Los análisis de proteómica y citocinas distinguen los casos de encefalomielitis miálgica/síndrome de fatiga crónica de los controles, parte 1

Abstracto

FondoLa encefalomielitis miálgica/síndrome de fatiga crónica (EM/SFC) es una enfermedad compleja y heterogénea caracterizada por fatiga persistente inexplicable y otras características que incluyen deterioro cognitivo, mialgias, malestar postesfuerzo y disfunción del sistema inmunológico. Las citocinas están presentes en el plasma y encapsuladas en vesículas extracelulares (EV), pero ha habido solo unos pocos informes sobre las características y la carga de las EV en EM/SFC. Varios estudios pequeños han descrito previamente proteínas plasmáticas o vías proteicas asociadas con EM/SFC.

Cistanche puede actuar como antifatiga y potenciador de la resistencia, y estudios experimentales han demostrado que la decocción de Cistanche tubulosa podría proteger eficazmente los hepatocitos hepáticos y las células endoteliales dañadas en ratones nadadores que soportan peso, regular positivamente la expresión de NOS3 y promover el glucógeno hepático. síntesis, ejerciendo así eficacia antifatiga. El extracto de Cistanche tubulosa rico en glucósidos feniletanoides podría reducir significativamente los niveles séricos de creatina quinasa, lactato deshidrogenasa y lactato, y aumentar los niveles de hemoglobina (HB) y glucosa en ratones ICR, y esto podría desempeñar un papel antifatiga al disminuir el daño muscular. y retrasar el enriquecimiento de ácido láctico para el almacenamiento de energía en ratones. Las tabletas compuestas de Cistanche Tubulosa prolongaron significativamente el tiempo de natación con carga de peso, aumentaron la reserva de glucógeno hepático y disminuyeron el nivel de urea sérica después del ejercicio en ratones, mostrando su efecto antifatiga. La decocción de Cistanchis puede mejorar la resistencia y acelerar la eliminación de la fatiga en ratones que hacen ejercicio, y también puede reducir la elevación de la creatina quinasa sérica después del ejercicio de carga y mantener normal la ultraestructura del músculo esquelético de los ratones después del ejercicio, lo que indica que tiene los efectos. de potenciación de la fuerza física y antifatiga. Cistanchis también prolongó significativamente el tiempo de supervivencia de los ratones envenenados con nitritos y mejoró la tolerancia contra la hipoxia y la fatiga.

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MétodosPreparamos vesículas extracelulares (EV) a partir de muestras de plasma congeladas de una cohorte de casos y controles de encefalomielitis miálgica/síndrome de fatiga crónica (EM/SFC) con datos de proteómica y citoquinas plasmáticas publicados previamente. El contenido de citocinas de las vesículas extracelulares derivadas del plasma se determinó mediante un ensayo múltiple y se evaluaron las diferencias entre pacientes y controles. Luego realizamos análisis estadísticos multiómicos que consideraron no solo estos nuevos datos sino también datos clínicos extensos que describen la salud de los sujetos.

Resultadosen los casos de EM/SFC exhibieron mayor tamaño y concentración de VE en plasma. Los análisis del contenido de citocinas en los vehículos eléctricos revelaron que la IL2 era significativamente mayor en algunos casos. Observamos numerosas correlaciones entre las citocinas EV, las citocinas plasmáticas y las proteínas plasmáticas a partir de la proteómica de espectrometría de masas. Las correlaciones significativas entre los datos clínicos y los niveles de proteínas sugieren las funciones de proteínas y vías particulares en la enfermedad. Por ejemplo, los niveles más altos de citocinas proinflamatorias, factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (CSF2) y factor de necrosis tumoral (TNF) se correlacionaron con mayores síntomas físicos y de fatiga en los casos de EM/SFC. Una serina proteasa SERPINA5 más alta, que participa en la hemostasia, se correlacionó con puntuaciones más altas de salud general SF-36 en EM/SFC. Los clasificadores de aprendizaje automático pudieron identificar una lista de 20 proteínas que podían discriminar entre casos y controles, y XGBoost proporcionó la mejor clasificación con una precisión del 86.1% y un valor AUROC con validación cruzada de { {15}}.947. Random Forest distinguió los casos de los controles con una precisión del 79,1 % y un valor AUROC de 0,891 utilizando solo 7 proteínas.

