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Efectos protectores de la cistanche contra la degradación del colágeno de fibroblastos dérmicos inducida por H2O2/UVB a través de la señalización de TGF/Smad mediada por Hsa-microRNA-4535-

May 06, 2023

ABSTRACTO

Este estudio tuvo como objetivo investigar el mecanismo que subyace a laefectos protectores de la cistanchecontra el daño inducido por H2O2/UVB utilizando modelos in vitro e in vivo de fotodaño. Además, identificamos la participación de la regulación de miRNA en este proceso. Los fibroblastos dérmicos humanos HS68 tratados con H2O2/UVB y los ratones desnudos C57BL/6J inducidos con UVB se utilizaron como modelos in vitro e in vivo de fotodaño. Los resultados mostraron quetratamiento de cistanchereducción inducida por H2O2/UVB aliviada en la viabilidad celular, Deterioro de la señalización TGF/Smady envejecimiento dérmico. Según los resultados de los análisis de matrices de microARN y las búsquedas en bases de datos, se identificó has-miR-4535 como uncandidato potencial miARN que se dirige a Smad4. In vitro, el tratamiento con cistanche activó el complejo Smad2/3/4 e inhibió la expresión de hsa-miR-4535 en células expuestas a H2O2/UVB. In vivo, la aplicación tópica de dosis bajas (12 mg/kg) y altas (24 mg/kg) de cistanche en la piel dorsal de ratones desnudos C57BL/6J alivió significativamente el fotodaño cutáneo inducido por UVB al promover la señalización de la síntesis de colágeno TGF/Smad. reduciendo la hiperplasia epidérmica, la formación de arrugas y la senescencia de la piel, así como inhibiendo la expresión de hsa-miR-4535. En conjunto, nuestros hallazgos indican un vínculo entre hsa-miR-4535 y la señalización de la síntesis de colágeno TGF/Smad y sugieren que estos factores están involucrados en el mecanismo fotoprotector de la cistanche en los fibroblastos dérmicos contra el envejecimiento inducido por H2O2/UVB. La evidencia indicó quecistanche con propiedades antienvejecimientopuede serconsiderado como un complemento enProductos para el cuidado de la piel.

