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Linbai|Gui‐ying Shi|Ya‐jun Yang|Wei Chen|Lian-feng Zhang|chuan qin

Cistanche tiene un efecto antienvejecimiento.

Resumen

Fondo: La disminución relacionada con el tiempo en la capacidad regenerativa y la homeostasis de los órganos es una característica importante deenvejecimiento. Rehmannia glutinosa y Astragalus membranaceus se han utilizado como hierbas medicinales chinas tradicionales para mejorar la inmunidad y prolongar la vida. Sin embargo, se desconoce el mecanismo por el cual este medicamento a base de hierbas retrasa el envejecimiento. En este estudio, investigamos el mecanismo de la hierbaefecto antienvejecimiento.

Métodos: Los ratones fueron alimentados con dietas suplementadas con R. glutinosa o A. membranaceus durante 10 meses; el grupo de control fue alimentado con una dieta estándar. Los fenotipos se evaluaron utilizando un sistema de puntaje de clasificación y análisis de supervivencia. Los porcentajes de los fenotipos de senescencia de las células madre hematopoyéticas (HSC) se determinaron mediante análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia. La función y el mecanismo de las HSC se analizaron mediante un ensayo clonogénico y la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real.

Resultados: Elefecto antienvejecimientode R. glutinosa se debe a la función mejorada de las HSC. Los ratones alimentados con R. glutinosa mostraron características de un lentoenvejecimientoproceso, incluida la disminución de la senescencia y el aumento de la tasa de supervivencia. El análisis de citometría de flujo mostró una disminución en el número de células Lin–Sca1 más c‐kit– (LSK), HSC a largo plazo (LT‐HSC) y HSC a corto plazo (ST‐HSC) en el grupo de R. glutinosa. Los ensayos clonogénicos in vitro mostraron una mayor capacidad de autorrenovación de las LT‐HSC del grupo R. glutinosa, así como el mantenimiento de la quiescencia de LSK a través de la expresión de p18 regulada al alza. El grupo de R. glutinosa también mostró niveles reducidos de especies reactivas de oxígeno y el porcentaje de células ‐gal plus a través de la regulación a la baja de la proteína asociada a la senescencia celular p53 y p16.

Conclusión: Rehmannia glutinosa ejerceantienvejecimientoefectos manteniendo la quiescencia y disminuyendo la senescencia de las HSC.

PALABRAS CLAVE:antienvejecimiento, células madre hematopoyéticas, quiescencia, Rehmannia glutinosa

1|INTRODUCCIÓN

El envejecimiento se define como el declive funcional dependiente del tiempo que afecta a la mayoría de los organismos vivos.1 La longevidad de los organismos la mantienen principalmente las células madre.2 Las células madre específicas de tejido tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en una variedad de células efectoras. 3 Sin embargo, durante el proceso de envejecimiento, esta capacidad de autorrenovación disminuye, lo que eventualmente lleva a la acumulación de tejidos dañados y sin reparar en organismos envejecidos.4 Pérdida de la capacidad de mantener un equilibrio entre la inactividad y la diferenciación en la célula madre/progenitora puede provocar la muerte o enfermedades asociadas con la edad.2 Además, estudios recientes sugieren que el rejuvenecimiento de las células madre puede revertir el fenotipo del envejecimiento.5,6 En el sistema hematopoyético, las células madre hematopoyéticas (HSC) son responsables de la producción de células sanguíneas. En ratones de edad avanzada, el sistema hematopoyético muestra deterioro de las células linfoides T y B y aumenta el número de células mieloides. Las HSC envejecidas mostraron una actividad de autorrenovación reducida y una capacidad de reconstrucción de la hematopoyesis reducida. En particular, los cambios relacionados con la edad en el compartimiento de HSC se manifiestan en el huésped que envejece como anemia, mayor propensión a las neoplasias mieloproliferativas, disminución de la función inmunitaria y aumento de la incidencia de cáncer.7-9 Sin embargo, el mecanismo del envejecimiento de las HSC y se desconocen los efectos de las hierbas medicinales sobre el envejecimiento de las HSC.10