ConclusionesEstos hallazgos se suman al número sustancial de diferencias objetivas en biomoléculas que se han identificado en individuos con EM/SFC. Las correlaciones observadas de proteínas importantes en las respuestas inmunes y la hemostasia con datos clínicos implican además una alteración de estas funciones en EM/SFC.

Palabras claveEncefalomielitis miálgica/síndrome de fatiga crónica, Vesículas extracelulares, Plasma, Proteómica, Citocinas

Fondo

La encefalomielitis miálgica/síndrome de fatiga crónica (EM/SFC) es una enfermedad grave que se puede diagnosticar después de 6 meses de nueva fatiga debilitante, malestar post-esfuerzo, sueño no reparador y uno o ambos de dos síntomas adicionales, dificultad cognitiva o intolerancia ortostática. 1]. La mayoría de los pacientes informan que sus síntomas surgieron después de una enfermedad de tipo viral, pero casi siempre se desconoce la identidad de la infección anterior, aunque en ocasiones se ha implicado a la familia de los enterovirus [2, 3]. Antes de 2020, se estimaba que 65 millones de personas en todo el mundo padecían EM/SFC [4]. Desde la pandemia de SARS-COV2, un subconjunto de personas que han sufrido COVID agudo-19 han seguido experimentando síntomas [5], y algunas víctimas de COVID a largo plazo-19 cumplen el diagnóstico de EM/SFC criterios descritos anteriormente [6]. Del mismo modo, las personas que experimentan la enfermedad de la Guerra del Golfo tienen síntomas que se superponen tanto con el COVID prolongado como con el EM/SFC [7]. Sin embargo, varios ensayos, como la neuroimagen [8], distinguen la enfermedad de la Guerra del Golfo y la EM/SFC. Aún no se sabe si la COVID prolongada y la EM/SFC no asociadas con la infección por SARS-CoV-2 también se diferenciarán mediante imágenes u otras medidas.

Se ha informado que las proteínas relacionadas con el sistema inmunológico innato e involucradas en la cascada del complemento, así como en las vías relacionadas con la señalización de la dopamina, están enriquecidas en pacientes con EM/SFC en comparación con los controles en estudios que analizan el líquido cefalorraquídeo [9, 10 ]. A través del análisis de espectrometría de masas de plasma, también se informaron desregulaciones en el metabolismo de la energía, los lípidos y los aminoácidos en la EM/SFC [11-13]. Pero más recientemente, un análisis de proteoma plasmático relacionado con EM/SFC utilizando cromatografía líquida de ultra rendimiento y espectrometría de masas en tándem no dirigida identificó diferentes perfiles entre pacientes con EM/SFC, así como subgrupos de EM/SFC (con o sin SII), y controles y un conjunto de proteínas que pueden predecir el estado de EM/SFC con un grado razonablemente alto de precisión (Área bajo la curva (AUC)=0.774–0,838) [14].

Se sabe que la función inmune y las respuestas inflamatorias están reguladas por citocinas que actúan como moduladores y que su secreción puede ocurrir de forma clásica o mediante encapsulación en vesículas extracelulares, protegiéndolas de enzimas degradantes [15]. Los vehículos eléctricos son uno de los principales participantes en la comunicación entre células e impulsan patologías de enfermedades inflamatorias, autoinmunes e infecciosas [16-19] e informes anteriores han mostrado un mayor número de vehículos eléctricos en circulación, no solo en el cáncer y la enfermedad de Alzheimer [17, 20–22], pero también en EM/SFC [23–25]. Un estudio reciente sobre EV aislados de pacientes con EM/SFC y de sujetos con fatiga crónica idiopática y depresión clínica fue capaz de distinguir los dos grupos con un AUC de 0,802 utilizando únicamente los números de EV circulantes, lo que permitió un diagnóstico correcto en el 90-94 % de los pacientes. Casos de EM/SFC [24].

