Efecto protector renal del pretratamiento de lentejas beluga para la lesión por isquemia-reperfusión

Syng-ook Lee,¹ tan joven chun,²EunHye Lee,²bomi kim,²Bo Hyun Yoon,² y otros

Antecedentes y objetivo. Lesión por isquemia/reperfusión (I/R), causada porriñóndaño, provoca alteraciones histopatológicas, apoptosis de las células tubulares, inflamación, oxidación y pérdida de la función renal. Evaluamos los efectos protectores contra la lesión por I/R del pretratamiento de lentejas beluga. Materiales y métodos. Los ratones se dividieron en cuatro grupos: grupos de tratamiento con lentejas beluga normales, sin tratar, con dosis baja (2 mg) y dosis alta (8 mg). Se administró lenteja beluga por vía oral durante 2 semanas, seguida de isquemia renal bilateral durante 20 min y reperfusión durante 30 min. muestras de sangre yriñónSe recogieron y analizaron tejidos para investigar la función renal, la histopatología, las células epiteliales y endoteliales.daño, apoptosis, estrés oxidativo y respuestas inflamatorias. Resultados. Los grupos pretratados mantuvieron la función renal, con niveles significativamente más bajos de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina, en comparación con los otros grupos. El análisis histopatológico mostró una reducción de la lesión del túbulo proximal y una disminución de la molécula relacionada con la lesión (riñónsecreción de la molécula de lesión 1 (KIM-1) y lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL)) en los grupos pretratados en comparación con los otros grupos. Las células positivas para el marcado del extremo de la desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP (TUNEL-) y la secreción de moléculas relacionadas con la apoptosis (Fas y caspasa 3) se redujeron significativamente en los grupos pretratados en comparación con los otros grupos. Los grupos pretratados mostraron expresión positiva del gen asociado a microvasos (grupo de diferenciación (CD31)) y expresión negativa de la molécula de adhesión (molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1)). Se observó un efecto antioxidante en los grupos de pretratamiento, con expresión reducida de malonaldehído (MDA) y aumento de la secreción de enzimas antioxidantes (superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión (GSH) y glutatión peroxidasa (GPx)). En los grupos pretratados, F4/80 más macrófagos y CD4 más infiltración de células T se inhibieron y los niveles de citocinas proinflamatorias (interleucina-(IL-) 1 , IL-6 y factor de necrosis tumoral-(TNF-)) disminuyeron; sin embargo, los niveles de citocinas antiinflamatorias (factor de crecimiento transformante (TGF-), IL-10 e IL-22) aumentaron. Conclusiones. El pretratamiento con lentejas Beluga demostró efectos protectores contra el daño renal inducido por I/R, a través de actividades antiapoptóticas, antiinflamatorias y antioxidantes.

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1. Introducción

La lesión por isquemia/reperfusión (I/R), durante la nefrectomía parcial o el trasplante renal, provocarenallesión [1, 2] y puede resultar en el deterioro irreversible de la función renal [3]. La isquemia desencadena la apoptosis en las células epiteliales de los túbulos renales, lo que amplifica las respuestas inflamatorias de las células intersticiales. La reperfusión induce daño microvascular, lo que promueve la migración de células inflamatorias, a través de la expresión del factor de adhesión en la superficie de las células endoteliales [4–8]. La lesión por I/R también causa estrés oxidativo, aumentando las especies reactivas de oxígeno (ROS) y disminuyendo la actividad de las enzimas antioxidantes [9], lo que da como resultado una mayor producción de factores proinflamatorios [10], la activación de la vía de la caspasa y un aumento de la muerte celular apoptótica, que eventualmente causar la pérdida de la función renal [11]. Para prevenir la lesión renal inducida por I/R, se ha propuesto el uso de agentes antioxidantes, con funciones antiinflamatorias y antiapoptóticas [10-14].

Los cultivares de lentejas (verde, roja, francesa o beluga) contienen varios compuestos bioactivos, especialmente antioxidantes [15]. Su contenido total de polifenoles y flavonoides oscila entre 27,30 y 30,30 mg (equivalentes de ácido tánico)/ga 13,14 y 16,29 mg (equivalentes de quercetina)/g, respectivamente [16]. Se ha demostrado que las lentejas beluga tienen un contenido significativamente alto de polifenoles y efectos de eliminación de ROS [16]. Nuestro equipo informó los efectos antioxidantes de las lentejas, utilizando un experimento de línea celular de hígado in vitro [16]. Las lentejas Beluga demostraron efectos protectores significativos contra la citotoxicidad inducida por el alcohol en las células de AML-12 en comparación con otros cultivares de lentejas. Los efectos antiinflamatorios de las lentejas beluga también se observaron en células RAW264.7 tratadas con lipopolisacáridos [17]. El tratamiento con lentejas beluga disminuyó significativamente la producción de óxido nítrico (NO) y la expresión de la sintasa inducible de NO (iNOS), a través de la regulación al alza del factor nuclear E2-relacionado con el factor 2- (Nrf2-) mediado por hemo vía de la oxigenasa-1 (HO-1). Estos experimentos in vitro sugirieron los efectos antioxidantes y antiinflamatorios de las lentejas beluga.