La gente se ha preocupado por retrasar el proceso de envejecimiento y mantenerse joven desde la antigüedad yantienvejecimientoes un foco actual de investigación. La medicina tradicional china ha recibido una atención creciente para el tratamiento de diversas enfermedades asociadas con el envejecimiento. Se sabe que muchas hierbas utilizadas en la medicina tradicional china proporcionan efectos positivos contra el envejecimiento a través de diferentes mecanismos. Rehmannia glutinosa y Astragalus membranaceus se han utilizado ampliamente de esta manera durante miles de años.

Rehmannia glutinosa se usa para tratar varios trastornos diabéticos, mejorar el metabolismo óseo en la osteoporosis e inhibir la inflamación y la fibrosis del hígado. Además, esta hierba tiene otros efectos que incluyenanti fatiga, propiedades antidepresivas y neuroprotectoras. En los últimos años, los estudios farmacológicos sobre la R. glutinosa y sus componentes activos se han centrado principalmente en sus amplias acciones sobre los sistemas sanguíneo, endocrino, cardiovascular y nervioso.11-14 Por lo tanto, se demostró que la R. glutinosa posee un fuerte sistema inmunológico ‐actividad de mejora, que ha proporcionado la base teórica para estudios posteriores.

Astragalus membranaceus posee propiedades tónicas, hepatoprotectoras, diuréticas y expectorantes15 y se ha demostrado que exhibe inmunomoduladores,16antiinflamatorio,yantioxidanteefectos.17 La elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a los efectos de los medicamentos tradicionales chinos en la práctica clínica es un paso clave hacia su aplicación en todo el mundo, y este tema es actualmente un tema de intenso interés de investigación.

Por lo tanto, en este estudio, alimentamos a ratones con dietas suplementadas con R. glutinosa y A. membranaceus durante 10 meses para explorar el mecanismo subyacente a la capacidad de R. glutinosa para aumentar la longevidad.

2|MATERIALES Y MÉTODOS

2.1|Agrupación y tratamiento de animales.

Los ratones hembra C57BL/6J se mantuvieron en un ambiente libre de patógenos y se alimentaron con una dieta estándar. El uso de animales en este estudio fue aprobado por los Comités de Uso y Cuidado de Animales del Instituto de Ciencias de Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina de la Unión de Pekín. Los ratones (de 10 meses de edad) se dividieron aleatoriamente en tres grupos (n=20/grupo). El grupo de control fue alimentado con una dieta estándar (Beijing HFK Biosicence, Beijing, China). Las dietas de los otros dos grupos se complementaron con R. glutinosa y A. membranaceus molidas (Beijing Tong Ren Tang Chinese Medicine, Beijing, China), respectivamente, a una dosis de 200 mg/d durante 10 meses. Esta dosis se seleccionó utilizando el método de normalización del área de superficie corporal para confirmar las dosis de fármaco de los estudios en humanos a los estudios en ratones. El peso corporal se determinó cada 2 meses y la supervivencia se registró diariamente.

2.2|Evaluación del grado de senescencia

Se adoptó un sistema de puntaje de clasificación para evaluar el grado de senescencia de acuerdo con los criterios definidos por Takeda et al.18 Cada categoría enumerada en el protocolo se seleccionó de los signos clínicos asociados con el proceso de envejecimiento. Se puntuó cada ratón a los 18 meses de edad y se sumó la puntuación en cada categoría para determinar la puntuación de clasificación general.