Se necesita urgentemente una mayor caracterización molecular de EM/SFC para proporcionar información sobre las alteraciones que ocurren en la enfermedad. Los estudios multiómicos realizados en el mismo conjunto de sujetos tienen un alto potencial para proporcionar nuevas hipótesis. Además, poder distinguir a los sujetos con EM/SFC de los controles sanos con una alta sensibilidad y especificidad permitiría monitorear el efecto de las terapias experimentales. La utilización de muestras de sangre para evaluar las anomalías asociadas a la EM/SFC sería particularmente valiosa en comparación con métodos que son más invasivos o engorrosos.

En este estudio, aislamos vesículas extracelulares (EV) de muestras de sangre recolectadas antes de 2020 de sujetos con EM/SFC y controles sanos y medimos su contenido de citocinas. Estos datos recién generados, junto con los datos ya publicados de un análisis proteómico plasmático por espectrometría de masas en tándem [14] y la determinación de los niveles de citocinas plasmáticas [26] en las mismas muestras, se utilizaron juntos para múltiples análisis estadísticos. Identificamos un conjunto de citocinas EV que difieren significativamente en niveles entre sujetos con EM/SFC y controles. Observamos correlaciones entre los niveles de diferentes citocinas EV, entre los niveles de citocinas plasmáticas, entre las citocinas EV y las citocinas plasmáticas, y entre las citocinas y otras proteínas plasmáticas. También detectamos relaciones entre las citoquinas plasmáticas y la gravedad de ciertos síntomas de EM/SFC. En los controles, los niveles de cuatro proteínas plasmáticas se relacionaron con las medidas de salud. Una proteína implicada en la hemostasia, SERPINA5, se correlacionó positivamente con puntuaciones más altas de función SF-36. Utilizando el aprendizaje automático, identificamos las 20 proteínas con los valores de importancia de características más altos. Utilizando estos 20 analitos y XGBoost, pudimos discriminar EM/SFC y controlar a los sujetos con una sensibilidad y especificidad extremadamente altas (AUC=0.947).

Métodos

Población de estudio

En el marco de este estudio se analizó una subpoblación de 49 casos de EM/SFC y 49 controles sanos de la cohorte de la Iniciativa de Fatiga Crónica [27]. Todos los casos cumplieron con los criterios de consenso canadienses de Fukuda de los CDC de 1994 [28] y/o de 2003 para EM/SFC [29]. El día de la extracción de sangre, los síntomas clínicos y el estado de salud inicial se evaluaron mediante la Encuesta de salud Short Form 36 (SF-36) ​​[30] y la escala del Inventario de fatiga multidimensional (MFI) [31]. Se extrajo sangre periférica en tubos de preparación de células BD VacutainerTM con citrato de sodio y se centrifugó para sedimentar glóbulos rojos. Las muestras de plasma resultantes se recibieron de cuatro lugares de los médicos supervisores, como se muestra: Salt Lake City, Utah (Lucinda Bateman), Incline Village, Nevada (Daniel Peterson), Miami, Florida (Nancy Klimas) y Nueva York, Nueva York (Susan Levine) y se almacenó a -80 grados y se envió desde la Universidad de Columbia a la Universidad de Cornell en hielo seco y se almacenó a -80 grados antes del procesamiento para el aislamiento de vesículas extracelulares. Se obtuvo el consentimiento por escrito de todos los participantes y todos los protocolos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia.

Purificación de vesículas extracelulares.

Se aislaron vesículas extracelulares (EV) de muestras de plasma mediante precipitación utilizando el reactivo ExoQuick™ (System Biosciences, Palo Alto, CA, EE. UU.) como se describió anteriormente [25]. Brevemente, las muestras de plasma de cada sujeto se descongelaron en hielo y se centrifugaron a 3000xg durante 15 minutos a temperatura ambiente para eliminar las células y los desechos. Se añadió trombina (611 U/ml) (System Bioscience, Palo Alto, CA, EE. UU.) y las muestras se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar el fibrinógeno, se centrifugaron a 10,000xg durante 5 minutos y se recogió el sobrenadante. Luego, las muestras se incubaron con ExoQuick™ durante 60 min a 4 grados, se centrifugaron a 12.000 xg durante 5 min y el sedimento resultante se resuspendió en 250 ul de solución salina tamponada con fosfato estéril 1X, pH 7,4. Se dividieron alícuotas de muestras para la cuantificación de citocinas/quimiocinas y factores de crecimiento.