Para expandir las aplicaciones de las lentejas beluga, las aplicamos a un modelo de ratón con lesión renal I/R y evaluamos los efectos protectores renales. Para este experimento, se administraron lentejas beluga durante 2 semanas, como pretratamiento, seguido de isquemia durante 20 min y reperfusión durante 30 min. Los efectos protectores renales del pretratamiento con lentejas beluga se verificaron analizando la función renal, la histopatología, el daño de las células epiteliales y endoteliales, la apoptosis, el estrés oxidativo y las respuestas inflamatorias. Presumimos que el pretratamiento con lentejas beluga evitaría la lesión renal inducida por I/R, a través de actividades antioxidantes, antiinflamatorias y antiapoptóticas.

2. Materiales y métodos

2.1. Grupos de animales y condiciones de tratamiento.

Todos los procedimientos se realizaron utilizando un protocolo animal que ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yeungnam (AEC2019-003). Los ratones (ICR, 8 semanas de edad, macho, 23–25 g, Orient, Seongnam, Corea) se dividieron aleatoriamente en los siguientes 4 grupos (n =7 por grupo): (1) Normal, grupo de control normal; (2) grupo tratado con solución salina sin tratar; (3) dosis baja, baja (2 mg/100 μL de solución salina/ratón de BioMed Research International), 14-días administrados oralmente al grupo de pretratamiento de lentejas beluga; y (4) dosis alta, alta (8 mg/100 μl de solución salina/ratón), durante 14-días, lenteja beluga administrada por vía oral, grupo de pretratamiento. Las lentejas Beluga fueron proporcionadas por el Prof. Syng-Ook Lee (Universidad de Keimyung, Daegu, Corea), y la preparación del extracto y el análisis del compuesto bioactivo se informaron en un estudio anterior [16]. Después del tratamiento, los animales se colocaron en decúbito prono, bajo anestesia, y se realizó una incisión dorsal [1]. La arteria y las venas renales de ambos riñones se ocluyeron con una pinza vascular durante 20 minutos, seguido de reperfusión durante 30 minutos, de acuerdo con un protocolo descrito previamente [18, 19]. Se recogió sangre por punción cardíaca y se extrajeron los riñones. Los riñones se lavaron con solución salina tamponada con fosfato; un riñón se utilizó para la extracción de ARN y proteínas, mientras que el otro riñón se utilizó para el análisis histológico.

2.2. Análisis histopatológicos e inmunohistoquímicos (IHC).

Los exámenes histopatológicos se realizaron mediante tinción con hematoxilina y eosina (H&E), y las lesiones se evaluaron en función de los siguientes factores: presencia de células tubulares que caen en la luz, pérdida nuclear en células exfoliadas, desechos luminales, espacio luminal colapsado e infiltración de células inmunitarias. . La puntuación la logró un especialista en patología: puntuación 0, sin lesión tubular; puntuación 1,<10% of="" tubules="" injured;="" score="" 2,="" 10–25%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 3,="" 25–50%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 4,="" 50–74%="" of="" tubules="" injured;="" and="" score="" 5,="">75 por ciento de los túbulos lesionados. Para el análisis IHC, el riñón se fijó con paraformaldehído al 4 por ciento y las muestras incluidas en parafina se cortaron en secciones de 5 μm. Se realizaron tinciones con H&E e IHC, siguiendo los procesos de rutina. Se aplicaron a las secciones anticuerpos primarios contra marcadores de células inmunitarias (F4/80 y grupo de diferenciación 8 (CD8), Abcam, Cambridge, Reino Unido) y células endoteliales (CD31 y molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1), Abcam) , durante 24 horas a 4 grados (dilución 1:200), seguido del anticuerpo secundario (Alexa Fluor 594, Life Technology, Waltham, MA, EE. UU.), durante 1 hora a temperatura ambiente y 4′,6-diamidino{ Se usó {19}}fenilindol (DAPI) para teñir los núcleos.

