Análisis del proteoma y capacidad antiviral, anticancerígena y antioxidante in vitro de los extractos acuosos de los hongos comestibles Lentinula Edodes y Pleurotus Ostreatus

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Resumen: En este estudio, examinamos extractos acuosos de los hongos comestibles Pleurotus ostreatus (hongo ostra) y Lentinula edodes (hongo shiitake). El análisis del proteoma se realizó mediante LC-Triple TOF-MS y mostró la expresión de 753 proteínas por Pleurotus ostreatus y 432 proteínas por Lentinula edodes. Péptidos bioactivos: inhibidor de la disociación de Rab GDP, superóxido dismutasa, tiorredoxina reductasa, serina proteinasa y lectina, fueron identificados en ambos hongos. Los extractos también incluían compuestos bioactivos prometedores, incluidos compuestos fenólicos,flavonoides, vitaminas y aminoácidos. Los extractos mostraron prometedoresactividades antivirales, con un índice de selectividad (SI) de 4.5 para Pleurotus ostreatus contra adenovirus (Ad7), y una actividad leve para Lentinula edodes contra herpes simplex-II (HSV-2). Los extractos no fueron citotóxicos para las células mononucleares de sangre periférica humana normal (PBMC). Por el contrario, mostraron una citotoxicidad moderada contra varias líneas celulares de cáncer. Además, la actividad antioxidante se evaluó mediante DPPHbarrido radical, eliminación de cationes radicales ABTS y ensayos ORAC. Los dos extractos mostraron potencialactividades antioxidantes, con la máxima actividad observada para Pleurotus ostreatus (IC50 ug/mL)=39.46 ± 1.27 para DPPH;11.22±1.81 para ABTS; y 21,40±2,20 para ensayos ORAC. Este estudio fomenta el uso de estos hongos en medicina a la luz de su baja citotoxicidad en PBMC normales frente a sus capacidades antivirales, antitumorales y antioxidantes.

Palabras clave: hongo de la podredumbre blanca; Pleurotus ostreatus; Lentinula edodes; shitake; antioxidante; antitumoral; antivírico

1. Introducción

Los hongos tienen grandes perspectivas en medicina y producción nutracéutica. Además de tener buenas propiedades organolépticas y altos valores nutricionales, se informó que muchos hongos tienen una miríada de actividades farmacológicas [1-3]. Entre los hongos más cultivados se encuentran Lentinula edodes (hongo shiitake) y Pleurotus ostreatus (hongo ostra). Shiitake ocupa el segundo lugar después de Agaricus bisporus como el hongo comestible más consumido en todo el mundo [4]. Este hongo tiene efectos antibacterianos, antifúngicos, antivirales, hepatoprotectores, antihiperglucémicos e inmunomoduladores prometedores [5-7]. Es rico en moléculas bioactivas, de las cuales la más estudiada es el “lentinan”, un polisacárido con efecto contra bacterias, virus y tumores, además del “lentinan”, que mostró ayuda en el control de la dislipidemia y la hiperglucemia [8]. Pleurotus ostreatus, la especie más común del género Pleurotus [9], también conocido como el hongo ostra, es un descomponedor de madera y tiene una amplia gama de actividades biológicas [10]. En comparación con otros hongos terapéuticos, los hongos ostra son cada vez más populares como promotores de la salud [11]. La presencia de una gran cantidad de componentes nutritivos como lectinas, polisacáridos, vitaminas y minerales en los hongos ostra los hace capaces de poseer potencial anticancerígeno,antioxidantepropiedades antidiabéticas, antimicrobianas y antihipercolesterolémicas [12,13]. En comparación con otros hongos comestibles, las ostras y los hongos shiitake tienen un período de crecimiento breve y se pueden cosechar durante todo el año 14. Como resultado de su facilidad de cultivo y prueba, altos valores nutricionales y prometedores beneficios medicinales, estos hongos tienen un enorme potencial en las industrias alimentaria y farmacéutica [4,15]. De hecho, los basidiomicetos superiores pueden ser fuentes de alimentos multifuncionales prometedoras.

En estos dos hongos se encontraron muchos compuestos bioactivos, incluidos azúcares, proteínas fisiológicamente activas, ácidos grasos insaturados, compuestos fenólicos (ácidos fenólicos y polifenoles), flavonoides, terpenoides, glicoproteínas, policétidos, esteroides y alcaloides [16,17]. Estos compuestos actúan solos o sinérgicamente para provocar las amplias acciones farmacológicas de estos hongos. Se informa que los hongos shiitake y ostra tienen actividades antibacterianas, antivirales, antihipertensivas, inmunomoduladoras y antioxidantes [1,18,19]. Seo et al. [20] resumieron los mecanismos de la actividad antiviral de las biomoléculas de hongos, indicando que la reducción de la infección viral se produce principalmente al interferir con la absorción del virus en las células huésped, su replicación y su síntesis de proteínas y enzimas, además de estimular la respuesta inmune del huésped [21]. Los antioxidantes son moléculas importantes frente a las especies reactivas del oxígeno que están detrás de muchos problemas de salud. Dado que se levantaron muchas banderas rojas contra el uso de antioxidantes sintéticos, el estudio de los naturales se ha vuelto obligatorio [22]. El efecto antitumoral de estos productos de hongos se relacionó con biomoléculas que incluyen glucanos, ergosterol, proteoglicanos y aminoácidos (arginina y glutamina) [23]. El mecanismo postulado que subyace a este efecto puede incluir la estimulación de los linfocitos T, la supresión de la neovascularización y la inducción de la muerte de las células cancerosas, además de desencadenar la respuesta inmunitaria contra las células cancerosas [24,25].

