPD sobre el daño cardíaco inducido por IUH en ratas recién nacidas y su mecanismo subyacente relacionado con las mitocondrias.

Métodos: El modelo de IUH en ratas se estableció mediante la exposición al 10 por ciento de O2 siete días antes del término. Mientras tanto, durante siete días, las ratas preñadas recibieron SPD (5 mg.kg-1.d-1; ip). Las ratas descendientes de un día se sacrificaron para evaluar varios parámetros, incluido el desarrollo del crecimiento, el daño cardíaco, la proliferación de cardiomiocitos, el estrés oxidativo miocárdico, la apoptosis celular y la función mitocondrial, y tienen un control de calidad mitocondrial (MQC), que incluye mitofagia, biogénesis mitocondrial y fusión/fisión mitocondrial. En experimentos in vitro, los cardiomiocitos primarios se sometieron a hipoxia con o sin SPD durante 24 horas.

Resultados: IUH disminuyó el peso corporal, el peso del corazón, la expresión de Ki67 cardíaco, la actividad de SOD y los niveles de CAT y adenosina 5'-trifosfato (ATP) y aumentó la expresión de BAX/BCL2 y el número de núcleos positivos para TUNEL. Además, la IU también causó anomalías en la estructura mitocondrial, disfunción y disminución de la mitofagia (disminución del número de mitofagosomas), disminución de la biogénesis mitocondrial (disminución de la expresión de SIRT-1, PGC-1 , NRF-2 y TFAM) y condujo a un desequilibrio de fisión/fusión (aumento del porcentaje de fragmentos mitocondriales, aumento de la expresión de DRP1 y disminución de la expresión de MFN2) en el miocardio. Sorprendentemente, el tratamiento con SPD normalizó las variaciones en los parámetros inducidos por IUH. Además, SPD también previno la acumulación de ROS inducida por hipoxia, la disminución del potencial de membrana mitocondrial y la disminución de la mitofagia en los cardiomiocitos.

Conclusión: El tratamiento con SPD materna causó daño cardíaco inducido por IU en ratas recién nacidas al mejorar la función mitocondrial del miocardio a través de la antioxidación y la antiapoptosis, y al regular el MQC.

1. Antecedentes

Los estudios epidemiológicos y en animales indican que un ambiente intrauterino adv se está asociado con un mayor riesgo de enfermedades cardiovasculares en la edad adulta (1). La hipoxia prenatal, el ambiente intrauterino adverso más común, puede hacer que el feto sea incapaz de realizar su potencial de crecimiento determinado genéticamente, lo que se manifiesta como retraso del crecimiento y lesión de la función orgánica en la descendencia(2). La hipoxia fetal crónica a menudo es el resultado de un embarazo con mayor resistencia vascular placentaria, como preclampsia, embarazos entre embarazos a gran altura o enfermedades respiratorias maternas. Más significativamente, un tercio de ellos se ven afectados por el síndrome de hipoventilación por apnea obstructiva del sueño (SAHOS) al final del embarazo, y también se asocia con el desarrollo del síndrome de hipertensión gestacional. El cambio fisiopatológico más crítico del SAHS es la hipoxia crónica intermitente (3, 4). En varios modelos animales, la hipoxia intrauterina (IUH) conduce a una reducción de la eficiencia cardíaca, disfunción diastólica y sistólica, crecimiento hipertrófico, disminución de la proliferación de cardiomiocitos y retraso en la maduración de los cardiomiocitos en el corazón fetal y neonatal, lo que aumenta el riesgo de trastornos cardíacos en la descendencia adulta. 5). El efecto de programación de la hipoxia crónica puede explicar principalmente el mecanismo en las etapas críticas del desarrollo del corazón, lo que conduce a un aumento del estrés oxidativo cardíaco y al aumento de la apoptosis celular en la descendencia (6-9). El concepto de programación del desarrollo tiene sentido porque nuestra fisiología es mucho más maleable y plástica durante los primeros años de vida. La condición intrauterina determina y programa los conceptos de fisiología y metabolismo que nuestra vida. En consecuencia, la respuesta adaptativa fetal a la IU conduce al desarrollo de enfermedades cardiovasculares en adultos (10). Las mitocondrias son orgánulos complejos que juegan un papel crucial en la generación de energía celular y en una miríada de eventos de señalización celular. La integridad estructural y funcional de las mitocondrias es fundamental para la supervivencia de los cardiomiocitos y, cuando se ve comprometida, la interrupción de la homeostasis mitocondrial da como resultado el desarrollo de enfermedades de carac. Recientemente, varios estudios se han centrado en el papel de la disfunción mitocondrial inducida por hipoxia prenatal crónica en la mediación del daño cardíaco en la descendencia. Se ha informado que la función mitocondrial-iratoria se vio alterada y la expresión de varias reglas mitocondriales alteradas en el corazón perinatal expuesto a la IU (11). Además, la IU conduce a una disminución de la actividad enz e del complejo mitocondrial y a una disfunción del corte del corazón en la descendencia final después de la isquemia miocárdica (12). En consecuencia, este estudio tuvo como objetivo descubrir el vínculo molecular entre la hipoxia prenatal, el estrés oxidativo, la disfunción mitocondrial y la lesión cardíaca en la nueva descendencia (13).