Tamaño y cuantificación de vesículas extracelulares.

La concentración y la distribución del tamaño de los vehículos eléctricos aislados se analizaron en muestras utilizando un instrumento NanoSight NS300 (Malvern, Worcestershire, Reino Unido) en las instalaciones de ciencia y tecnología a nanoescala de Cornell. Las muestras se descongelaron y se diluyeron a 1:2000 en PBS 1X y se inyectó 1 ml a través de la cámara láser (NanoSight Technology, Londres, Reino Unido). El software NanoSight NTA 2.3 adquirió y analizó tres grabaciones de 60 videos digitales de cada muestra para determinar el tamaño y la concentración de las nanopartículas. Los resultados se promediaron juntos.

Perfil inmunológico del plasma y vesículas extracelulares.

Las moléculas inmunes en plasma se midieron previamente utilizando un inmunoensayo 61-plex basado en perlas magnéticas (inmunoensayo ProcartaTM personalizado, Affymetrix) [26]. El perfil inmunológico de las vesículas extracelulares se realizó en el Laboratorio del Servicio de Química Nutricional Humana de la Universidad de Cornell utilizando un kit de cuentas magnéticas 48-plex humano (Bio-Plex Pro Human Cytokine Screening Panel, 48-plex, Bio-Rad ). Antes del análisis, las muestras de EV se trataron con Triton al 1% para permitir la liberación de citocinas encapsuladas [32]. Cada muestra se midió por duplicado en un sistema de multiplexación MAGPIX® (Luminex Corp.). Para cada pocillo, utilizamos la intensidad de fluorescencia media de todas las perlas medidas para un analito determinado y promediamos las dos réplicas, y los resultados se aceptaron cuando el coeficiente de variación (CV) fue inferior al 15%.

Proteómica plasmática

El perfil proteómico del plasma se realizó en la Universidad de Columbia como se describió anteriormente [14]. Las muestras de los 49 casos de EM/SFC y 49 controles incluidos en este estudio se analizaron en dos lotes de 20 muestras (11 casos de EM/SFC, 9 controles) y 78 muestras (38 casos de EM/SFC, 40 controles). Las 20 muestras del primer lote se seleccionaron al azar. Los casos y controles fueron emparejados por frecuencia en las mismas variables coincidentes que la población total del estudio. Se midieron un total de 257 y 279 proteínas anotadas en el 20-conjunto de muestras de sujetos y 78-conjunto de muestras de sujetos, respectivamente, con una superposición de 207 proteínas anotadas en ambos conjuntos de muestras.

análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando R versión 4.0.2 (2020-06-22) a través de RStudio. Para cada analito proteico, los valores no detectables se reemplazaron por la mitad de su valor mínimo. Luego, los niveles de proteína se transformaron logarítmicamente con base 2 y se estandarizaron para análisis posteriores. Se calcularon las puntuaciones Z y los valores P para el análisis de valores atípicos. Se realizaron pruebas no paramétricas de rangos con signo de Wilcoxon para probar la significancia de las diferencias (p<0.05) between cases and controls for age, BMI, SF-36 survey scores, and EV sizes and concentrations. The robust linear regression was performed using the lm function in the MASS package for determining the significance of differences for each analyte in control and ME/CFS groups with age, BMI, Irritable Bowel Syndrome (IBS), and sex as confounding variables. Robust linear regression was performed to eliminate contamination with outliers or influential observations. Robust linear regression is a form of weighted least squares regression, and we chose M-estimation with Huber weighting [33, 34] for further analysis.