La proteómica ha demostrado ser una de las herramientas valiosas en bioinvestigación, particularmente en investigación agrícola [26]. Lindequist et al. [27]fueron el primer grupo en arrojar luz sobre la importancia de emplear la proteómica en la investigación de hongos comestibles. Hicieron hincapié en la necesidad de utilizar "ómicas" para el estudio de moléculas bioactivas fúngicas. La proteómica se ha utilizado escasamente en la investigación de hongos comestibles frente a hongos patógenos [28]. En consecuencia, los objetivos de este estudio fueron analizar el proteoma de dos hongos comestibles, Pleurotus ostreatus y Lentinula edodes, e investigar su potencialantivírico, actividades antitumorales y antioxidantes.

2. Resultados

2.1.Análisis de proteómica

El análisis del proteoma se realizó mediante el análisis LC-Triple TOF-MS con una tasa de descubrimiento falso (FDR) de<5% and="" a"95%="" confidence="" of="" identification".="" for="" p.ostreatus,="" a="" total="" of="" 753="" proteins="" were="" identified,34="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" a="" total="" of="" 432="" proteins="" were="" detected="" in="" ledodes,="" 48="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" the="" recorded="" accession="" numbers="" of="" the="" proteins="" are="" included="" in="" tables="" s1="" and="" s2="" for="" p.="" ostreatus="" and="" l.edodes,="" respectively.="" in="" tables="" s1="" and="" s2,="" the="" ms-triple="" tof="" data="" were="" analyzed="" by="" proteinpilot="" with="" the="" paragon="" algorithm.="" proteins="" were="" identified="" with="" peptides="" that="" gave="" more="" than="" a="" 95%="" confidence="" of="" identification.="" bioactive="" proteins:="" rab="" gdp="" dissociation="" inhibitor,="" superoxide="" dismutase,="" thioredoxin="" reductase,="" serine="" proteinase,="" and="" lectin,="" were="" expressed="" in="" both="" p.ostreatus="" and="" l.edodes="" extracts="" [29-35].="" p.="" ostreatus="" also="" expressed="" osteolysis="" and="" pleurotolysin,="" whereas="" latch="" pin="" and="" valosin-containing="" protein="" were="" expressed="" by="" l.edodes.="" lc-triple="" tof-ms="" spectra="" of="" the="" mushroom="" extracts="" analyzed="" by="" analyst="" tf1.7.1="" (sciex="" software)="" are="" shown="" in="">

2.2. Compuestos bioactivos totales Contenido total

Al evaluar los contenidos totales, esto incluyó la evaluación de los carbohidratos, proteínas, compuestos fenólicos y flavonoides totales. El extracto de P. ostreatus contenía casi el triple de carbohidratos y el doble de proteínas presentes en el extracto de L. edodes; sin embargo, se detectaron más flavonoides en el extracto de L.edodes que en el extracto de P. ostreatus (Cuadro 1).

2.3. Moléculas fenólicas y flavonoides

Ambos extractos de hongos contenían catequina (detectada en un tiempo de retención de 26,48 min). P.ostreatus también incluía kaempferol y apigenina (detectados en tiempos de retención de 59,13 min y 59,56 min, respectivamente), mientras que L.edodes también contenía quercetina (tiempo de retención=56.86 min; Tabla 2; Figura S1).

2.4.Vitaminas

Los contenidos de vitaminas solubles en agua y solubles en grasa se determinaron mediante HPLC (Tabla 3 y Figuras S2 y S3). Ambos hongos son ricos en vitamina C, con cantidades detectables de vitaminas B3, B6 y D. No hubo diferencias significativas entre ambos hongos en la cantidad de vitaminas que poseen. Por otro lado, las vitaminas B1, B2, B9, A y E no se detectaron en ninguno de los hongos.

2.5. Análisis de aminoácidos

Se usó un analizador de aminoácidos Sykam para el análisis de aminoácidos. Los contenidos totales de aminoácidos fueron 5,14 y 4,35 en P.ostreatus y L.edodes, respectivamente, como se muestra en la Tabla 4, y los dos hongos son ricos en ácido glutámico. Si bien se detectó prolina en una concentración considerable (0.57 g/100 g de proteína) en el extracto de P. ostreatus, no se detectó en el extracto de L. edodes. No se detectaron histidina ni ácido aspártico en ninguno de los dos hongos.

2.6. Actividades biológicas

2.6.1.Actividad Antiviral

La actividad antiviral se evaluó frente a dos virus: adenovirus y herpes simplex-II. Como se muestra en la Tabla 5, el extracto de P. ostreatus mostró una actividad antiviral eficaz contra adenovirus, con un índice de selectividad de hasta 4,5. También se registraron efectos antivirales prometedores para el extracto de P. ostreatus contra el herpes simplex-II y para el extracto de L. edodes contra ambos virus. Las figuras S4 y S5 representan las curvas dosis-respuesta.

2.6.2. Actividad citotóxica contra PBMC humanas normales

Se registró una citotoxicidad mínima (IC50 ug/ml; 66,41 ± 3,7 y 82,81 ± 2,72, para P. ostreatus y L. edodes, respectivamente) frente a PBMC humanas normales.