2.3|Citometría de flujo

Se recogieron células del timo, bazo, sangre periférica (PB) y médula ósea (BM). El bazo y el timo se extirparon inmediatamente, se lavaron con solución salina y se pesaron. Los bazos y los timos se homogeneizaron suavemente en un homogeneizador de vidrio y las células se suspendieron en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Las células de PB se aplicaron a la lisis de glóbulos rojos sanguíneos (BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.). Las células de BM se aislaron lavando tibias y fémures con PBS estéril. Todas las células se aislaron por filtración a través de una malla de nailon estéril y se tiñeron durante 30 minutos a 4 grados con los siguientes anticuerpos conjugados con fluoróforo: anti-CD3 conjugado con ficoeritrina (PE) (G4.18), anti-CD3 conjugado con aloficocianina (APC) ‐ CD4 (OX35) y anti‐CD8a conjugado con PE‐Cy7 (OX8). Para las células de MO, los marcadores de linaje se tiñeron usando biotina conjugada con anti-ratón CD4 (RM4-5), CD5 (53-7,3), CD8a (53-6,7), CD11b (M1/70), B220 (RA3-6B2), TER119 (TER-119) y Gr1 (RB6-8C5), seguido de tinción con el anticuerpo APC-eFluor 780-estreptavidina conjugada también se obtuvo de eBioscience (San Diego, CA, EE. UU.). Se usaron los siguientes anticuerpos para la tinción superficial: inmunoglobulina APC (Ig)M (II/41), isotiocianato de fluoresceína (FITC) IgD (11‐26), PE‐Cy7 Sca‐1 (D7), PE Flt3 ( A2F10), FITC B220 (RA3‐6B2), FITC CD34 (RAM34), PerCP‐Cy5.5 CD127 (A7R34), PE CD16/CD32 (93) y PerCP‐Cy5.5 CD3e (145‐2C11). Todos los anticuerpos se obtuvieron de eBiosciences (San Diego, CA, EE. UU.). Los datos fueron adquiridos por un FACS

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) y se analizó con el software FlowJo (Three Star, Ashland, OR, EE. UU.).

2.4|Análisis del ciclo celular

Para el análisis del ciclo celular, las células de MO totales se tiñeron para marcadores de superficie de células madre (Lin–Sca‐1 más c‐KitHigh; LSTK), luego se fijaron y permeabilizaron (00‐5123‐43; Becton Dickinson ) antes de la tinción con FITC Ki‐

67 anticuerpo y 7-aminoactinomicina D (7-AAD). La adquisición de datos se realizó en FACS Aria II (Becton Dickinson). Los datos se analizaron mediante el software FlowJo.

2.5|Tinción ‐gal asociada a la senescencia

La actividad de ‐gal asociada a la senescencia (SA) también se analizó mediante citometría de flujo utilizando C12FDG según lo descrito por el fabricante (Molecular Probes, Eugene, OR, EE. UU.). Brevemente, las células madre se tiñeron primero en busca de marcadores de superficie celular y luego se incubaron con 100 nmol L-1 de bafilomicina A1 durante 1 hora a 37 grados para inducir la alcalinización lisosomal. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con 2 mmol L-1 C12FDG durante 1-2 horas a 37 grados y luego se analizaron usando un FACS Aria I (Becton Dickinson).

2.6|Determinación de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS)

Las células se incubaron con diacetato de dicloro-dihidro-fluoresceína (DCFH-DA; Beyotime, Shanghai, China) a 37 grados durante 20 minutos. La DCFH‐DA se difunde pasivamente en las células, donde es desacetilada por las esterasas para formar 2′,7′‐diclorofluoresceína (DCFH) no fluorescente. La cantidad de fluorescencia emitida se correlaciona con la cantidad de ROS en la célula. Los datos se adquirieron en un FACS Aria I (Becton Dickinson) y se analizaron usando el software FlowJo.

2.7|Análisis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real

El ARN total se extrajo de las células utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, San Diego, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los genes de interés se amplificaron a partir de ARN totales tratados con DNasa I utilizando transcriptasa inversa M‐MLV (Promega, Madison, WI, EE. UU.)