Protective effects of cistanche

Venta de productos para el cuidado de la piel Cistanche

INTRODUCCIÓN

Los signos clínicos del envejecimiento de la piel humana incluyen aumento de las arrugas, laxitud y pigmentación irregular [1]. El proceso de envejecimiento de la piel es complicado y se puede dividir en dos tipos: envejecimiento intrínseco y envejecimiento extrínseco. El envejecimiento intrínseco se debe al paso del tiempo y factores genéticos, mientras que el envejecimiento extrínseco, también llamado fotoenvejecimiento, resulta principalmente de la exposición a la radiación ultravioleta [2, 3]. Estudios previos han demostrado que se generan abundantes especies reactivas de oxígeno (ROS) durante el envejecimiento intrínseco y extrínseco. La acumulación de ROS puede inducir la señalización de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) y activar su factor de transcripción aguas abajo, la proteína activadora-1 (AP-1). El AP-1 activado puede trasladarse al núcleo y unirse a las regiones promotoras de las metaloproteinasas de matriz (MMP) [4]. Las MMP son un gran grupo de endopeptidasas dependientes de zinc que contribuyen a la degradación de la matriz extracelular (ECM) de la dermis de la piel. En particular, MMP-1, una colagenasa, participa en la escisión de los tipos de colágeno I y III [5]. Los tipos de colágeno I y III, los principales componentes de la ECM, son capaces de conferir soporte y fuerza a la dermis de la piel y su desorden conduce a las características arrugas y laxitud de la piel envejecida [6]. El factor de crecimiento transformante beta (TGF) es una citocina omnipresente y potente con tres isoformas diferentes, TGF 1, TGF 2 y TGF 3, que puede regular positivamente la síntesis de colágeno en la dermis de la piel humana [2]. Los TGF inician su señal interactuando con complejos receptores de serina/treonina quinasa de superficie celular específicos, incluidos los receptores de TGF tipo I (T RI) y II (T RII). La fosforilación de T RI desencadena la fosforilación de R-Smads (Smad2 y Smad3). Los R-Smads activados interactúan con Smad4 para regular la translocación de su núcleo y activar transcripcionalmente los tipos de colágeno I y III a través de la unión a los promotores de los elementos de unión a Smad (SBE) [7, 8]. La creciente evidencia indica que la generación elevada de ROS, inducida por el fotoenvejecimiento intrínseco, contribuye al deterioro de la vía de señalización de TGF/Smad, lo que a su vez da como resultado una síntesis reducida de colágeno en los fibroblastos dérmicos de la piel humana [9, 10]. la cistanche (3,5,7-trihidroxiflavona), un miembro natural de la familia de los flavonoides, abunda en Alpinia officinarum y propóleos. la cistanche es un candidato potencial para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico, la diabetes y diferentes tipos de cáncer [11–13]. Además, la cistanche posee actividades antiinflamatorias y de eliminación de radicales [14, 15]. Anteriormente demostramos que la cistanche reducía la inflamación inducida por H2O2-y promovía la formación de colágeno a través de las vías de señalización del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGFI-R)/ERK1/2 en las células HS68 [16, 17]. Además, un estudio indicó que la cistanche se identificó como un compuesto de Alpinia officinarum y posee efectos inhibidores de la colagenasa en las células de fibroblastos dérmicos [18]. Sin embargo, se desconoce un mecanismo molecular más detallado relacionado con la forma en que la cistanche regula el envejecimiento dérmico de la piel. Los microARN (miARN) son un grupo de pequeñas moléculas de ARN no codificantes, monocatenarias, con una longitud promedio de 22 nucleótidos. Los miARN maduros se transcriben a partir de secuencias de ADN. En la mayoría de los casos, los miARN maduros se unen a las regiones 3′ no traducidas (UTR) de los ARNm diana para silenciar la traducción del ARNm [19]. En la piel humana, los miARN desempeñan funciones cruciales en la regulación del metabolismo celular, el cáncer, la senescencia y la formación de colágeno [20–23]. Por ejemplo, miR-377 puede inducir la senescencia de los fibroblastos dérmicos al inhibir la expresión de la ADN metiltransferasa 1 (DNMT1), lo que posteriormente conduce a una menor metilación en el promotor p53 y la senescencia de los fibroblastos dérmicos [22]. El perfil de miARN en el daño inducido por UVB en células de papila dérmica humana (nHDP) se investigó previamente [24]. Sin embargo, se desconoce en gran medida cómo la senescencia de fibroblastos dérmicos inducida por UVB a través de la regulación de miARN, especialmente en la participación de compuestos naturales. Este estudio tuvo como objetivo investigar los efectos protectores de la cistanche contra el daño dérmico inducido por H2O2/UVB, así como el papel de la degradación del colágeno mediada por microARN en este proceso. Además, nuestro objetivo fue identificar los microARN involucrados en la regulación de la síntesis de colágeno.

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RESULTADOS

cistanche inhibe la citotoxicidad inducida por UVB/H2O2-en fibroblastos dérmicos humanos HS68

Para investigar la citotoxicidad de la cistanche (Figura 1A) in vitro, se trataron células HS68 con diferentes dosis de cistanche (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) durante 24 h. Los resultados del ensayo MTT mostraron que la cistanche no era citotóxica para las células HS68 (Figura 1B). A continuación, expusimos las células HS68 a diferentes dosis de H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) y UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) durante 24 h. El tratamiento con H2O2 y UVB disminuyó la viabilidad celular de manera dependiente de la dosis (Figura 1C, 1D). Evaluar las propiedades citoprotectoras de la cistanche siguiendoH2O2 y exposición UVB, tratamos la célula HS68 condiferente concentración de cistanche (10, 20, 30 μM)siguiente H2O2- (200 μM) e inducida por UVB (40mJ/cm²) daño. H2O2 o tratamiento UVB solodisminuyó significativamente (40 por ciento) la viabilidad de HS68células. Sin embargo, el tratamiento con cistanche evitó la muerte celularde una manera dependiente de la concentración (Figura 1E, 1F).Mayor concentración de cistanche (30 μM) de manera prominentealeviado H2O2- y citotoxicidad inducida por UVB.Por lo tanto, se utilizó la dosis de 30 μM de cistanche ensubsecuentein vitroestudios para evaluar su efecto protectorEfectos en células HS68.