Contra líneas celulares de cáncer

En esta prueba se utilizaron diversas líneas celulares de cáncer, incluido el cáncer de próstata (DU-145 y PC3); carcinoma hepatocelular (HepG2); carcinoma colorrectal (Colo-205); carcinoma de ciego (LS-513); cáncer de cuello uterino (HeLa); y adenocarcinoma de mama (MDA-MB-231 y MCF-7). Se usó doxorrubicina como control positivo (causó una disminución de la viabilidad al 53 % en HepG2; 44 % en MDA-MB-231; 39 % en PC3; 35 % en DU-145; 29 % en MCF -7:25 por ciento en LS-513; 23 por ciento en HeLa y 19 por ciento en Colo-205 celdas). Los resultados en la Figura 2 muestran que el extracto de Ledodes y P. ostreatus disminuyó la viabilidad de las líneas celulares cancerosas probadas de LS-513, HepG2, DU-145 y PC-3 en aproximadamente 20 por ciento

Contra líneas celulares de leucemia y linfoma

Se analizó la citotoxicidad de los extractos de hongos P.ostreatus y L.edodes contra las células de leucemia (CCR-CEM, NB-4, THP-1) y linfoma (U937). La doxorrubicina fue el estándar positivo, lo que provocó una disminución de la viabilidad celular al 29 %, 25,5 %, 20,3 % y 19,1 % en las células U937, NB4, CCRF-CEM y THIP1, respectivamente. El extracto de L.edodes disminuyó la viabilidad de las células THP1 al 66,02 %, mientras que el extracto de P.ostreatus redujo la viabilidad de las células CCRF-CEM al 70,64 % (Figura 3).

2.6.3. Actividad antioxidante

Los resultados del efecto antioxidante fueron estudiados por los tres métodos de evaluación, a saber, DPPHbarrido radical, la eliminación de cationes radicales ABTS y los ensayos ORAC, en comparación con el antioxidante estándar, Trolox, se muestran en la Tabla 6 y la Figura S6a,b. Los resultados muestran que el extracto de P. ostreatus tenía una capacidad antioxidante más potente que el extracto de L. edodes, como lo indican los tres ensayos antioxidantes utilizados. La figura 4 muestra la disminución de la señal de fluoresceína inducida por los extractos en el ensayo ORAC.

3. Discusión

Los hongos de la podredumbre blanca han despertado el interés de la comunidad científica debido a sus propiedades medicinales, que incluyen la modulación del sistema inmunitario, actividad hipoglucemiante y antitrombótica, y propiedades antihipertensivas, antiinflamatorias, antimicrobianas y antitumorales, así como la capacidad de reducir los niveles de colesterol en sangre [ 24,36-38]. Los dos hongos de pudrición blanca, P. ostreatus y L. edodes, son dos de los hongos comestibles más consumidos en muchos países [39]. Estos dos hongos producen una multitud de proteínas bioactivas, y el análisis del proteoma es actualmente la herramienta más eficaz para el perfilado de proteínas [40]. En el estudio actual, el análisis del proteoma mostró la expresión de proteínas bioactivas, incluido el inhibidor de la disociación Rab GDP, la tiorredoxina reductasa, la serina proteinasa, la superóxido dismutasa y la lectina en los dos hongos de prueba. El inhibidor de la disociación Rab GDP (Rab GDI) regula la función de las Rab GTPasas que desempeñan un papel fundamental en el tráfico de membranas en las células tumorales. En consecuencia, el uso de Rab GDI es una estrategia anticancerígena prometedora [29].

La serina proteinasa contribuye a laantivíricoactividad de hongos comestibles [30,31]. Además, Yap et al. (2018) informaron una fuerte citotoxicidad selectiva de la serina proteinasa frente a una línea celular de adenocarcinoma de mama humano (MCF7) y sugirieron que el mecanismo implica el efecto colaborativo de los mecanismos de muerte celular tanto extrínsecos como intrínsecos, además de la estimulación de la caspasa{{ 4}} y-9 e inhibición de Bcl-2 [41].

la ingesta deantioxidanteses una estrategia profiláctica auspiciosa contra la fisiopatología mediada por especies reactivas de oxígeno (ROS) [22]. Nuestros resultados muestran la expresión de enzimas del sistema de defensa antioxidante por parte de Pleurotus ostreatus y Lentinula edodes. Estas enzimas incluyen superóxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa, que contrarrestan la producción de ROS [32]. La superóxido dismutasa comienza convirtiendo el superóxido en peróxido de hidrógeno, que, a su vez, es convertido por la catalasa y la glutatión peroxidasa en agua [33].

La expresión de lectina también se detectó en los dos hongos. Muchos investigadores informaron sobre los perfiles biológicos notablemente diversos de la lectina con una amplia gama de actividades que abarcan actividades antiinflamatorias, antidepresivas, anticonceptivas y vasodilatadoras [34,35,42]. Las lectinas son proteínas de unión a carbohidratos con una variedad de funciones celulares, incluida la supresión in vitro e in vivo del crecimiento tumoral a través de la unión selectiva a las membranas de las células tumorales o sus receptores, lo que da como resultado la activación de las proteínas quinasas o la modulación de las respuestas inmunitarias a través de la producción de interleuquinas. [43]. Además, las lectinas de hongos también tienen un papel en el desencadenamiento de diferentes vías de muerte celular, incluida la apoptosis, la necrosis y/o la autofagia [42].

Nuestros datos muestran la expresión de osteólisis y pleurotolisina en Pleurotus ostreatus. Estas son proteínas formadoras de poros con actividades anticancerígenas altamente selectivas [44,45]. La ostreolisina es una proteína citolítica de 15 kDa con la capacidad de permeabilizar eritrocitos y otras células en concentraciones submicromolares. Actúa a través de un mecanismo osmótico coloidal e induce la formación de poros de membrana anchos |46,47I. Nimri et al. produjo pleurotolisina recombinante con una potente actividad antitumoral contra células tumorales de colon humanas y de ratón [48].