El desarrollo y la maduración de este sistema mitocondrial de alto volumen en el miocardio ocurren principalmente en las etapas de desarrollo perinatal y posnatal, principalmente debido al cambio metabólico cardíaco al usar glucosa o ácidos grasos para la generación de adenosina 5'-trifosfato (ATP) después del nacimiento. (14). La evidencia emergente sugiere que los mecanismos de control de calidad mitocondrial (MQC) son determinantes críticos para la maduración de los cardiomiocitos (15). El control de calidad mitocondrial, que incluye principalmente la biogénesis mitocondrial, la mitofagia junto con la dinámica, una red reguladora finamente ajustada, orquesta la cantidad y calidad de las mitocondrias y mejora la función mitocondrial y la supervivencia de los cardiomiocitos en condiciones de estrés (16). El coactivador 1 (PGC-1) ​​de los receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPAR) desempeña un papel fundamental en el impulso de la biogénesis mitocondrial y la función en el corazón (17). Proliferadores de peroxisomas-activan los receptores coactivadores 1/(-/-) los corazones de ratones exhiben las firmas del defecto de maduración y anormalidad severa en la función y densidad mitocondrial (18). Además, la eliminación del mediador de mitofagia Parkin impide la maduración morfológica y funcional de las mitocondrias en la etapa neonatal (19). Las mitocondrias son orgánulos altamente dinámicos, que experimentan constantes eventos de fisión y fusión asociados con su función. En el período embrionario tardío, la ablación genética específica de car ac de la fusión mitocondrial pro en MFN1 y MFN2 en ratones muestra una disfunción mitocondrial grave después del nacimiento y desarrolla cardiomiopatía (20). Sorprendentemente, un estudio reciente reveló que la hipia crónica alteraba la dinámica mitocondrial en el cerebro anterior del feto de cerdo (21). En consecuencia, MQC puede actuar como un punto focal en el desarrollo de lesiones de miocardio en la descendencia neonatal IUH. Sin embargo, se sabe poco sobre los efectos de la hipoxia prenatal en el sistema cardíaco MQC neonatal y el efecto de la disfunción MQC en la salud cardíaca neonatal. Este estudio se hizo cargo de esta misión para explorar el mecanismo relacionado con las mitocondrias del daño miocárdico inducido por IUH en la nueva descendencia y explorar más a fondo las estrategias preventivas para reducir la lesión cardíaca de IUH.

Las poliaminas (PA), incluidas la putrescina (PU), la espermidina (SPD) y la espermina (SP), están presentes en casi todos los organismos vivos y son esenciales para la supervivencia, el crecimiento y el desarrollo embrionario y fetal (22-24) . Los estudios encontraron que las ovejas expuestas a IU pueden mejorar la displasia embrionaria al complementar las poliaminas exógenas (25, 26). Además, el creciente cuerpo de literatura indica el papel de las poliaminas en la eliminación de radicales libres y la protección del ADN, las proteínas y los lípidos del daño perjudicial del estrés oxidativo. También se revela que la suplementación con poliamina aumenta la vida útil en organismos modelo a través de pro-ensayos antioxidantes, antiinflamatorios e inductores de mitofagia (27-29). Estudios recientes han documentado que la suplementación con SPD en la dieta es cardioprotectora y prolonga la vida tanto en ratones como en humanos al estimular la mitofagia y la respiración mitocondrial y mejorar la función cardíaca (30, 31). Lo que es más importante, informamos anteriormente que la exposición hipóxica materna durante las últimas etapas del desarrollo fetal resultó en la disminución del análisis y aumento del catabolismo de poliaminas en el tejido carac de ratas recién nacidas. SPD previno la lesión cardíaca en ratas crías ven-day expuestas a IU al inhibir la actividad mental mitocondrial (32).