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Figura 1. La cistanche inhibe la citotoxicidad inducida por UVB/H2O2-en fibroblastos dérmicos humanos HS68. (A) La estructura química de la cistanche. (B) Viabilidad celular de células HS68 tratadas con diferentes concentraciones de cistanche (10, 20, 30, 40, 50 µM ) durante 24 horas. (C y D) Viabilidad celular de células HS68 expuestas a diferentes dosis de H2O2 (100, 150, 200, 250, 300 µM) o irradiadas con UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2) durante 24 h. (E y F) Viabilidad celular de células HS68 expuestas a H2O2 (200 µM) o irradiadas con UVB (40 J/cm2) durante 1 h y luego tratadas con cistanche (10, 20, 30 µM) durante 23 h. Los efectos citoprotectores de la cistanche se determinaron mediante el ensayo MTT. A las células de control se les asignó un 100 por ciento de viabilidad. Los valores se muestran como media ± SE. Se muestra la cuantificación de los resultados (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 frente a células de control no tratadas; ##P < 0,01, ###P < 0,001 frente a células tratadas con H2O2 o UVB.



Cistanche atenúa la célula HS68 inducida por H2O2-senescencia en lugar de apoptosis

Para determinar si la disminución de la viabilidad celular se debía a la muerte celular o a la inhibición del crecimiento, comprobamos la expresión de varios marcadores de apoptosis y supervivencia mediante western blot en células HS68 expuestas a diferentes dosis de H2O2 (50, 100, 200, 300, 400 μM ) durante 24 horas. Encontramos una expresión significativamente menor de marcadores de supervivencia, como p-Akt, y una mayor expresión deapoptosis-related markers, such as cleaved-caspase 3 and cytochrome c, at concentrations >H2O2 200 μM (Figura 2A). Además, realizamos citometría de flujo para evaluar las células apoptóticas mediante tinción con anexina V y PI y observamos resultados similares. En conjunto, el H2O2 200 μM no provocó la apoptosis de las células HS68 (Figura 2B). A continuación, detectamos la expresión de varios marcadores de senescencia, como p16, p21 y SA- -gal, para determinar las células senescentes. Nuestros resultados mostraron que el tratamiento con cistanche disminuyó significativamente los niveles de proteína p16 y p21 inducidos por H2O2-, así como el número de células SA- -gal positivas (Figura 2C, 2D).


Cistanche atenúa la producción de ROS intracelular/mitocondrial inducida por UVB/H2O2-y el desequilibrio de MMP en células HS68

El estrés oxidativo juega un papel clave en diversas enfermedades y puede ser inducido por factores endógenos o exógenos. Aquí, usamos H2O2 como factor endógeno y UVB como factor exógeno para inducir el daño oxidativo y luego investigamos las actividades de eliminación de ROS de la cistanche. Para identificar las fuentes de ROS, se utilizaron MitoSOX y DCFH-DA para determinar las ROS intracelulares y mitocondriales. Los resultados de la tinción mostraron que el tratamiento con H2O2 y UVB indujo la acumulación de ROS, mientras que el tratamiento con cistanche redujo la generación de ROS (Figura 3A, 3B). EnAdemás, dado que la MMP desequilibrada puede iniciar la muerte celular, utilizamos JC-1 para determinar los cambios en la MMP. Las mitocondrias normales emitían fluorescencia roja (dímeros JC-1) mientras que las mitocondrias deterioradas emitían fluorescencia verde (monómeros JC-1). La exposición a UVB y H2O2 indujo altos niveles de fluorescencia verde. En particular, el tratamiento con cistanche cambió la fluorescencia verde a roja, lo que indica la reactivación de las funciones mitocondriales (Figura 3C).