En L. edodes, se expresaron la proteína que contiene valosina y el pin de cierre. Previamente se informó que la proteína que contiene valosinaantioxidantepropiedades que podrían ayudar en síndromes neuronales como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral y la demencia [49-51]. Latcripin es un potencial agente anticancerígeno [50]. Riaz Ud Din et al. (2020) investigaron el mecanismo anticancerígeno del pasador de cierre contra líneas celulares de cáncer de mama. Informaron sobre su capacidad para inducir la muerte celular y la autofagia, además de su efecto inhibidor sobre la migración y la invasión [52].

Se cuantificó una gama de compuestos bioactivos en extractos de P.ostreatus y L.edodes. En el presente estudio se detectaron TPN de 19,37 ± 0,39 y 24,14 ± 1,01 mg/g de extracto para P.ostreatus y L.edodes, respectivamente. Esos valores son más altos que los registrados por Rahimah et al., quienes utilizaron las pruebas de amonio y Shinoda para cuantificar el contenido total de flavonoides de P. ostreatus como 6,67 mg/g del extracto [53]. Además, nuestros resultados son superiores a los encontrados por Montibus et al., quienes analizaron el TPC en extractos de L edodes utilizando el método de Folin-Ciocalteu y encontraron 0.8-1.5 por ciento de peso seco (PS) en las mayúsculas y 0.8-1.1 por ciento dw en los estípites [54].

Se detectó catequina en los extractos de P. ostreatus y L. edodes. La catequina es un metabolito fenólico secundario de la planta, con potentes propiedades de eliminación de radicales libres [55]. Se descubrió que el extracto de L.edodes contenía el flavonoide quercetina. El efecto antioxidante de la quercetina está mediado por la regulación de los niveles de glutatión y un aumento en la producción de enzimas antioxidantes, incluidas la glutatión transferasa y la aldo-ceto reductasa [56]. Además, se informa que la quercetina tiene actividad antitumoral al interrumpir el ciclo celular y promover la apoptosis [57,58]. Lee et al. informaron que la quercetina provoca la detención celular en las líneas celulares de cáncer PC3, Du145 y U937 [59]. Nuestros resultados también revelan que se encontraron kaempferol y apigenina en P.ostreatus. Se ha demostrado que el kaempferol y la apigenina tienen actividades antioxidantes y antiproliferativas [60-62]. Se encontró que el ácido glutámico es el aminoácido más abundante en ambos extractos de hongos. En la misma línea, Chirinang et al. analizaron el contenido de aminoácidos de P. ostreatus y P. major-caju y encontraron que el contenido de ácido glutámico era el más alto, seguido por el ácido aspártico y luego la arginina [63].

P.ostreatus y L. edodes mostraron actividades antivirales prometedoras contra adenovirus y herpes simplex virus-II, con un SI que alcanzó 4.5 para el extracto de P. ostreatus contra adenovirus. El SI se utilizó para evaluar la eficacia y seguridad de los extractos, ya que estima la ventana entre las actividades citotóxica y antiviral. Cuanto mayor sea el SI, más seguro y eficiente será el compuesto [64,65]. Datos relacionados fueron mostrados recientemente por Urbancikova et al., donde los suplementos a base de pleurano (insoluble -1,3/1,6-D-glucano aislado de P. ostreatus) acortaron significativamente la duración del virus del herpes simple. -I, con menor gravedad de los síntomas respiratorios, en pacientes positivos para el virus del herpes simple I que en el grupo placebo, sin efectos secundarios significativos, proponiendo pleural para un posible uso futuro en el tratamiento del virus del herpes simple I agudo [66].

El efecto antiviral de los hongos se debe principalmente a la interferencia con la absorción viral, la replicación, la actividad enzimática y el funcionamiento de los péptidos, así como a la potenciación del sistema inmunitario del huésped [67]. Seo y Choi (2021) propusieron que el -glucano en la fracción de polisacáridos de P.ostreatus y L.edodes puede ser responsable de su efecto antiherpético a través de efectos previos y posteriores al tratamiento [20]. El efecto anti-VIH de los extractos acuosos de P. ostreatus y L. edodes puede deberse a la inhibición de la enzima transcriptasa inversa por la proteína similar a la ubiquitina y la leptina, respectivamente [68,69].

Se demostró que los extractos acuosos de nuestros hongos inhiben la viabilidad de las líneas celulares de cáncer probadas en aproximadamente un 20 por ciento. También observamos efectos similares contra las líneas celulares de leucemia y linfoma, con una disminución de la viabilidad al 66 % con el extracto de L.edodes contra las células de leucemia THP1 y al 70,6 % con el extracto de P.ostreatus contra las células de leucemia CCRF-CEM. Se informó previamente que los extractos acuosos de micelio y cuerpos fructíferos de L. edodes ejercen acciones antiproliferativas y apoptóticas en las células de cáncer de mama MCF-7[70]. La fracción de acetato de etilo y -glucano de L. edodes fueron los principales responsables de estas acciones [71,72]. En el mismo contexto, el extracto de P. ostreatus pudo mostrar actividad antiproliferativa hacia las células de adenocarcinoma de mama MCF-7 y MDA-MB-231 [73], y los glucanos 6-ligados del extracto potenció la citotoxicidad del asesino natural contra las células de cáncer de mama y pulmón [74]. Recientemente, Jakopovic et al. encontraron que las preparaciones de hongos medicinales que consisten en 6 y 10 hongos, incluidos L. edodes y P. ostreatus, exhibieron efectos antiproliferativos y proapoptóticos significativos en las líneas de células tumorales colorrectales (HCT-116, SW620) [75]. Por el contrario, los autores observaron que el efecto sobre una línea celular de fibroblastos humanos (WI-38) era proliferativo, lo que demuestra la especificidad de estas preparaciones de hongos hacia las líneas celulares tumorales. De manera similar, detectamos una citotoxicidad mínima excretada por nuestros hongos contra las PBMC humanas normales. Este hallazgo también sugiere el uso seguro de nuestros hongos.

