Potencial antioxidante y antienvejecimiento de una formulación peptídica (Gal2–Pep) conjugada con ácido gálico Ⅱ

3. Resultados y discusión

3.1. Síntesis y conjugación de ácido gálico con péptido.

Los péptidos sintetizados TPPTTP, galloyl–TPPTTP (Gal–Pep) y Gal2–Pep se obtuvieron y purificaron usando semipreparativo RP-HPLC. La Fig. 1a y el Esquema 1 muestran la estrategia de conjugación del ácido gálico con KTPPTTP como Gal2–Pep. En el método SPPS, las impurezas generadas durante la síntesis de péptidos suelen incluir péptidos con reacciones secundarias, grupos protectores de aminoácidos y disolventes utilizados para la síntesis y la purificación. Se sabe que el HOBt utilizado en la síntesis de péptidos inhibe la racemización y mejora la eficiencia de la síntesis de péptidos. el proceso de síntesis de péptidos. Incluso después del último paso de lavado, las impurezas, incluidos los grupos protectores de aminoácidos, siguen presentes en cantidades mínimas. Para cumplir con la pureza del péptido de más del 90 % informada por varios investigadores,20–22 se realizó una HPLC semipreparada como un paso de pulido para obtener el péptido final con una pureza del 99,2 % como resultado del análisis de HPLC (ver Fig. S1†). El producto peptídico purificado se analizó utilizando Q-TOF para reconfirmar su síntesis exitosa (Fig. 1b-d).

Haga clic aquí para obtener más información sobre Cistanche Treat Anti-Aging

3.2. Ensayos de viabilidad celular

3.3. Actividad antioxidante de los péptidos sintetizados

TPPTTP no tuvo actividad de eliminación de radicales en ninguna concentración, mientras que GA, Gal-Pep y Gal2-Pep exhibieron una mayor actividad de eliminación de radicales de una manera dependiente de la concentración.

Enparticular, gal2–Pep demostró lo más efectivoantioxidanteactividad; a una concentración de 10mM, GA, chica–Pep y Gal2–Energíatenía una actividad de eliminación de radicales del 13,6 por ciento, 24,23 por ciento y 26,0 por ciento,respectivamente. Esto indica que la unión de TPPTTP a GA nono inhibir la actividad de captación de radicales. Figura 3b confirms elestabilidad de las muestras como contrafirmado por la evaluación de su radicalactividad depuradora cuando se almacena a temperatura ambiente. GA retenidosu actividad de barrido radical por hasta una semana pero, unpieer dos semanas, esta actividad disminuyó en más del 60 por ciento . En el otromano, chica–pep y gal2–Pep mantuvo su actividad carroñeradurante más de dos semanas. en particular gal2–Pep tuvo un scav radicalactividad comercial del 50 por ciento incluso en su cuarta semana. Estos resultadossugieren que la unión de GA a TPPTTP estabiliza su eliminación de radicalesactividad. Algunos estudios han demostrado que el ácido ascórbico se estabilizaal unirlo con péptidos.12,25 Creemos que GA puede ser stabilizado uniéndolo con un péptido de la misma manera.

Elefecto antioxidante de los péptidostambién se probó usando ensayos DCF DA en presencia de estrés oxidativo intracelular inducido por H2O2 (Fig. 4). Después de 24 h de tratar las muestras en las células a una concentración de 100 mM, se cargó DCF-DA en las células y luego se trataron las células con H2O2 durante 30 min y se observó la intensidad de fluorescencia de DCF en una excitación. longitud de onda de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm. Las células sometidas a estrés oxidativo con H2O2 1 mM exhibieron una intensidad de fluorescencia que fue más de tres veces mayor que el control negativo; sin embargo, el tratamiento con Gal2-Pep produjo una fluorescencia que fue solo el 67 por ciento de la producida por las células tratadas solo con H2O2. En presencia de TPPTTP, que no exhibió actividad de eliminación de radicales (Fig. 3a), el estrés de ROS causado por H2O2 se redujo en aproximadamente un 20 por ciento, lo que respalda investigaciones anteriores que informaron que TPPTTP disminuye los niveles de ROS en las células.24 Cuando las células fueron tratados solo con GA, no hubo cambios significativos en los niveles de ROS. En conjunto, estos resultados sugieren que Gal2-Pep, que combina dos moléculas de GA con un péptido, es un antioxidante estable y eficaz.