2. Objetivos

En este estudio, se plantea la hipótesis de que la IU induce déficits en la función y la estructura mitocondrial al aumentar el estrés oxidativo y destruir el mecanismo MQC en el corazón del recién nacido, y se supone que el tratamiento con SPD materna en el útero reduce la lesión miocárdica al disminuir el programa de desarrollo de las mitocondrias. Este estudio puede contribuir al desarrollo de estrategias preventivas o terapéuticas para la descendencia IUH para prevenir enfermedades cardiovasculares en adultos.

3. Métodos

3.1. animales

Las ratas Wistar macho y hembra (3 meses de edad) se adquirieron del Departamento de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Harbin. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Revisión de Ética de la Universidad Médica de Harbin (China), y todos los experimentos se realizaron según las pautas de los Institutos Nacionales de Salud. Las ratas con una proporción de macho a hembra de 2:1 se colocaron al azar en una jaula para el apareamiento. Se realizaron frotis vaginales al día siguiente para detectar la presencia de espermatozoides en tapones vaginales o frotis vaginales, que se confirmó como día cero de embarazo. Las ratas preñadas se mantuvieron en una habitación con humedad controlada (60 por ciento) y temperatura controlada (21 grados), y el ciclo de luz-oscuridad fue de 12:12 horas.

3.2. Modelo de hipoxia intrauterina

Desde el día 15 hasta el 21 de gestación, las ratas del grupo de hipoxia (n=10) se colocaron en una cámara de plexiglás cerrada, se les inyectó aire y nitrógeno y se controlaron con un analizador de oxígeno (Pro OX12{{13 }}; BioSpherix, Nueva York, EE. UU.), e inhalado con un contenido de oxígeno del 10 por ciento durante cuatro horas al día. Las muestras de sangre arterial se tomaron de la arteria femoral derecha, se midieron los valores de pH y gas en sangre para mantener la presión parcial de oxígeno arterial de 50 - 55 mmHg, la saturación de oxígeno en sangre se mantuvo en 80 - 85 por ciento, y se realizaron procedimientos específicos como se describió previamente (32). Las ratas hembra experimentales se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: grupo de control (control), grupo de hipoxia intrauterina (Hpx), grupo de hipoxia intrauterina más espermidina (Hpx-Spd) y grupo de hipoxia intrauterina más espermidina más inhibidor (Hpx-Spd-DFMO ). A seis ratas por grupo se les inyectó por vía intraperitoneal el día 15 - 21 del embarazo. A las ratas se les administró solución salina al 0,9 % (1 ml/kg/d) en los grupos de control y HPx, SPD (5 mg/kg/d) en el grupo HPx-Spd y SPD (5 mg/kg/d) y difuorometía. -L-ornitina (DFMO, un inhibidor de la enzima clave de la síntesis de poliaminas ODC) (5 mg/kg/d) en el grupo Hpx-Spd-DFMO, respectivamente. Después del parto, se sacrificaron recién nacidos de 1-días y se extrajeron sus corazones para estudios experimentales de seguimiento.

3.3. Análisis histológico

El tejido del ventrículo izquierdo de las ratas se cortó en un grosor de < 1 cm, se fijó con paraformaldehído al 4 por ciento, se deshidrató con alcohol y se incluyó en parafina. La parafina incrustada se cortó en rodajas de 5 mm de espesor, luego se secó a una temperatura de horno constante de 60 grados, se desparafina con xileno y se tiñó con hematoxilina-eosina (HE). Se observaron los cortes de tejido para evaluar los cambios en la morfología y las estructuras cardíacas con un microscopio óptico (Eclipse E200; Nikon, Tokio, Japón).