La citotoxicidad de los hongos se ha atribuido a una amplia gama de moléculas, incluidos x- y -glucanos, proteínas, glicoproteínas, ácidos grasos, antagonistas de nucleósidos, terpenoides y compuestos fenólicos [76]. Abdalla et al. (2012) propusieron que los extractos de hongos suprimían la proliferación de células de cáncer de mama al inhibir la actividad de la aromatasa [77]. Imán et al. (2021) aislaron un ácido indol-3-láctico de Ledodes que inhibía la división de las células de adenocarcinoma de pulmón [78]. Yukawa et al. (2012) sugirieron que el efecto apoptótico directo del micelio de L edodes en las células HepG2 es a través de la activación de las vías del receptor de muerte caspasa-3 y -8 [79]. Wu et al. (2011) estudiaron el efecto citotóxico del extracto de proteína de P. ostreatus en células de adenocarcinoma colorrectal humano (SW480) y una leucemia monocítica humana, THP-1(células), y reportaron generación de ROS, agotamiento del glutatión, la alteración del potencial de la membrana mitocondrial y la desintegración del ADN oligonucleosomal, lo que resulta en la apoptosis de las células SW480 [80].

Como los antioxidantes no actúan a través de un solo mecanismo, la evaluación de la capacidad antioxidante generalmente se realiza a través de más de un método [81]. En este estudio, se utilizaron tres métodos de evaluación, a saber, ensayos DPPH, ABTS y ORAC. El mecanismo antioxidante SET (transferencia de un solo electrón) se evaluó mediante el ensayo DPPH, mientras que los ensayos ABTS y ORAC se utilizaron para las reacciones HAT (transferencia de átomos de hidrógeno) [81]. El ensayo ORAC proporciona estimaciones más precisas ya que combina el tiempo de inhibición y el grado de inhibición en un solo término [82]. Si bien el ensayo de fosfomolibdato se usa comúnmente para expresar la capacidad antioxidante total (TAC), los tres métodos usados

en este manuscrito han sido reportados para evaluar el TAC. Munteanu y Apetrei (2021), en su revisión de los métodos utilizados para determinar la actividad antioxidante, describieron el ensayo de eliminación de radicales ABTS como un "método simple y conveniente utilizado para medir la capacidad antioxidante total (TAC)"[83]. En su estudio comparativo, Csepregi et al. (2016) compararon cuatro métodos utilizados para la evaluación de la TAC, que era la capacidad antioxidante equivalente de Trolox (TEAC), el potencial antioxidante reductor férrico (FRAP), el 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) ensayo de captación de radicales y reactividad del reactivo de Folin-Ciocalteu (FCR)[84]. En 2013, Ou et al. introdujeron ORAC como un método novedoso para la evaluación del TAC[85]. ) clasificó el ensayo ORAC como uno de los métodos directos para la determinación del TAC, junto con el TEAC [86]. Los resultados de los ensayos ABTS y ORAC muestran que los extractos de P. ostreatus y L. edode tienen capacidades antioxidantes superiores a las del antioxidante estándar, Trolox.

El efecto antioxidante de los dos hongos puede atribuirse a la presencia de muchos componentes bioactivos que incluyenflavonoides, fenólicos, péptidos bioactivos y vitamina C[87]. Gaber et al. compararon los ensayos ABTS, DPPH, poder antioxidante reductor férrico (FRAP) y ORAC para evaluar la capacidad antioxidante de los extractos de guayaba e informaron una correlación positiva entre los poderes antioxidantes, según lo determinado por los cuatro métodos, y el contenido de vitamina C y TPN. Por otro lado, registraron una correlación negativa con el contenido de carotenoides [88]. DPPH(1,1-Difenil-2-picril-hidrazilo) es un radical libre estable que tiene un electrón de valencia desapareado en un átomo del puente de nitrógeno; por lo tanto, la eliminación del radical DPPH es la base del popular ensayo antioxidante DPPH [89]. El catión radical 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS) pierde su color azul cuando se reduce con un antioxidante, y la alteración del color se puede cuantificar espectrofotométricamente [90]. El ensayo ORAC mide la degradación oxidativa de la sonda de fluorescencia por los radicales libres que son interrumpidos por la sustancia antioxidante. En consecuencia, cuanto mayor sea la capacidad antioxidante, menor será el tiempo necesario para extinguir la fluorescencia [91]. Además, dado que los extractos probados mostraron efectos antioxidantes prometedores cuando se probaron a través de los métodos mencionados anteriormente, se puede concluir que actúan a través deeliminación de radicales libres. Sin embargo, los hongos probados contenían un contenido total considerable de flavonoides, y dado que los flavonoides se han relacionado con la activación del factor transcripcional Nrf2 (2017), esto se puede agregar como un mecanismo putativo [92].