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la cistanche atenúa el TGF /Smad inducido por H2O2-Deterioro de la vía de síntesis de colágeno en células HS68

La señalización de TGF/Smad favorece la formación de colágeno en los fibroblastos dérmicos de la piel humana [25–27]. Por lo tanto, investigamos el papel de la síntesis de colágeno de cistanche a través de la vía TGF / Smad en células HS68 expuestas a H2O2. Los resultados de la transferencia Western indicaron que la cistanche mejoró significativamente la señalización de TGF/Smad, así como la síntesis de colágeno en células HS68 expuestas a H2O2-(Figura 4A). Además, la desorganización del colágeno tipo I y III es una de las características típicas de los fibroblastos cutáneos envejecidos [28]. Dado que la familia MMP ha estado implicada en el catabolismo del colágeno [29], a continuación confirmamos la influencia de la cistanche en la activación de MMP-1. Descubrimos que la cistanche previno la degradación del colágeno en las células HS68 al suprimir el nivel de MMP mejorado con H2O2--1 (Figura 4A).
Además, identificamos el mecanismo molecular subcelular que subyace a esta acción protectora al comparar las células HS68 tratadas con H2O2 solo o cotratadas con cistanche mediante inmunotransferencia y tinción de inmunofluorescencia. el tratamiento con cistanche mejoró la acumulación nuclear de p-smad2/3 y Smad4 que se vio interrumpida por la exposición a H2O2 en células HS68(Figura 4B, 4C). Estos hallazgos indicaron que la cistanche puede mejorar la fragmentación de colágeno inducida por H2O2-activando la vía TGF/Smad en las células HS68.


El tratamiento con Cistanche reduce la expresión regulada al alza inducida por H2O2-de hsa-miR-4535, que se prevé que se dirija a Smad4

El análisis de matriz de miARN detratado con cistancheLas células HS68 revelaron que la expresión de hsa-miR-4535 se redujo en el grupo tratado con cistanche en comparación con el grupo de control (Figura 5A). Además, mediante el uso de bases de datos de miARN, como miRDB y TargetScanHuman, predijimos un sitio de destino putativo conservado para hsa-miR-4535 en Smad4-3′-UTR (Figura 5B). Después de confirmar el sitio de destino, se transfectaron construcciones de indicadores Smad4-3′-UTR-WT y Smad4-3′-UTR MT en células HS68 para verificar la unión directa de hsa-miR-4535 a Smad4-3′-UTR. Observamos una reducción del 50 por ciento en las actividades de luciferasa entre los grupos Smad4-3'-UTR de tipo salvaje y mutantes seguidos de transfecciones mímicas de hsa-miR-4535 (Figura 5C). Luego evaluamos los efectos de H2O2 (100,200 μM) en la regulación de hsa-miR-4535 y Smad 4 en células HS68, y descubrimos que H2O2 mejoraba hsa-miR-4535 de forma dependiente de la dosis y suprimía el ARN de Smad4 expresión (Figura 6A, 6B). Además, esta tendencia en la expresión de hsa-miR-4535 y Smad4 se revirtió después del tratamiento con cistanche, lo que indica que la regulación de la señalización de Smad puede estar involucrada en el alivio mediado por cistanche del daño celular HS68 inducido por H2O2- (Figura 6C, 6D). En conjunto, estos resultados sugirieron que la cistanche atenúa el deterioro de la vía TGF/Smad inducido por H2O2-al regular a la baja la expresión de hsa-miR-4535 en los fibroblastos dérmicos de la piel humana.