3.4. Análisis de inmunofluorescencia

La tinción de inmunofluorescencia Ki67 se realizó como se describió anteriormente (33). Brevemente, el tejido del ventrículo izquierdo de las ratas se fijó en formalina al 4 por ciento, embebido en parafina; primero se completaron el desparafinado, la hidratación y la reparación de antígenos. Esos tejidos se bloquearon con 0.5 por ciento de albúmina de suero bovino durante 2 horas y luego se incubaron con anticuerpo monoclonal de conejo Ki67 (1: 100, AF1738, Beyotime, China) a 4 grados durante la noche. Después de lavar con PBS, el tejido se incubó con IgG anti-conejo de cabra marcada con Alexa fluor (1: 500, A 0468, Beyotime, China) y se contrastó con DAPI para núcleos. Las imágenes fueron visualizadas y escaneadas bajo microscopía confocal láser (OLYMPUS, FV1000, Japón). El software se utilizó para analizar la colocalización de las imágenes fusionadas.

3.5. Cuantificación de Fibrosis

La fibrosis cardíaca se evaluó mediante la tinción tricrómica de Masson. Como se describió anteriormente, las secciones de tejido cardíaco de las ratas recién nacidas se desparafinaron e hidrataron mediante métodos estándar y luego se tiñeron con tricrómico de Masson de acuerdo con los protocolos. Se usaron dos secciones transversales no adyacentes para cada corazón. El porcentaje de área fibrótica en el área miocárdica total del ventrículo izquierdo se analizó usando el software ImageJ, vl.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.6. Mediciones de células apoptóticas y etiquetado de dUTP Nick End mediado por TdT

Se usó un ensayo de marcaje de extremos de mella de dUTP mediado por TdT (TUNEL) para determinar el número de células apoptóticas en los corazones de ratas neonatales de un día de edad. Los tejidos cardíacos se trataron siguiendo nuestro procedimiento descrito anteriormente utilizando un kit de detección de muerte celular (Roche, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se evaluaron tres portaobjetos de cada bloque para determinar el porcentaje de células apoptóticas. Se examinaron aleatoriamente cuatro campos de portaobjetos con un aumento de 200x. En total, se contaron 100 células en cada campo.

3.7. Medición de la actividad enzimática antioxidante

La actividad de superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) se midió utilizando kits comerciales (SOD: A001-3- 1 y CAT: A007-1-1; Jiancheng Bio. Institute, Nanjing, China) con un espectrofotómetro (Perkin- Elmer, Norwalk, CT, Estados Unidos). De acuerdo con las instrucciones del fabricante, se completó la operación y se midió la concentración de proteína utilizando el método del ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, Estados Unidos) con albúmina de suero bovino (BSA) como patrón (34).

3.8. Medición del contenido de adenosina 5'-trifosfato

El contenido de ATP en el tejido cardíaco se midió utilizando un kit de ensayo de ATP (S0026B, Beyotime, Bio. Institute, China). De acuerdo con las instrucciones del fabricante, el lisado se agregó en proporción al peso del tejido, se homogeneizó con un homogeneizador de vidrio y luego se centrifugó a 4 grados 12000 g. Se tomó el sobrenadante y se detectó el contenido de ATP en cada muestra con un luminómetro (NanoDrop, Nanodrop2000, Thermo, USA) kit BCA (P0012s, Beyotime, Bio. Institute, China). Se usó el método del ácido bicinconínico para determinar la concentración de proteína y luego convertir la concentración de ATP en nmol/g de proteína.

3.9. Microscopio de transmisión por electrones

El tejido apical cardíaco se diseccionó en trozos pequeños de aproximadamente 1 mm × 1 mm × 1 mm y luego se fijó en tampón de fosfato de glutaraldehído a 4 grados. Después de la deshidratación, el remojo, la inclusión y la tinción de rutina, se realizaron las secciones ultrafinas de 50 - 70 nm. La ultraestructura del tejido cardíaco se observó bajo un microscopio electrónico de transmisión (TEM) y se fotografió (H600 Hitachi, Tokio, Japón). Las mitocondrias individuales y los miofilamentos se mapearon bajo la condición de aumento de 10000 veces con el software Image J versión 1.80 (Institutos Nacionales de Salud), y se midieron sus áreas de cada corazón (35). Mientras tanto, se identificaron fragmentos mitocondriales < 1 µm3, que no estaban divididos (generalmente redondos), y se contó el porcentaje promedio de fragmentos mitocondriales en el campo de visión utilizando el índice de fragmentación mitocondrial (MFI).