4. Materiales y Métodos

4.1.Preparación de especies de hongos y subcultivo

Los hongos P. ostreatus y L. edodes previamente identificados se obtuvieron, como semillas y/o cuerpos fructíferos, de la colección de cultivo del Centro de Investigación Agrícola, El Cairo, Egipto [93,94]. Se utilizaron cuchillas quirúrgicas para cortar asépticamente la fruta para el subcultivo a partir de cuerpos fructíferos de hongos. Los micelios internos se recolectaron con agujas estériles y se subcultivaron en placas estériles de agar papa dextrosa (PDA) (Merck, Darmstadt, Alemania) 95]. Para subcultivar los desoves fúngicos, se usaron fórceps estériles para recoger las semillas y transferirlas asépticamente a placas PDA estériles, que luego se incubaron a 28 grados durante 7 días, y los cuerpos fructíferos de cada cepa se lavaron por separado. Cada aislado (500 g) se dejó secar al aire durante 48 h a temperatura ambiente, se molió manualmente en un molinillo de cocina y se almacenó a temperatura ambiente en un área bien aireada para uso futuro.

4.2. Extracción acuosa de Pleurotus Ostreatus y Lentinus Edodes

La fruta seca de cada aislamiento se molió en un polvo de 500 g usando una licuadora doméstica, luego se maceró tres veces en 7 L de agua destilada a temperatura ambiente durante tres días, se ultrasonicó (limpiador ultrasónico, Inglaterra, Reino Unido) y luego se filtró. Se repitió el proceso de maceración y filtración hasta agotar el líquido. Se usó etanol para almacenar el rendimiento. Después de la evaporación con etanol a 45 grados, se liofilizó un total de 500 ml de cada aislado para producir aproximadamente 20 g de residuo seco de cada extracto [96].

4.3. Análisis proteómico

El análisis proteómico se realizó en la unidad de proteómica y metabolómica del Children's Cancer Hospital Egypt 57,357 (CCHE), El Cairo, Egipto. Aproximadamente 600 uL de 8 M de urea en 500 mM Tris (pH8.5) y 60 uL de ultraproteasas completas (Roche , Mannheim, Alemania) a cada muestra, y luego las muestras se agitaron vigorosamente y se centrifugaron a 10,000 RPM durante 30 min. Se recogieron los sobrenadantes y se inyectaron fracciones (1 ug/10 μL) utilizando el sistema NanoLC. El sistema TOF triple de espectrometría de masas (Sciex TripleTOF 5600 plus, AB SCIEX, Concord) se combinó con cromatografía líquida (LC) (3 um, ChromXP C18 CL, 120 A, 150 × 0,3 mm), que consta de un automuestreador Eksigent nanoLC400 conectado a una bomba Ekspert nanoLC425, con un caudal de 10 μL/min durante 55 min, para cada muestra [97]. El análisis de datos se realizó mediante ProteinPilot (versión 5.0.1.0,4895) y el algoritmo Paragon (versión 5.0.1.0,4874). Las secuencias de proteínas se alinearon con las secuencias en Swiss-Prot y la base de datos TrEMBL (Pleurotus sp. que contiene 14 792 entradas para P. ostreatus y Lentinula sp. que contiene 12603 entradas para L. edodes) [98]. Las proteínas comúnmente identificadas entre las especies de hongos se ilustraron utilizando el software Venny2.1.0.BioinfoGP [99] (Kingston upon Hull, Inglaterra, Reino Unido).

4.4. Caracterización de Compuestos Bioactivos

Como se informó anteriormente, el contenido total de carbohidratos solubles se determinó utilizando la técnica del ácido fenolsulfúrico [100]. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE) y los experimentos se realizaron por triplicado.

El contenido fenólico total (TPC) y el contenido total de flavonoides (TFC) se determinaron según lo informado por Ryan et al. [101]. Las muestras se prepararon a una concentración de 20 mg/mL en agua. Se preparó ácido gálico (solución madre de 1 mg/ml) en metanol. Se preparó rutina (solución madre de 1 mg/ml) en metanol. Los patrones y las muestras de ácido gálico se pipetearon en los pocillos de la placa en seis réplicas y se midieron a 630 nm. Cada uno de los 10 patrones y muestras de rutina en seis réplicas se midió a 420 nm.

El análisis HPLC de fenoles y flavonoides totales se realizó de acuerdo con el método de Singh et al. [102]. Cada una de las muestras y 10 soluciones estándar diferentes se disolvieron en metanol y se filtraron usando filtros de jeringa de 0,22 um, y luego se inyectaron 100 μL de cada muestra y 10 μL de cada estándar usando una columna de HPLC, Waters 2690 Alliance HPLC sistema equipado con un detector de matriz de fotodiodos Waters 996. Columna C18 Inertsil ODS3: 4,6 x 250 mm, 5 um; fase móvil: tampón (0,1 por ciento de ácido fosfórico en agua); el modo de elución con metanol fue en gradiente con un caudal de 1 ml/min a una longitud de onda de 280 nm.

Para el análisis de vitaminas solubles en agua, los extractos de hongos probados (50 mg/mL), estándares de referencia (10 mg en 10 mL0.05 M de hidróxido de sodio) de cada uno de las siete vitaminas hidrosolubles (tiamina HCl, ácido ascórbico, riboflavina, ácido nicotínico, nicotinamida, piridoxina HCl y ácido fólico)[103] y de las vitaminas liposolubles, soluciones (50 mg/mL) de los tres extractos de hongos y Se preparó una solución estándar en metanol de tres vitaminas grasas: E, D3 y A, a 806,2, 114 y 400 UI/mL, respectivamente. Luego, las soluciones se diluyeron a 100 ug/mL, se filtraron con un filtro de jeringa de 0,22 um y se inyectaron 100 μL en una columna de HPLC, sistema Waters 2690 Alliance HPLC (Milford, CT, EE. UU.) equipada con un detector de matriz de fotodiodos Waters 996. Columna Inertsil ODS 3∶4,6×250 mm, 5 μm; fase móvil: tampón (0,85 g de sal sódica del ácido hexanosulfónico en 1000 ml de agua y se ajustó el pH a 3 con ácido ortofosfórico); la elución con metanol se hizo en gradiente a una velocidad de flujo de 1 ml/min a una longitud de onda de 210 nm [104].