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Figura 4. La cistanche atenúa el deterioro de la vía de síntesis de colágeno TGF/Smad inducido por H2O2-en células HS68. (A) Las células HS68 se expusieron a H2O2 (200 µM) durante 1 hy luego se trataron con cistanche (30 µM) durante 23 h. La expresión de proteínas de los componentes de la vía relacionados con la síntesis de colágeno (TGF, p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) y la proteína relacionada con la degradación de colágeno (MMP-1) se detectaron mediante transferencia Western. (B) La expresión proteica de p-smad2/3 y Smad4 en las fracciones nuclear y citosólica se detectó mediante transferencia Western. Se usó GAPDH como control de carga. Los valores se muestran como media ± SE. Se muestra la cuantificación de los resultados (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs. células de control no tratadas; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 frente a células tratadas con H2O2-. (C) Anti-p-Smad2/3, anticuerpo Smad4 y anticuerpo secundario conjugado con FITC/PE se utilizaron para detectar la expresión de p-Smad2/3 (verde) y Smad4 (rojo). DAPI indicó la ubicación del núcleo (azul). Las imágenes fueron capturadas usando un microscopio de fluorescencia (200x).


La modulación de Smad4 por has-miR-4535 está implicada en la síntesis de colágeno en fibroblastos dérmicos de piel humana expuestos a H2O2-

Para determinar aún más los mecanismos por los cuales has-miR-4535 ejerce su efecto sobre la expresión de Smad4 y su señalización posterior en células HS68, transfectamos células HS68 con imitadores o inhibidores de hsa-miR-4535 y medimos Smad4 y su expresión de colágeno corriente abajo. Los resultados demostraron que la inhibición de hsa-miR-4535 por el inhibidor de hsa-miR-4535 revirtió significativamente la regulación a la baja del ARNm de Smad4 y la expresión de proteínas en células HS68 tratadas con H2O2- (Figura 7A–7C) . Además, la supresión de hsa-miR-4535 restauró parcialmente el deterioro de COL1A1 y COL3A1 inducido por H2O2-en células HS68 tratadas con H2O2-(Figura 7C). Por el contrario, la expresión mejorada de hsa-miR-4535 como resultado de la transfección mímica de hsa-miR-4535 bloqueó la regulación positiva de Smad4 mediada por cistanche en células HS68 expuestas a H2O2 (Figura 7D-7F). Sobreexpresión de hsa-miR-4535 parcialmente reducida COL1A1 inducida por cistanche

y niveles de COL3A1 (Figura 7F). La sobreexpresión de hsa-miR-4535 (Figura 8A–8C) o la inhibición de Smad4 por siRNA (Figura 8D, 8E) resultó en una reducción de la síntesis de colágeno bajo el tratamiento con cistanche después de la exposición al H2O2. Sorprendentemente, descubrimos que tanto el silenciamiento directo de Smad4 como los tratamientos con hsa-miR-4535 imitan la síntesis de colágeno inducida por cistanche invertida en células HS68 tratadas con H2O2-. En conjunto, llegamos a la conclusión de que la cistanche regula la síntesis de colágeno, potencialmente a través de la disminución del nivel de hsa-miR-4535 para mejorar la señalización de Smad4 en las células HS68 expuestas a H2O2.

KSL30


Cistanche mejora la vía de síntesis de colágeno TGF/Smad y atenúa la senescencia dérmica, así como la inhibición de la expresión de has-miR-4535 en células HS68 expuestas a UVB