3.10. Aislamiento mitocondrial

Las mitocondrias se aislaron a 4 grados usando centrifugación diferencial con un kit de aislamiento de mitocondrias (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). Brevemente, se cortó tejido cardíaco fresco en trozos de tejido y se centrifugó con 10 volúmenes de PBS preenfriado, se descartó el sobrenadante, se digirió el precipitado con tripsina durante 20 min, se centrifugó el tampón de aislamiento A agregado, se transfirió el sobrenadante a otro tubo, se centrifugó nuevamente y la fracción precipitada fue la mitocondria aislada. El sedimento mitocondrial cardíaco final se resuspendió en tampón de homogeneización, se almacenó en hielo y se usó para experimentos sobre la función de respiración mitocondrial dentro de las 4 h.

3.11. Medición del Consumo de Oxígeno Mitocondrial

El consumo de oxígeno mitocondrial se midió mediante un electrodo de oxígeno tipo Clark (Hansatech Instruments, Norfolk, Reino Unido) en un tampón de respiración mitocondrial. Se usaron piruvato (5 mM) y malato (5 mM) como sustrato para mitocondrias que contenían complejo I a la concentración final de 500 µg de proteína/ml. Se midió el consumo de oxígeno estimulado por ADP (respiración en estado 3) en presencia de ADP 200 µM, y se controló el consumo de oxígeno independiente de ADP (respiración en estado 4). El índice de control respiratorio (RCR, estado 3 dividido por el estado 4) refleja el consumo de oxígeno por fosforilación (acoplamiento). Los procedimientos continuaron, como se describió previamente (36).

3.12. Análisis de Western Blot

La muestra de tejidos cardíacos se recogió y almacenó a -80 grados. Los tejidos cardíacos del ventrículo izquierdo congelados se homogeneizaron en tampón de lisis RIPA enfriado con hielo (Beyotime Inc., Shanghái, China P0013B). Las concentraciones de proteínas se cuantificaron utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime Inc., Shanghai, China P0006C). Las muestras que contenían proteína total se separaron mediante SDS-PAGE al 10 % (p/v) y se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anticuerpos para GAPDH (1:2000,10494-1-AP), MFN2 (1:1000,12186-1-AP), SIRT-1 (1:1000,{{16 }}AP), NRF-2 (1:600,16396-1-AP), TFAM (1:1000,19998-1-AP) y BAX (1,1000,509599-2-Ig) se adquirieron de Proteintech (WuHan, China), BCL2 (1: 2000, sc-7382) y DRP1 (1:1000, sc-271583) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) y PGC -1 (1:1000, ab106814, Abcam, Cambridge, MA, Reino Unido). El anticuerpo secundario (IgG anti-conejo de cabra marcada con peroxidasa de rábano picante) era de Beyotime Corporation (Shanghai, China). Las intensidades de las bandas de proteína se cuantificaron utilizando un sistema de imágenes de gel de quimioluminiscencia Fluor Chem (Protein Simple, EE. UU.). La densidad óptica de las bandas de proteínas se analizó con el software Image J versión 1.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.13. Modelo de cardiomiocitos hipóxicos

Se aislaron y cultivaron cardiomiocitos de rata neonatal (NRMC) mediante métodos estándar, como se describió anteriormente (32). Brevemente, los corazones de las ratas recién nacidas de tres días se extrajeron, trituraron, cultivaron y luego se digirieron en 0.25 por ciento de tripsina y 0.02 por ciento de EDTA (Beyotime Biotechnology, Shanghái, China). Después de la centrifugación, los precipitados se transfirieron a DMEM suplementado con suero de ternera fetal al 10 por ciento (Biolot, Rusia) y se incubaron en aire húmedo que contenía 2 al 5 por ciento. Tres días después de la siembra, las células se colocaron en una cámara hipóxica de vidrio (Biospherix OxyCycler C42 , Redfield, NY), y se llenó con nitrógeno durante 8 min para descargar el oxígeno residual. Estos cardiomiocitos se dividieron aleatoriamente en los siguientes grupos: (1) Grupo de control (control), células cultivadas en condiciones normales de incubación; (2) grupo de hipoxia (Hpx), células colocadas en la cámara hipóxica durante 24 h y luego cultivadas normalmente durante 24 h; (3) grupo Hpx-Spd, células colocadas en la cámara hipóxica e incubadas con 10 µmol/L de SPD durante 24 h; (4) Grupo Hpx-SpdDFMO, células colocadas en una cámara hipóxica e incubadas con 10 µmol/L de SPD más 2 mmol/L de DFMO durante 24 h.