Se utilizó el Análisis de Componentes Principales (PCA) para simplificar los datos y aumentar la interpretabilidad al reducir la dimensionalidad de los conjuntos de datos de niveles de proteína. La PCA se realizó utilizando el paquete de estadísticas de R. Los coeficientes de correlación de rangos de Spearman también se estimaron dentro de los analitos de proteínas y entre las proteínas y los metadatos (edad, IMC, sexo, puntuaciones SF-36, SII). Se utilizaron correlaciones biseriales puntuales cuando una de las variables era binaria (p. ej., mujer frente a hombre, con o sin SII). Las variables categóricas se codificaron de la siguiente manera: Cohorte: control=0; EM/SFC=1; Sexo: femenino=0; masculino=1; SII: sin SII=0; con SII=1. En todo momento, todos los valores de p se ajustaron para múltiples hipótesis utilizando el método de Benjamini-Hochberg (FDR) [35, 36].

Se utilizó un enfoque de aprendizaje automático para identificar variables que discriminan los dos grupos de muestras (selección de características). La clasificación de muestras como EM/SFC o controles sanos se llevó a cabo mediante el uso de tres algoritmos de aprendizaje supervisados: bosque aleatorio [37] implementado utilizando la función Bosque Aleatorio de R; XGBoost [38] usando el paquete xgboost de R y la penalización del Operador de selección y contracción mínima absoluta (LASSO) [39] aplicada a la regresión logística usando la función glmnet de R. Como características, los algoritmos utilizaron los 353 analitos proteicos, citocinas EV, citocinas plasmáticas y proteómica plasmática. Se calculó la importancia de las características para cada clasificador. Para LASSO, los coeficientes de las características "sin importancia" se reducen a cero, por lo tanto, la importancia de la característica se puede evaluar mediante un "porcentaje" (de 250 iteraciones de validación cruzada de remuestreo aleatorio) en el que la estimación del parámetro del predictor en el modelo que mejor se ajusta es distinta de cero. Para el bosque aleatorio, la "precisión de disminución media (MDA)" de una característica es la disminución en la precisión de la clasificación debido a la permutación aleatoria de los valores en esa característica. Para los predictores sin importancia, la permutación debería tener poco o ningún efecto en la precisión del modelo, mientras que la permutación de valores de predictores importantes debería disminuirla significativamente. Por lo tanto, cuanto mayor sea la importancia de una característica, mayor será la disminución de la precisión cuando se permutan sus valores. Finalmente, para XGBoost, la métrica "Ganancia" indica la ganancia promedio en todos los árboles en los que se utiliza la característica, lo que describe la contribución relativa de cada característica.

La importancia de las características se calculó mediante el promedio de más de 250 réplicas de una validación cruzada quíntuple. Los analitos de proteínas que se clasificaron entre los 20 primeros en mediciones de importancia en los tres clasificadores (Tabla 5) se ajustaron nuevamente como predictores en los mismos clasificadores. Las curvas de las características operativas del receptor (ROC) y el área bajo la curva (AUC) utilizadas para optimizar la selección de funciones se calcularon utilizando el paquete R. Los datos se transformaron logarítmicamente y se escalaron automáticamente antes de generar las curvas ROC. Se utiliza una penalización de lazo cuando se seleccionan muchos predictores y variables que son importantes para la predicción. Dado que estábamos usando variables que ya se consideraban importantes, en la Fig. 8 se utilizó una regresión logística no regularizada en lugar de la penalización de lazo. Las AUC promedio se calcularon con 250 repeticiones de validación cruzada quíntuple, cuyo objetivo es derivar una estimación más precisa del modelo. rendimiento de predicción. Se calcularon las importancias de las características para cada uno de los tres algoritmos de aprendizaje automático.

Resultados

Características de la población de estudio.

Dentro de la población de estudio, había 41 mujeres y 8 hombres y 40 mujeres y 9 hombres en los grupos EM/SFC y controles sanos, respectivamente (Tabla 1). Todos los pacientes seleccionados cumplieron con la definición de Fukuda de 1994 para EM/SFC. La edad promedio y el índice de masa corporal (IMC) fueron similares entre ME/SFC y los sujetos de control y también en la comparación de sexos entre grupos (Tabla 1). El setenta y nueve por ciento de los pacientes con EM/SFC pudieron identificar una enfermedad aguda, a menudo similar a una enfermedad, que precedió inmediatamente a la aparición de la enfermedad, mientras que el 20% desconocía un evento iniciador y consideraba que su aparición era gradual (Tabla 1), y 45 de 49 pacientes tuvieron su enfermedad durante más de 3 años. Las puntuaciones del MFI-20 representan la tendencia opuesta de la condición de los sujetos con EM/SFC versus los controles, con una puntuación más alta que refleja el nivel funcional más bajo de los pacientes en comparación con la puntuación más pequeña de los controles completamente funcionales (Tabla 1, p < 0,001 ). Además, las puntuaciones de los componentes físico y mental (PCS y MCS respectivamente) derivadas de la encuesta corta SF-36 fueron, como se esperaba, más altas en el grupo de control (p < 0,001, Tabla 1).