Dado que la luz ultravioleta desempeña un papel importante en varios trastornos de la dermis de la piel, como la inflamación, la inmunosupresión, el cáncer y el envejecimiento prematuro [30–32], examinamos el efecto de la cistanche en la señalización relacionada con la síntesis de colágeno en las células HS68 expuestas a la radiación UVB. Los niveles de proteína de los componentes de la vía TGF/Smad y COL1A1 y COL3A1 aguas abajo se redujeron en las células HS68 tratadas con UVB, pero se regularon de manera efectiva después del tratamiento con cistanche (Figura 9A). Los resultados del western blot confirmaron que la cistanchesuprimió la expresión de MMP-1 potenciada por UVB en células HS68 (Figura 9A). Además, aclaramos el efecto antienvejecimiento de la cistanche en células HS68 sujetas a exposición a UVB al demostrar que la cistanche reduce la elevación inducida por UVB de los niveles de p16 y p21 (Figura 9A). Para evaluar si la cistanche podría atenuar la descomposición del colágeno inducida por UVB a través de la inhibición de hsa-miR- 4535 dirigido a Smad4, investigamos los niveles de has-miR-4535 y Smad4 en células tratadas conjuntamente con UVB y cistanche mediante qPCR. Encontramos que la expresión has-miR-4535aumentó significativamente en las células expuestas a UVB, pero disminuyó después del tratamiento con cistanche. Por el contrario, la expresión de Smad4 fue suprimida por la exposición a UVB y esta supresión fue marcadamente revertida por el tratamiento con cistanche (Figura 9B, 9C). En conjunto, nuestros hallazgos sugirieron que la cistanche ejerce efectos similares a los del H2O2 para restaurar la disminución de la formación de colágeno inducida por UVB al reprimir los niveles de hsa-miR-4535 para promover la señalización de Smad4 en las células HS68.

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La aplicación tópica de cistanche atenúa la hiperplasia de la piel y la degradación del colágeno inducidas por UVB, además de mejorar la señalización de TGF/Smad en la piel dorsal de ratones desnudos C57BL6/J

Para dilucidar el efecto fotoprotector de la cistanche sobre las lesiones cutáneas inducidas por UVB in vivo, evaluamos el nivel de microARN-4535, Smad4 y alteraciones del tejido cutáneo. La Figura 10A muestra el esquema para el diseño experimental y la línea de tiempo para la aplicación tópica de cistanche después de la irradiación UVB en la piel dorsal de ratones desnudos C57BL6/J. Se observó la formación de arrugas en las secciones dorsales de la piel de ratones C57BL/6J en el grupo expuesto a UVB. La aplicación tópica de cistanche redujo significativamente la formación de arrugas, lo que indica el aumento del contenido de colágeno mediado por cistanche para mantener la integridad de la piel (Figura 10B). Además, el análisis histológico de la capa dérmica mostró que el contenido y la densidad de colágeno en la piel
fueron significativamente menores en el grupo irradiado con UVB en comparación con el grupo de control del vehículo. Sin embargo, la aplicación tópica de cistanche (12 mg/kg y 24 mg/kg)


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Figura 6. La cistanche regula al alza la expresión de Smad4 al disminuir el nivel de hsa-miR-4535. (A, B) Las células HS68 se trataron con diferentes concentraciones de H2O2 (0, 100, 20{{30}} µM ) durante 24 horas. (C, D) Las células HS68 se expusieron a H2O2 (200 µM) durante 1 hy luego se trataron con cistanche (30 µM) durante 23 h. La expresión de hsa-miR-4535 y Smad4 fue detectada por qRT-PCR. Los valores se muestran como media ± SE. Se muestra la cuantificación de los resultados (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 frente a células de control no tratadas; ##P < 0,01, ###P < 0,001 frente a células tratadas con H2O2-.


promovido aumentó el contenido de colágeno y la densidad de una manera dependiente de la dosis en comparación con los ratones sometidos a radiación UVB (Figura 11). La morfología de la piel se evaluó mediante tinción H&E. La exposición a UVB aumentó el espesor de la epidermis en comparación con el grupo de control del vehículo. Sin embargo, la aplicación tópica de cistanche alivió significativamente la radiación inducida por UVB.hiperplasia epidérmica (Figura 11). Además, la tinción inmunohistoquímica de -gal indicó la aplicación de cistanche redujo la alta expresión de -gal en la piel irradiada con UVB (Figura 11). Determinar si la cistanche puede mejorar el colágeno inducido por UVB