4.5. Análisis de proteínas y aminoácidos

La composición de aminoácidos de los extractos de hongos se evaluó utilizando un analizador de aminoácidos Sykam (Sykam GmbH, Alemania) equipado con un sistema de suministro de solvente, S 2100 (bomba cuaternaria con rango de flujo {{ 24}}.01 a 10.00 mL/min y presión máxima de hasta 400 bar), un muestreador automático, S5200, un módulo de reacción de aminoácidos, S4300 (con filtro dual incorporado fotómetro a 570 nm), y un organizador de reactivos refrigerado, S4130. Se mezcló un gramo de cada extracto de hongo con 5 mL de hexano y se dejó macerar durante 24 h, y luego se filtró la mezcla usando Whatman no. 1 papel de filtro. El residuo se colocó en un tubo de ensayo que contenía 10 ml de HCl 6 N y se incubó en un horno a 110 grados durante 24 h. Después de la incubación, se realizó la filtración usando Whatman no. 1 papel de filtro, seguido de evaporación en un evaporador rotatorio. El residuo se disolvió completamente en 2 ml de tampón de dilución (citrato trisódico deshidratado 0,06 M, ácido cítrico 0,03 M, fenol 0,02 M, tiodiglicol al 1,4 por ciento, HCL al 32 por ciento), diluido 1000-veces en el mismo tampón y luego se cargó en una columna de filtro de amoníaco (LCA, K04/Na, 4,6 × 100 mm, Sykam GmbH, Erasing, Alemania) equipada con un analizador automático de aminoácidos (Sykam) [105].

4.6. Culturas celulares

Células de cáncer de cuello uterino (HeLa), leucemia monocítica aguda (Thpl), carcinoma colorrectal (Colo-205) y carcinoma de ciego (LS-513) se mantuvieron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Lonza, Colonia, Alemania) complementado con 100 mg/mL de estreptomicina, 100 unidades/mL de penicilina y 10 por ciento de suero bovino fetal inactivado por calor. Otras líneas celulares: leucemia humana (CCRF-CEM); leucemia promielocítica aguda (NB-4); linfoma humano (U937); cáncer de próstata (DU-145 y PC3); carcinoma hepatocelular (HepG2); adenocarcinoma de mama (MCF-7 y MDA-MB-231); vero; y células Hep-2, se subcultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Invitrogen, California, EE. UU.), y la incubación se llevó a cabo a 37 grados en una atmósfera humidificada con 5 por ciento de CO2. Las líneas celulares se obtuvieron de Nawah Scientific Inc. (Mokatam, El Cairo, Egipto), mientras que las células mononucleares primarias de sangre periférica (PBMC) y las células humanas normales (ATCC PCS-800-011TM) se compraron de Viscera, El Cairo, Egipto. Este trabajo fue aprobado por el Comité de Investigación Ética de la Facultad de Farmacia de la Universidad Ain Shams (Aprobación No.294).

4.7.Actividad antiviral

Actividad antiviralse probó contra el adenovirus tipo 7 (Ad7) y el virus del herpes simple tipo II (HSV-2) (Nawah Scientific, Mokattam, Egipto). La actividad antiviral se evaluó como se describió previamente [106]. Se sembraron células Vero y Hep-2 en una placa de cultivo de 96-pocillos a una densidad de 2 × 10* células/pocillo un día antes de la infección. El medio de cultivo celular (Sección 4.6) se retiró al día siguiente y se usó solución salina tamponada con fosfato (PBS) para lavar las células. La infectividad del adenovirus humano y el virus del herpes simple tipo II se determinó mediante el método de la sulforhodamina B (SRB), que monitoreó los efectos citopáticos (CPE) y calculó el porcentaje de viabilidad celular [107]. La actividad antiviral se calculó en función de la capacidad de los extractos de hongos para inhibir los CPE virales, donde la concentración citotóxica del 50 por ciento (CC5o) y la concentración inhibidora del 50 por ciento (IC50) se determinaron utilizando el software GraphPad PRISM (Graph-Pad Software, San Diego , CA, EE. UU.). El índice de selectividad (SD) se calculó según lo establecido por Dogan et al. [108] según la ecuación (1)Índice de Selectividad (SI)=CC50/IC50

4.8.Citotoxicidad frente a PBMC mediante el ensayo MTT

La citotoxicidad se evaluó utilizando el ensayo MTT【109】. Se sembraron alícuotas (100 μL) de suspensiones celulares (densidad celular 1,2-1,8x10* células/pocillo) en 96-placas de pocillos, se añadió medio completo y las células se incubaron durante 24 h. Luego, las células se trataron con diluciones en serie de extractos de hongos durante 48 h. Se añadió solución de MTT (5 mg/ml) en PBS a los pocillos y se incubó durante 4 h, y se leyó la absorbancia a 570 nm utilizando un lector de microplacas. Las células no tratadas se usaron como controles negativos y las células tratadas con doxorrubicina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) sirvieron como control positivo.