3.14. Medición de especies reactivas de oxígeno

La generación de ROS se midió mediante el ensayo de tinción con dihidroetidio (DHE) (Cat No. S0063, Beyotime, China). Brevemente, los cardiomiocitos primarios se incubaron con 5 µmol/L de DHE a 37 grados durante 30 min, se lavaron con PBS y luego se movieron bajo el microscopio para observar los cambios en la intensidad de la fluorescencia. Las imágenes se tomaron con un microscopio de fluorescencia Olympus FluoView FV1000 (Olympus Optical Co., Ltd., Takachiho, Japón) a una longitud de onda de excitación de 535 nm y la longitud de onda de emisión máxima fue de 610 nm, n > 20 células por grupo.

3.15. Determinación del potencial de la membrana mitocondrial

El colorante tetrametilrodamina etil éster (TMRE) está cargado positivamente y puede ubicarse selectivamente en las mitocondrias. Es ampliamente utilizado para determinar el potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm). En resumen, se añadió solución de trabajo de tinción de TMRE a una concentración de 200 µmol/L a los cardiomiocitos tratados agrupados, se mezcló completamente y se colocó en una incubadora de células a 37 grados durante 20 min. Se aspiró el sobrenadante y se lavaron las células con PBS y se trasladaron a un microscopio invertido para observar el cambio en la intensidad de la fluorescencia. La longitud de onda de excitación fue de 549 nm y la luz de emisión fue de 579 nm. La intensidad de la fluorescencia roja indicó el cambio de ∆Ψm, n > 20 células por grupo.

3.16. Experimento de localización mitocondrial y lisosomal

De acuerdo con las instrucciones, Mito-Tracker Green (NO.C1048, Beyotime, China) y Lyso-Tracker Red (NO.C1046, Beyotime, China) utilizaron el análisis de colocalización mitocondrial y lisosomal. Los NRCM se cargaron con MitoTracker Green FM 200 nM y LysoTracker Red 50 nM en HBSS durante 30 minutos antes de los experimentos, las células se lavaron con PBS y luego se obtuvieron imágenes de células usando un microscopio de fluorescencia Olympus FluoView FV1000. La línea láser de 488 nm se utilizó para excitar la fluorescencia de MitoTracker Green, medida entre 505 y 515 nm. Para LysoTracker Red se utilizó la línea láser de 577 nm con una medida de 590 nm. La superposición de intensidad de píxeles rojos y verdes se determinó usando software de cuantificación en el microscopio Nikon Eclipse, n > 20 células por grupo.

3.17. Análisis estadístico

Todos los datos de los grupos experimentales se compararon mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Bonferroni con el software GraphPad Prism versión 8 (GraphPad Software Inc., La, Jolla.CA) y el software SPSS versión 17.1 (SPSS, Chicago, IL, Estados Unidos). Estados). Los datos se expresaron como media ± SEM, y el nivel de significación se fijó en P < 0.05.

4. Resultados

4.1. Descendencia y características del corazón

Se midió el peso corporal (BW) y el peso del corazón (HW), y se calculó la relación HW a BW (HW/BW) (Figura 1). Los resultados mostraron que el BW y el HW de las ratas recién nacidas disminuyeron, y su HW/BW aumentó debido a la hipoxia intrauterina. En comparación con el grupo IUH, el BW y el HW de las ratas neonatales en el grupo SPD aumentaron (P < 0.05), y el HW/BW disminuyó (P < 0. 05); En comparación con el grupo SPD, tanto el BW como el HW del grupo de tratamiento con DFMO disminuyeron (P < 0,05), y HW/BW aumentó significativamente (P < 0,05).

4.2. Efectos de SPD sobre la estructura morfológica del miocardio, la proliferación celular y la fibrosis en recién nacidos expuestos a