y cebadores poli-dT. Los cebadores utilizados para la PCR fueron los siguientes: p21 (5′‐TCCAGACATTCAGAGCCACA‐3′ y 5′‐CGAAGAGACAACGG-CACACT‐3′, Tm=60 grados, 30 ciclos), p53 (5′‐CATGAACCGCCGACC- TATC‐ 3′ y 5′‐TCCCGGAACATCTCGAGGC‐3′, Tm=62 grados, 35 ciclos), p16 (5′‐CGAACTCTTTCGGTCGTACCC‐3′ y 5′‐ CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC‐3′, Tm=62 grados, 35 ciclos), p57 (5′‐ AGGAGCAGGACGAGAATCAA‐3′ y 5′‐ TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT‐3′, Tm=61 grados, 30 ciclos), p19 (5′‐ATGGGTCGCAGGTTCTTGGT‐ 3′ y 5′‐GTAGTGGGGTCCTCGCAGTT‐3 ′, Tm=61 grados, 35 ciclos), p18 (5′‐GGGACCTAGAGCAACTTACT‐3′ y 5′‐TGACAGCAAAAC- CAGTTCCA‐3′, Tm=61 grados, 30 ciclos), gliceraldehído 3‐fosfato deshidrogenasa (5′‐GAGCGAGACCCCACTAACAT‐3′ y 5′‐TTCACACCCATCACAAACAT‐3′, Tm=60 grados, 25 ciclos). La PCR en tiempo real (RT) se llevó a cabo utilizando SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo, Kioto, Japón) en el sistema de detección ABI StepOne™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.).

2.8|Ensayos clonogénicos

Las HSC a largo plazo (LT) se clasificaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y luego se cultivaron en placas de células de 96 pocillos utilizando un medio a base de metilcelulosa (HSC007; R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) . Se prepararon diez réplicas de pocillos para cada muestra. Utilizamos una placa de cultivo celular de 96 pocillos, tres células por pocillo. Dos semanas después de la siembra, se contó el número y tamaño de las colonias bajo un microscopio.

2.9|análisis estadístico

Los datos se analizaron mediante el ANOVA de una vía utilizando el software Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, EE. UU.) y GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.). Los datos se presentaron como la media ± SD. Se consideró que P < 0.05="" indicaba="" significación="">

3|RESULTADOS

3.1|R. glutinosa y A. membranaceus ejercieron efectos antienvejecimiento

Para confirmar laefectos antienvejecimientode R. glutinosa y A. membranaceus, investigamos los efectos de la administración como suplemento dietético (200 mg/d). Posteriormente, registramos el peso corporal, el grado de senescencia y la tasa de supervivencia de los ratones. El peso corporal de los ratones alimentados con R. glutinosa o A. membranaceus fue normal en comparación con los del grupo de control, aunque hubo una disminución en el peso corporal del grupo de R. glutinosa y A. membranaceus a los 20 meses (Figura 1A). El análisis del grado de senescencia reveló un aumento constante e irreversible en el puntaje de clasificación con el avance de la edad en los grupos de R. glutinosa y A. membranaceus en comparación con el grupo de control, aunque el aumento fue más marcado en los grupos de A. membranaceus. grupo (Figura 1B). La calificación alta se debió a un inicio más temprano de la pérdida de pasividad y reactividad, pérdida del brillo de la piel y aumento de aspereza, pérdida de cabello, lesiones perioftálmicas, aumento de la lordocifosis de la columna vertebral y un aumento más marcado de su gravedad.18 Ratones en el grupo A El grupo de ratones .. membranaceus mostró características de fenotipo de senescencia más marcadas, incluida la pérdida de brillo de la piel y pérdida de cabello. Las curvas de supervivencia mostraron que la vida útil de los ratones en los grupos de R. glutinosa y A. membranaceus fue ligeramente más larga que la del grupo de control (Figura 1C). Estos datos confirmaron laefectos antienvejecimientode R. glutinosa y A. membranaceus, aunque se encontró que R. glutinosa era más eficiente para retardar el proceso de envejecimiento.