4.9.Evaluación de la actividad citotóxica utilizando SRB contra líneas celulares de cáncer

Citotoxicidad contra el cáncer de próstata (DU{{0}} y PC3); carcinoma hepatocelular (HepG2); carcinoma colorrectal (Colo-205); carcinoma de ciego (LS-513); cáncer de cuello uterino (HeLa); y las líneas celulares de adenocarcinoma de mama (MDA-MB-231 y MCF-7) se evaluaron mediante un ensayo colorimétrico de sulforhodamina B (SRB) [110]. Las suspensiones celulares en medios completos (4.6) se incubaron en 96-placas de pocillos durante 24 h. Luego, se agregaron varias concentraciones (0 a 100 ug/mL en medio completo) de extractos de hongos y se incubaron durante 72 h. Las células no tratadas se usaron como controles negativos y las células tratadas con doxorrubicina sirvieron como control positivo.

4.10.La viabilidad de las líneas celulares de leucemia y linfoma utilizando el ensayo WST-1

La citotoxicidad contra la leucemia humana (CCRF-CEM), la leucemia promielocítica aguda (NB4), la leucemia monocítica aguda (THP1) y el linfoma humano (U937) se determinó mediante el ensayo de sal de tetrazolio soluble en agua (WST-1) usando Abcamkit ( ab155902 WST-1 reactivo de proliferación celular, Reino Unido). Las suspensiones celulares se incubaron durante 24 h y luego se trataron con diferentes concentraciones (0 a 100 ug/mL en medios completos) de extractos de hongos durante 48 h. A continuación, las células se trataron con 10 μl de reactivo WST-1 durante 1 h y se leyó A450 con un lector de microplacas [111]. Las células no tratadas se usaron como controles negativos y las células tratadas con doxorrubicina (Sigma-Aldrich, Alemania) sirvieron como control positivo.

4.11.Actividad antioxidante

4.11.1.DPPH Actividad de captación de radicales

El ensayo de captación de radicales DPPH se llevó a cabo de acuerdo con el método de Lu et al. [112]. La reducción resultante en el color DPPH se midió a 540 nm.Actividad antioxidantese expresó como el porcentaje de inhibición con referencia a la curva de calibración (R2=0.9903). Los datos se representan como medias ± DE de acuerdo con la ecuación (2): (porcentaje de actividad antioxidante=[(abs-blanco-abs-muestra)/abs-blanco]×100)

(2) donde abs-blanco y abs-muestra se refieren a la absorbancia del blanco y la muestra, respectivamente. Se estimó la concentración de muestra requerida para inhibir la mitad de los radicales libres (IC50).

4.11.2.ABTS (2,2'-Azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico))Actividad de eliminación de cationes radicales

El ensayo se llevó a cabo como se describió previamente 【113】. Los extractos de hongos (10 μL de soluciones de 0 a 100 ug/mL) se mezclaron con 190 μL de ABTS recién preparado (Sigma-Aldrich Alemania) en 96-placas de pocillos y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 horas Cada muestra se probó en cuatro réplicas y la absorbancia se midió a 734 nm. La actividad antioxidante se expresó como porcentaje de inhibición (Ecuación (1)) con referencia a la curva de calibración (R2=0.9948).

4.11.3. Ensayo de capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC)

El análisis se llevó a cabo como se determinó previamente [62], con modificaciones menores. Brevemente, 12,5 μL de los extractos de hongos, por triplicado, se incubaron con 75 μL de fluoresceína (10 nm) durante 30 min a 37 grados. La medición de la fluorescencia (485 EX, 520 EM, nm) se llevó a cabo durante tres ciclos (tiempo de ciclo=90 s). Luego, 12,5 μL de solución recién preparada de 240 mm de 2,2'-Azobis 2- Se agregó dihidrocloruro de amidinopropano (AAPH) (Ab-cam, Cambridge, Reino Unido) a cada pozo inmediatamente y la medición de fluorescencia continuó durante 2,5 h (85 ciclos, cada 90 s). El ensayo mide la pérdida de fluoresceína con el tiempo como resultado de la formación de radicales peroxilo por la descomposición de AAPH Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido carboxílico), una vitamina E soluble en agua análogo, sirvió como un control positivo inhibiendo la descomposición de la fluoresceína de una manera dependiente de la dosis.La actividad antioxidante se expresó como un porcentaje de inhibición (Ecuación (1) con referencia a la curva de calibración (R2= 0.9957).

4.12.Análisis estadístico

Se realizaron ensayos químicos por triplicado y los resultados se expresaron como medias ± desviaciones estándar. Los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA de una vía.

La significación de las diferencias entre medias se evaluó con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey-Kramer. Un valor de p menor o igual a 0.05 se consideró estadísticamente significativo. La evaluación estadística se determinó utilizando el software GraphPad PRISM (Graph-Pad Software, San Diego, CA, EE. UU.).

5. Conclusiones

Los hongos P. ostreatus y L.edodes contienen una amplia gama de compuestos bioactivos. El análisis del proteoma mostró la expresión de múltiples moléculas bioactivas con numerosas actividades biológicas. Los extractos acuosos de los hongos tienen prometedoresantivíricose detectaron actividades contra el adenovirus tipo 7 y el virus del herpes simple tipo II. Se detectaron CPE contra líneas de células cancerosas pero no contra PBMC humanas normales. El presente estudio fomenta el uso de estos hongos con fines farmacológicos a la luz de su baja citotoxicidad en PBMC normales, además de sus capacidades antivirales, antitumorales y antioxidantes.

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