3.4. Efecto de los péptidos sintetizados sobre el potencial de membrana de las mitocondrias

En este estudio, se utilizó el colorante JC-1 para investigar el efecto de los péptidos sintetizados en la MmP (DJm). La MmP actúa como un parámetro importante para la función mitocondrial y se sabe que está asociada con varias enfermedades como el Alzheimer y la enfermedad de Huntington.26 El tinte JC-1 produce una camisa roja a partir de emisiones verdes al acumularse en las mitocondrias y formar agregados J. Después de tratar las células HaCaT y los fibroblastos con los péptidos sintetizados durante 24 h, las células se expusieron al tinte JC-1 durante 10 min y luego se midió la intensidad de la fluorescencia utilizando un lector de microplacas (verde lEx ¼ 475 nm y lEm ¼ 530 nm, rojo lEx ¼ 475 nm y lEm ¼ 590 nm). La relación de la fluorescencia roja a verde se expresó como el cambio de veces en comparación con el control negativo (Fig. 5). Las células HaCaT tratadas con GA y el péptido de forma independiente no mostraron ningún cambio significativo en comparación con el grupo de control negativo, mientras que Gal2-Pep mostró una diferencia significativa, aumentando 145- veces en comparación con el control. Las células de fibroblastos tratadas con Gal2-Pep también

Fig. 4 Ensayos de actividad antioxidante intracelular usando DCF-DA a concentraciones de ácido gálico y péptido de 100 mM. Después de 24 horas de tratamiento, se añadió H2O2 y se incubó durante 30 minutos, seguido de la medición de la intensidad de fluorescencia DCF. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (*p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,001).

3.5. Actividad inhibidora de elastasa

3.6. Expresión de genes de colágeno tipo I, MMP-1 y PGC-1a

Fig. 7 Análisis de expresión génica en fibroblastos dérmicos mediante RT-qPCR: (a) colágeno tipo I, (b) MMP-1 y (c) PGC-1a.

La expresión de PGC-1a fue más alta después de 8 h para todos los tratamientos, con tasas de expresión para GA, TPPTTP, Gal–Pep y Gal2–Pep aumentando 2.06-, 1.{{6} }, 1.07- y 2.05-veces, respectivamente. Sin embargo, a diferencia de los otros tratamientos, Gal2-Pep aumentó la expresión de PGC-1a 1.27-veces después de 24 h. PGC-1aregula la síntesis y los efectos antioxidantes de las mitocondriasy se informa adisminuir con el envejecimiento.29–32 Por lo tanto, Gal2–Pep tiene el potencial de usarse como un antioxidante efectivo que puede proteger de manera efectiva contra las ROS.

En conjunto, Gal2-Pep aumentó la expresión de PGC-1a y colágeno en comparación con los efectos de GA y TPPTTP solos, mientras que elexpresión de MMP-1 tendió a disminuir, ilustrando así su potencial para su uso encosméticos antienvejecimiento. 

4. Conclusión

Conflictos de interés

No hay conflictos que declarar.

Expresiones de gratitud

Este estudio fue apoyado por una subvención de Korea Industrial Complex Corp. (KICOX, NTIS No. 1415165722) y la Subvención de Investigación de la Universidad de Inha.

Referencias

20 P. Song, W. Du, W. Li, L. Zhu, W. Zhang, X. Gao, Y. Tao y F. Ge, Nanomater. Nanotecnología., 2020, 10, 1–10.

21 M. De Zotti, B. Biondi, Y. Park, K.-S. Hahm, M. Crisma, C. Toniolo y F. Formaggio, Amino Acids, 2012, 43, 1761–1777.

22 Z. Zhai, K. Xu, L. Mei, C. Wu, J. Liu, Z. Liu, L. Wan y W. Zhong, So Matter, 2019, 15, 8603–{{4 }}.

23 DJ Tobin, J. Tissue Viability, 2017, 26, 37–46.