FIGURA 1 Rehmannia glutinosa y Astragalus membranaceus tuvieronefectos antienvejecimiento. Los ratones recibieron dietas suplementadas con R. glutinosa o A. membranaceus molida (200 mg/d); el grupo de control fue alimentado con una dieta estándar. A, Cambios en el peso corporal de los ratones medidos cada 2 meses. B, Cambios en la puntuación de clasificación de la senescencia de los ratones con la edad. C, Curvas de supervivencia. Los datos representan la media ± DE; n=20 ratones/grupo. Los datos representan la media ± DE; n=5 ratones/grupo.*P < 0,05,="" ***p=""><>

3.2|R. glutinosa redujo el número de células madre hematopoyéticas

Se cree que el agotamiento de las células madre es la consecuencia integradora de múltiples tipos de daños asociados con el envejecimiento y una de las principales causas del envejecimiento de los tejidos y del organismo.1 Estudios recientes sugieren que el rejuvenecimiento de las células madre puede revertir el fenotipo del envejecimiento a nivel del organismo.5 Nosotros planteó la hipótesis de que elefectos antienvejecimientode R. glutinosa están mediados por la mejora de la función de las células madre. Por lo tanto, realizamos un análisis de citometría de flujo del número de células madre/progenitoras hematopoyéticas aisladas de ratones (de 20 meses de edad) alimentados con dietas suplementadas con R. glutinosa o A. membranaceus (200 mg/d) durante 10 meses (Figura 2A) . El porcentaje de LSK se redujo en los grupos de R. glutinosa y A. membranaceus (Figura 2B). El número de HSC de LT y de corto plazo (ST) se redujo aproximadamente al doble en el grupo de R. glutinosa en comparación con el número en el grupo de control (Figura 2C‐D). Se detectó un mayor número de progenitores linfoides comunes (CLP) en el grupo de R. glutinosa en comparación con el número en el grupo de control (Figura 2I). No hubo diferencias en el número de progenitores multipotentes (MPP), progenitores mieloides comunes (CMP), progenitores de granulocitos y macrófagos (GMP) y progenitores de megacariocitos y eritroides (MEP) en el grupo de R. glutinosa en comparación con el número en el grupo de R. glutinosa. grupo de control. En el grupo de A. membranaceus, no hubo diferencias significativas en los números de LT‐ y ST‐ HSC en comparación con los números en el grupo de control (Figura 2C‐D). Además, no hubo diferencia en el número de células MPP, CMP, MEP y CLP en comparación con el número del grupo de control (Figura 2E, 2F, 2H y 2I); sin embargo, el número de GMP disminuyó en el grupo de A. membranaceus. Por lo tanto, los ratones alimentados con dietas suplementadas con R. glutinosa exhibieron un número reducido de células madre y progenitoras hematopoyéticas.

3.3|R. glutinosa mejoró la función y mantuvo la inactividad de las HSC

Para evaluar la función de las HSC, se examinó in vitro el potencial clonogénico de las LT‐ HSC. Clasificamos las células LT-HSC en un medio a base de metilcelulosa utilizando FACS y contamos el número y el tamaño de las colonias después de 14 días. En comparación con el número y el tamaño de las colonias producidas por las células de los ratones del grupo de control, las células de los ratones del grupo de R. glutinosa mostraron un aumento en el número de colonias, especialmente para el tamaño pequeño (P=0.0241 ) y clon de gran tamaño (P=0.0418), mientras que no hubo diferencia en el número de ratones del grupo A. membranaceus (Figura 3). El mayor tamaño y número de colonias en el grupo de R. glutinosa sugirió que esta hierba mejora el potencial de autorrenovación de las LT‐HSC.

La mayoría de las HSC en ratones adultos permanecen inactivas;19 por lo tanto, el mantenimiento de la inactividad celular es un mecanismo esencial para la autorrenovación de las células madre.20,21 Las disminuciones observadas en las HSC sugieren una disminución de la proliferación celular en R. glutinosa y grupos de A. membranaceus; por lo tanto, examinamos el estado del ciclo celular de las HSC mediante el análisis del marcador celular proliferativo Ki-67 combinado con la determinación del contenido de ADN 7-AAD en la población de LSK. Observamos un mayor número de células LSK en la fase G0 en los grupos de R. glutinosa y A. membranaceus en comparación con el grupo de control (Figura 4A). Estos resultados indicaron que R. glutinosa y A. membranaceus mantuvieron la quiescencia de las HSC.