Los resultados de la tinción cardíaca con HE mostraron que los corazones de las crías de un día expuestas a IU mostraron hinchazón y fibras miocárdicas sueltas. Sin embargo, los corazones IUH tratados con SPD mantuvieron una estructura de tejido miocárdico aceptable (Figura 2A). A continuación, evaluamos el número de cardiomiocitos binucleares con el corte de tejido teñido con HE; el número de cardiomiocitos binucleares fue mayor en el grupo IUH que en el grupo control (P < 0.05). En comparación con el grupo de IUH, la proporción de cardiomiocitos binucleares en el grupo de tratamiento con SPD disminuyó significativamente (P < 0.05); DFMO atenuó el efecto de SPD (P < 0.05) (Figura 2C). Además, detectamos la expresión de Ki67 (un marcador de proliferación celular) en miocardio de rata utilizando el método de inmunofluorescencia. Cuanto mayor sea la expresión de Ki67, más fuerte será la fluorescencia rosa al fusionar el rojo y el azul (Figura 2E). Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo de control, la expresión de Ki67 en el grupo IUH disminuyó significativamente (P < 0.05), la expresión de Ki67 aumentó significativamente después de la administración de SPD (P < { {28}}.05), y el efecto de SPD fue abolido por DFMO (P <0.05) (Figura 2F). Estos resultados indican que SPD puede inhibir la retirada prematura de cardiomiocitos del ciclo celular inducida por IUH y promover la proliferación de cardiomiocitos en la nueva descendencia expuesta a IUH. Luego usamos la tinción de Masson para detectar los cambios en el contenido de colágeno miocárdico y evaluamos la fibrosis miocárdica mediante la medición del área de colágeno (Figura 2BandD). Encontramos que la deposición de colágeno miocárdico en los corazones de las ratas recién nacidas expuestas a IU aumentó (P <0,05), cuyo nivel fue mayor en comparación con el grupo de control. Por el contrario, el área de fibrosis miocárdica después del tratamiento con SPD se redujo significativamente (P < 0,05). Sin embargo, en comparación con el grupo de tratamiento SPD, el área de fibrosis aumentó significativamente en el grupo HPxSpd-DFMO (P < 0,05).

4.3. Efectos de la espermidina sobre la estructura mitocondrial del miocardio, la función respiratoria y el contenido de adenosina 5'-trifosfato en recién nacidos expuestos a hipoxia intrauterina

Los cambios en la estructura ultraestructural del tejido cardíaco y la característica mitocondrial fueron analizados por TEM (Figura 3A). El software Image J se utilizó para cuantificar el porcentaje de contenido mitocondrial (área mitocondrial en el área de toda la célula) y el área mitocondrial (Figuras 3B y C). Los resultados mostraron que en el grupo de control, los miofilamentos miocárdicos estaban ordenados, la estructura del sarcómero era clara, las mitocondrias eran compactas, la matriz era más densa y las crestas mitocondriales estaban ordenadas. Sin embargo, las mitocondrias se hincharon, y se observó aflojamiento de la matriz y disminución de la densidad en algunos cardiomiocitos del grupo IUH. En comparación con el grupo de control, la proporción de mitocondrias en cardiomiocitos y el área de mitocondrias se redujeron (P < 0.05). Sin embargo, en los corazones de rata del tratamiento con SPD, los miofilamentos miocárdicos estaban limpios, la estructura del sarcómero era clara, la matriz mitocondrial era compacta y la inflamación mitocondrial disminuyó. En comparación con el grupo IUH, la proporción de mitocondrias en los cardiomiocitos aumentó (P < 0.05) y el área de las mitocondrias aumentó (P < 0,05). DFMO inhibió estos efectos inducidos por SPD (P <0,05).

Usamos piruvato/malato como sustrato para evaluar la función respiratoria mitocondrial, incluidas las frecuencias respiratorias de los estados 3 y 4 y RCR (Figura 3D - F). Notamos que, en comparación con el grupo de control, la frecuencia respiratoria en los estados 3 y 4 y el RCR del grupo IUH fueron significativamente más bajos (P < 0.{{10}}5). Curiosamente, el RCR de los estados 3 y 4 se recuperó después del tratamiento SPD (P < 0.05). Por el contrario, estos efectos SPD se inhibieron significativamente en el grupo de tratamiento DFMO (P < 0.05). De manera similar, en comparación con el grupo de control, el contenido de ATP miocárdico en el grupo IUH se redujo significativamente (P <0,05). En comparación con el grupo IUH, el contenido de ATP aumentó notablemente en el grupo tratado con SPD (P <0,05) y DFMO atenuó los efectos de SPD (P <0,05) (Figura 3G). Estos hallazgos sugieren que SPD puede proteger la estructura mitocondrial del miocardio y el daño de la función y prevenir la disminución de los niveles de ATP en ratas recién nacidas expuestas a IUH.

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