El Análisis de Componentes Principales presentado en la Fig. 1 se realizó con datos obtenidos de los cuestionarios SF-36 y MFI-20. Los dos primeros componentes principales explicaron el 86.9% (PC-1 75.1%; PC-2 11.8%, Fig. 1a) y el 92,6% (PC-1 86. 89%; PC-2 5.73%, Fig. 1b) de la varianza total dentro del conjunto de datos para SF-36 y MFI-20 respectivamente, y se observaron dos grupos significativos, separando los Grupo EM/SFC del grupo de control. Ni la temporada ni el sitio donde se extrajo la sangre pudieron distinguir los grupos (archivo adicional 1: Fig. S1).

El tamaño y las concentraciones de las vesículas extracelulares son diferentes entre EM/SFC y controles sanos

Las vesículas extracelulares se purificaron a partir de muestras de plasma de pacientes con EM/SFC y de individuos sanos mediante precipitación y su tamaño y concentraciones se analizaron mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para investigar si había diferencias entre los grupos clínicos. Todas las nanopartículas purificadas eran menores de 500 nm, y la mayoría de ellas estaban en el rango típico de tamaño de exosoma de 30 a 130 nm [40]. NTA reveló que el tamaño medio de las partículas de EV difería entre individuos sanos (136,2 ± 18,3 nm, rango 97–188 nm) y pacientes con EM/SFC (145,3 ± 16,6 nm, rango 113–177 nm) (p=0.01 , figura 2a). La concentración total media de partículas/ml de plasma (controles: 8,0±3,8× 108; EM/SFC: 10,5±3,9× 108, p<0.001, Fig. 2b), the mean concentration of EVs that ranged from 30 to 130 nm in size (controls:4.3±1.8× 108,  ME/CFS:5.3±2.4× 108, p=0.05, Fig. 2c) and the mean concentration of particles greater than 130 nm (controls: 3.7±2.9× 108; ME/CFS: 5.6±2.7× 108, p<0.001, Fig. 2d) also exhibited a statistically significant difference between groups.

El análisis de valores atípicos da como resultado la eliminación de la consideración adicional de los datos de ciertos sujetos

Examinamos la cantidad de analitos atípicos en todos los conjuntos de datos. Se descartó cualquier analito con más de la mitad de los valores no detectables, por lo que se eliminaron 6 de las 61 citoquinas plasmáticas. Se calculó una puntuación z para cada sujeto y cada analito. Cualquier par de sujeto/analito con un valor q bilateral (valor p ajustado para FDR) menor que 0.05 se consideró un valor atípico. Los valores q resultantes sugirieron que dos pacientes con EM/SFC presentaban perfiles atípicos que inicialmente no se sospechaban por sus características clínicas y, por lo tanto, deberían eliminarse del conjunto de datos de citocinas EV, ya que representaban el 43% y el 50% de los valores atípicos respectivamente (21 y 24 valores atípicos de 48 citocinas). Para el conjunto de datos de citoquinas plasmáticas, ningún sujeto tuvo una proporción particularmente alta de valores atípicos, y para la proteómica plasmática, un paciente con EM/SFC presentó un 35 % de valores atípicos (73 valores atípicos de 208 proteínas plasmáticas) y, por lo tanto, no se utilizó en análisis posteriores.