El análisis de PCR en tiempo real de los reguladores del ciclo celular en células LSK reveló que p18, p19 y p57 desempeñaron funciones críticas en el mantenimiento de la quiescencia de HSC.22-24 No se observaron cambios obvios para p57 y p19 (Figura 4C‐ D), y p18 se reguló al alza en el grupo de R. glutinosa en comparación con el grupo de control, y se reguló ligeramente al alza en el grupo de A. membranaceus (Figura 4B).

FIGURA 2 Rehmannia glutinosa y Astragalus membranaceus afectaron el número de células madre/progenitoras hematopoyéticas. ratones (envejecidos

20 meses) recibieron dietas suplementadas con R. glutinosa o A. membranaceus (200 mg/d) durante 10 meses (n=5/grupo); el grupo de control fue alimentado con una dieta estándar. Las células de médula ósea (BM) recién aisladas se tiñeron con los anticuerpos indicados y se analizaron mediante citometría de flujo. A, Perfiles de tinción representativos de poblaciones de células progenitoras y células madre hematopoyéticas de MO. B, el porcentaje de células Lin–Sca1 más c‐kit– (LSK) en células de BM. C‐I, números de celda de (C) a largo plazo (LT; Lin–, Sca‐1 plus, c‐Kit, CD34 plus – , Flt3–); D, a corto plazo (ST; Lin–, Sca‐1 plus, c‐Kit, CD34 plus plus, Flt3–); E, progenitor multipotente (MPP; Lin–, Sca‐1 plus, c‐Kit plus, Flt3 plus); F, progenitor mieloide común (CMP; Lin–, Sca‐1–, c‐Kit–, CD34 plus, CD16/CD32–); G, progenitor de granulocitos‐macrófagos (GMP; Lin–, Sca‐1–, c‐Kit–, CD34 plus, CD16/CD32 plus); H, megacariocito‐progenitor eritroide (MEP; Lin–, Sca‐1–, c‐Kit–, CD34–, CD16/CD32–); y yo, progenitor linfoide común (CLP; Lin–, Sca‐1low, c‐Kitlow, CD127 plus). Los datos representan la media ± DE; n=5 ratones/grupo. *P < 0,05,="" **p=""><>

3.4|R. glutinosa retrasó la senescencia de las HSC

La suplementación dietética a largo plazo con R. glutinosa puede extender la vida útil de los ratones. La senescencia celular aumenta con la edad; por lo tanto, investigamos la senescencia de las HSC en ratones envejecidos mediante análisis de citometría de flujo de HSC teñidas con SA‐gal utilizando un sustrato fluorescente de ‐gal (C12FDG).25 El porcentaje de células positivas para SA‐gal disminuyó en el Grupo R. glutinosa, lo que indica que R. glutinosa retrasa la senescencia de las células LSK (Figura 5A).

Las especies reactivas de oxígeno juegan un papel importante en la senescencia de las HSC, y la pérdida de la quiescencia de las HSC se correlaciona con frecuencia con un aumento de ROS celular. grupo (Figura 5B). Estos datos indicaron que R. glutinosa puede mantener la inactividad de las HSC y mejorar la función de las HSC al disminuir los niveles de ROS.

Luego investigamos la expresión de varios genes involucrados en la senescencia celular mediante análisis RT-PCR de células LSK. Comparado

FIGURA 3 Función de las células madre hematopoyéticas mejorada por la suplementación dietética de Rehmannia glutinosa. Potencial clonogénico in vitro de células estrelladas hepáticas a largo plazo de ratones (n=3)

con el grupo de control, la expresión de las proteínas asociadas a la senescencia celular p53 y p16 se reguló a la baja en el grupo de R. glutinosa (Figura 5D-E). Pero la expresión de p53 y p16 no se reguló significativamente entre el grupo de A. membranaceus y el grupo de control (Figura 5D-E). Tomados en conjunto, estos datos muestran que varios genes clave relacionados con el ciclo celular y la senescencia celular regulan la función de las HSC en ratones alimentados con dietas suplementadas con R. glutinosa.