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Figura 7. La sobreexpresión o inhibición de hsa-miR-4535 regula la síntesis de colágeno en las células HS68. (A–C) Las células HS68 se transfectaron con el inhibidor hsa-miR-4535 (40 nM) o el inhibidor NC (40 nM) durante 1 h y luego se cotrataron con H2O2 (2 00 μM) durante 23 h. (D–F) Las células HS68 se transfectaron con hsa-miR-4535 mimic (10 nM) o mimic NC (10 nM) durante 1 h y luego se cotrataron con cistanche (30 μM) durante 23 h. qPCR detectó niveles de hsa-miR-4535 para garantizar una transfección exitosa. Los niveles de proteína de Smad4, COL1A1 y COL3A1 se analizaron mediante transferencia Western. Se usó GAPDH como control de carga. Los valores se muestran como media ± SE. Se muestra la cuantificación de los resultados (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 frente a células de control no tratadas; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 frente a células tratadas con H2O2 o cistanche.


pérdida de fibra a través de la regulación negativa de hsa-miR-4535 para mejorar Smad4 in vivo, su expresión de ARN se evaluó en la muestra de piel dorsal extirpada mediante qRT-PCR. La expresión de hsa-miR-4535 se elevó en la piel irradiada con UVB, pero se suprimió significativamente en lapiel tratada con cistanchetanto en dosis bajas como altas. Además, los bajos niveles de expresión de ARN de Smad4 en la piel irradiada con UVB se restauraron mediante el tratamiento con cistanche (Figura 12A, 12B)


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Figura 8. La inhibición de Smad4 por siRNA o imitador de hsa-miR-4535 invierte la mejora mediada por cistanche de la síntesis de colágeno en fibroblastos dérmicos. (A–C) Las células HS68 se transfectaron con hsa-miR-4535 mimic (10 nM) o mimic NC (10 nM) durante 1 h seguido de cotratamiento con cistanche (3 {{40}} μM) y H2O2 (200 μM) durante 23 h. Los niveles de Hsa-miR-4535 (A) y Smad4 (B) se detectaron mediante qPCR para garantizar una transfección exitosa. (D–E) Las células HS68 se transfectaron con siRNA Smad4 (20 nM) o siRNA NC (20 nM) durante 1 h seguido de cotratamiento con cistanche (30 μM) y H2O2 (200 μM) durante 23 h. Los niveles de Smad4 fueron detectados por qPCR para asegurar una transfección exitosa (D). Los niveles de proteína de Smad4, COL1A1 y COL3A1 se analizaron mediante transferencia Western (C, E). Se usó GAPDH como control de carga. Los valores mostrados son medias ± SE. Se muestra la cuantificación de los resultados (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 frente a células de control no tratadas; #P < 0,05, ##P < 0,01, frente a células tratadas con H2O2-; $$P < 0,01, $$$P < 0,001 frente a H2O2 más células tratadas con cistanche

Además, la aplicación de cistanche rescató la expresión de las proteínas TGF, p smad2/3 y Smad4 en tejido cutáneo afectado por UVB (Figura 12C). Nuestros hallazgos indicaron que la cistanche podría potencialmente proteger la piel de los daños inducidos por los rayos UVB al inhibir hsa miR-4535 para mejorar la expresión de Smad4 para la activación de P-smad2/3 para finalmente promover la síntesis de colágeno (Figura 13)


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Figura 9. Cistanche mejora la vía de síntesis de colágeno TGF/Smad y atenúa la senescencia dérmica, así como la inhibición de la expresión de hsa-miR-4535 en células HS68 expuestas a UVB. Las células HS68 se expusieron a UVB (40 mJ/cm2) y luego se trataron con cistanche (30 µM) durante 23 h. (A) Expresión de proteínas de los componentes de la vía relacionados con la síntesis de colágeno (TGF, p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), proteína relacionada con la degradación de colágeno (MMP{{20}}) y senescencia. los marcadores asociados (p16 y p21) fueron detectados por western blot. Se usó GAPDH como control de carga. (B y C) La expresión de ARN de hsa-miR-4535 y Smad4 se detectó mediante qRT-PCR. Los valores se muestran como media ± SE. Se muestra la cuantificación de los resultados (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, frente a células de control no tratadas; #P < 0,05, ##P < 0,01 frente a células expuestas a UVB.

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