Ciertos niveles de citocinas EV y de citocinas plasmáticas difieren entre los grupos EM/SFC y de control

Investigamos las diferencias en los niveles de analitos entre pacientes con EM/SFC y controles utilizando pruebas de Wilcoxon de rango con signo no paramétricas. Entre las citocinas EV, los niveles de interleucina 2 (IL2) fueron significativamente diferentes entre los controles y los pacientes (q=0.007) y las siguientes 16 citocinas EV exhibieron {{32} }.1 < q < 0,2: IL12P40, TNF, IL1, CXCL8, CXCL1, IL15, CCL7, IL17, IL4, GM-CSF/CSF2, IL3, CCL5, NGF, IL1, IL7, IL1R1. La Figura 3 muestra diagramas de caja de los niveles de proteína transformados logarítmicamente de estas 17 citocinas. Para las citocinas plasmáticas [41] y la proteómica plasmática [14], ningún analito fue significativamente diferente entre los casos y los controles después de la corrección para comparaciones múltiples (FDR <0,2). Los valores p detallados, los valores q y las proporciones del nivel medio de analito proteico para el grupo EM/SFC frente a los controles se pueden encontrar en el archivo adicional 2: Tablas.

Además, comparamos tipos de muestras dentro de los sujetos con el Análisis de Componentes Principales. Para este análisis se utilizó un total de 36 analitos comunes de los inmunoensayos de plasma 48-plex EV y 55-plex. El porcentaje de variabilidad explicada por cada dimensión fue del 46,2% para el primer eje y del 15% para el segundo eje, observándose dos conglomerados significativos (fig. 4).

Existen numerosas correlaciones dentro y entre conjuntos de datos de proteínas.

Se realizaron análisis de correlación de Spearman entre conjuntos de datos y se representan como correlogramas que muestran solo correlaciones significativas con coeficiente r mayor o igual a 0.6 (Fig. 5). Se encontró un total de 316 correlaciones significativas positivas en sujetos con EM/SFC y 300 en controles entre los niveles de citoquinas en muestras de EV (q<0.01) and 88 and 73 had strong Spearman correlation coefcients (r ≥0.6) in the ME/CFS and control groups, respectively (Fig. 5a). Tirty-four of them were common to both groups (pink squares, Fig.  5a). When correlating plasma cytokines to each other, the ME/CFS cohort had 710 signifcant correlations including 327 at r ≥0.6 (q<0.01), and the control group had 394 with 146 at r ≥0.6 (q<0.01); 136 were common to both groups (Fig. 5b). In both EV and plasma cytokine correlation analysis, no signifcant negative correlations were found, and there was a higher number of positive correlations in the ME/CFS cohort as compared to the healthy individuals (Fig. 5a, b).

También investigamos las correlaciones entre los niveles de 55 citocinas en plasma y 48 EV (archivo adicional 1: Fig. S2). No se encontraron correlaciones significativas negativas y pocas positivas en ambos grupos (15 y 13 para EM/SFC y controles respectivamente en r mayor o igual a 0.5, con 4 comunes a ambos grupos). Entre estas correlaciones significativas, los niveles de LIF en EV se correlacionaron con 8 citocinas plasmáticas en EM/SFC (CCL3, IL15, LIF, IL17, IL21, IFN, TGF y TGF) y 5 en el grupo de control (CCL3, IL1, IL17, IL21 e IFN) (Figura complementaria 2).

Para la proteómica plasmática, se encontraron 160 y 130 correlaciones positivas significativas en los grupos EM/SFC y control, respectivamente, con un coeficiente de Spearman r mayor que 0.8 (q < 0.01) (Fig. 5c) y 42 fueron comunes a ambos grupos (cuadrados rosados, Fig. 5c). Seis pares de proteínas se correlacionaron significativa y negativamente solo en el grupo EM/SFC (cuadrados naranjas, Fig. 5c), 3 incluyeron SERPINA7 y uno exclusivo del grupo control (SERPINA1/KNG1, r=− 0,82 , q < 0,01, cuadrado azul claro, Fig. 5c).

Al analizar las relaciones entre el conjunto de datos de proteómica plasmática con los conjuntos de datos de citocinas EV o de citocinas plasmáticas, solo se encontró una correlación significativa entre una proteína EV y una proteína analizada mediante espectrometría de masas en el grupo de control (CXCL12-ev/PROZ , r=0.69, q=0.014).

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