3.5|R. glutinosa mejoró la inmunidad de células B

Los linfocitos B y T son importantes para las respuestas inmunológicas. Los linfocitos T juegan un papel crítico en la inmunidad celular y su regulación, mientras que los linfocitos B participan principalmente en la inmunidad humoral. La proliferación de linfocitos es el índice más inmediato que refleja la inmunidad orgánica. Para investigar el papel en la mejora inmunológica, se examinaron los efectos de R. glutinosa y A. membranaceus en la proliferación de linfocitos.

Los ratones en el grupo de R. glutinosa exhibieron una disminución en el número de HSC y un aumento en el número de CLP. El análisis de citometría de flujo mostró un aumento en el número de células B maduras (B220 plus) en PB, BM y bazo de ratones en el grupo de R. glutinosa en comparación con los números detectados en el grupo de control (Figura 6A); sin embargo, no hubo diferencias significativas en el número de células T (CD4 plus y CD8 plus), monocitos y granulocitos (CD11b plus) entre los dos grupos (Figura 6B‐D). Por lo tanto, estos resultados indican que la dieta R. glutinosa mejora la inmunidad de las células B.

FIGURA 4 Los suplementos dietéticos de Rehmannia glutinosa y Astragalus membranaceus mantuvieron la quiescencia de las células madre hematopoyéticas. A, El porcentaje de células en cada fase del ciclo celular. Análisis de citometría de flujo de 7-aminoactinomicina D (7-AAD) y tinción con Ki-67 de células Lin-Sca1 más c-kit- (LSK). B, análisis de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real de la expresión génica de células LSK ordenadas; GAPDH se utilizó para la normalización. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>

FIGURA 5 La suplementación con Rehmannia glutinosa en la dieta redujo la senescencia de las células estrelladas hepáticas (HSC). Se alimentaron ratones (de 20 meses de edad) con dietas suplementadas con Rehmannia glutinosa o Astragalus membranaceus (200 mg/d) durante 10 meses (n {{4 }}/grupo); el grupo de control fue alimentado con una dieta estándar. A, Análisis de citometría de flujo de células SA‐gal‐positivas Lin–Sca1 más c‐kit– (LSK) utilizando un sustrato fluorescente de ‐galactosidasa (C12FDG). B, El porcentaje de células positivas para especies reactivas de oxígeno (ROS) en LSK. Análisis de citometría de flujo de LSK ROS-positivas. Los datos representan la media ± desviación estándar (DE). *P < 0.05,="" ***p="">< 0.001.="" c,="" el="" patrón="" de="" expresión="" de="" los="" genes="" asociados="" a="" la="" senescencia="" celular="" en="" las="" lsk;="" gapdh="" se="" utilizó="" para="" la="" normalización.="" los="" datos="" representan="" la="" media="" ±="" de="" de="" tres="" experimentos.="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

4|DISCUSIÓN

En este estudio, investigamos el mecanismo de laefectos antienvejecimientode R. glutinosa o A. membranaceus al complementar las dietas de ratones con las hierbas a una dosis de 200 mg/d durante 10 meses. Se descubrió que R. glutinosa exhibe efectos antienvejecimiento, incluida la disminución de la senescencia y el aumento de la supervivencia de las HSC, así como

Inmunidad mejorada de células B. En cuanto al mecanismo de laefectos antienvejecimiento, encontramos que R. glutinosa disminuyó el número de HSC, mientras que aumentó la capacidad de proliferación. Además, R. glutinosa mantuvo la inactividad de las HSC y disminuyó el número de células positivas para SA‐gal y los niveles de ROS a través de la regulación de p18, p53 y p16. En combinación, nuestros resultados confirmaron que laefectos antienvejecimientode R. glutinosa en ratones se medican manteniendo la quiescencia y mejorando la función de las HSC.

Rehmannia glutinosa, que se ha utilizado como medicina tradicional china a base de hierbas durante miles de años, se puede utilizar para tratar la hipoglucemia en varios trastornos diabéticos.27,28 También se ha informado que el extracto de R. glutinosa mejora el metabolismo óseo.29 Además, R. glutinosa inhibe las respuestas y los síndromes inflamatorios,30,31 y protege contra el daño celular al eliminar los radicales libres.14,32 En este estudio, encontramos que la suplementación dietética de ratones con R. glutinosa ejercióefectos antienvejecimientoy mejoró la inmunidad de las células B al aumentar la capacidad proliferativa de las LT‐HSC y disminuir el número de células positivas para SA‐gal y los niveles de ROS.

Se ha encontrado que el grado de daño oxidativo aumenta con la edad en una variedad de células y tejidos. El estrés oxidativo es un determinante crítico de la autorrenovación de HSC. La pérdida de la quiescencia de LT‐HSC frecuentemente se correlaciona con un aumento de ROS celular, que se asocia negativamente con la autorrenovación de las HSC.26 Catalpol es un glucósido iridoide, que se ha encontrado en la raíz de R. glutinosa. Catalpol demostró inhibir el estrés oxidativo, el daño en el ADN y el acortamiento de los telómeros a través de la vía PGC-1/TERT en un estudio anterior.33 En nuestro estudio, el nivel de ROS disminuyó en las células LSK del grupo R. glutinosa en comparación con el grupo control. Por lo tanto, R. glutinosa prolonga la supervivencia de los ratones al inhibir el estrés oxidativo en las HSC.

FIGURA 6 Análisis por citometría de flujo del porcentaje de células inmunitarias maduras en sangre periférica (PB), médula ósea (MO), bazo y timo. Se alimentaron ratones (de 20 meses de edad) con dietas suplementadas con Rehmannia glutinosa o Astragalus membranaceus (200 mg/d) durante 10 meses (n=5/grupo); el grupo de control fue alimentado con una dieta estándar. A, Análisis de citometría de flujo del porcentaje de células B (B220 plus) en PB, BM y bazo. B, Análisis de citometría de flujo del porcentaje de células monocitarias y granulocíticas (CD11b plus) en PB y BM. C y D, análisis de citometría de flujo del porcentaje de células CD4 plus y CD8 plus en PB, bazo y timo. Los datos representan la media ± DE. *P <>

Astragalus membranaceus también se usa en la medicina tradicional china para promover la inmunidad, reducir el azúcar en la sangre y promover la apoptosis de las células tumorales, y también tieneantioxidacionyantienvejecimientopropiedades. En este estudio, encontramos que la suplementación dietética con A. memranaceus durante 10 meses no tuvo efectos evidentes en comparación con los observados en los ratones de control, mientras que el peso de los ratones se redujo a los 20 meses. Por lo tanto, A. membranaceus puede no ser adecuado para el tratamiento de LT en ratones alimentados.

En conclusión, nuestros resultados muestran que R. glutinosa puede prolongar la vida útil de los ratones al mantener la quiescencia y mejorar la función de las HSC. Además, R. glutinosa puede disminuir los niveles intercelulares de ROS y el número de células SA‐gal‐positivas y mejorar la inmunidad de las células B.

EXPRESIONES DE GRATITUD

Este estudio fue financiado en parte por la National Science Foundation for China (31672374), el CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2016‐12M‐1‐012) y el PUMC Youth Fund (2017310018).

CONFLICTOS DE INTERÉS

Ninguna.

CONTRIBUCIONES DE AUTOR

Todos los autores listados cumplen con los requisitos de autoría. CQ y LFZ concibieron y diseñaron los experimentos. LB realizó los experimentos y escribió la prueba del manuscrito principal. GYS realizó y analizó los datos de FACS. YJY diseñó el experimento sobre la Medicina Tradicional China. WC manejó los ratones. Todos los autores han leido y aprobado el manuscrito.