2.3. Ensayo de proteínas.

Para el análisis de la función renal, el suero se separó, sin anticoagulante, y las concentraciones de creatinina sérica y nitrógeno ureico en sangre (BUN) se detectaron utilizando un kit de ensayo colorimétrico de creatinina y un kit de ensayo de urea Quanti-Chrom (BioAssay Systems LLC, Hayward, CA, EE. UU. ), respectivamente. Para evaluar la lesión de los túbulos/vasos renales, el estrés oxidativo, las enzimas antioxidantes y la apoptosis, se homogeneizó el tejido renal con cada tampón respectivo. Para analizar la lesión de las células epiteliales del túbulo renal, se evaluaron las concentraciones de la molécula de lesión renal-1 (KIM-1) y la lipocalina asociada a la gelatinasa de neutrófilos (NGAL) mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (USCN Life Science Inc. ., Wuhan, China). Para analizar la apoptosis, se midieron las concentraciones de Fas y caspasa 3 usando los respectivos kits ELISA (Abcam). Para evaluar el estrés oxidativo, se midieron los niveles de malonaldehído (MDA) usando un kit de ensayo de MDA (Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute, Nanjing, China). Las enzimas antioxidantes, incluidas la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT), el glutatión (GSH) y la glutatión peroxidasa (GPx), se midieron utilizando un kit de ensayo de SOD total (Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute), un kit de ensayo CAT ( Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute), un kit de ensayo fluorométrico de GSH y un kit de ensayo GPx (BioVision Inc.), respectivamente. Todos los kits se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2.4. Análisis de expresión génica.

El ARN total se extrajo con el reactivo TRIzol y el ADNc se sintetizó a partir de 20 ug de ARN total, utilizando un kit de síntesis de ADNc (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.). Las condiciones de la PCR en tiempo real fueron las siguientes: 95 grados durante 10 minutos, seguidos de 40 ciclos de 95 grados durante 10 segundos, 60 grados durante 50 segundos y 72 grados durante 20 segundos. La amplificación génica se detectó con SYBR green y se utilizó el método 2−ΔΔCt para analizar la expresión. Los experimentos se realizaron por triplicado, utilizando las siguientes secuencias de cebadores: interleucina-(IL-) 1 , 5′-gcccatcctctgagactcat-3′ y 5′-aggccacagg-tattttgtcg-3′; IL-6, 5′-agttgccttcttgggactga-3′ y 5′ -tccacgatttcccagagaac-3′; factor de necrosis tumoral (TNF-), 5'-agcccccagtctgtatcctt-3' y 5'-ctccctttgcagaactcagg-3'; factor de crecimiento transformante (TGF-), 5′-tggttgtagaggg-caaggac-3′ y 5′-ttgcttcagctccacagaga-3′; IL-10, 5′ -acctggtagaagtgatgccc-3′ y 5′-agggtcttcagcttctcacc-3′; IL- 22, 5′-tccaacttccagcagccata-3′ y 5′-tagcactgactcctcggaac- 3′; y gliceraldehído 3′-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), 5′-tgtgtccgtcgtggatctga-3′ y 5′-cctgcttcac-caccttcttga-3′.

2.5. Ensayo TUNEL.

Para evaluar la apoptosis, se realizó un ensayo de marcaje de extremos de muesca de dUTP mediado por TdT (TUNEL) utilizando un kit de detección de apoptosis (Chemicon, Bedford, MA, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, los portaobjetos desparafinados y rehidratados se digirieron con 20ug/mL de proteinasa K, a 37 grados durante 15 horas, para eliminar las proteínas y se trataron con peróxido de hidrógeno al 3,0 por ciento para extinguir la peroxidasa endógena. Los portaobjetos se sumergieron en tampón de equilibrio TdT 1x y se añadió una fuerza de trabajo de la enzima TdT durante 1 hora a 37 grados. Se aplicó un conjugado anti-digoxigenina al extremo 3'-OH del ADN durante 30 min y se desarrolló el color utilizando un sustrato de peroxidasa durante 3 min. Después del tratamiento con DAPI, se montaron los portaobjetos. Los núcleos positivos para TUNEL se contaron en todos los campos visuales en cada muestra de tejido, con un aumento de 200x.

2.6. Análisis estadístico.

Todos los valores se expresan como media ± desviación estándar. Se evaluaron las diferencias significativas para el grupo de lesión renal I/R y los grupos de pretratamiento beluga lentil-I/R mediante un análisis de varianza, seguido de la prueba post hoc de Tukey, en SPSS (Statistical Package for the Social Sciences v. 9).{{ 2}}; Chicago, IL, EE. UU.). Los valores de p < 0.05="" se="" consideraron="">

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3. Resultados

3.1. Efectos del pretratamiento de lentejas beluga sobre la función renal.

Ambos grupos pretratados mostraron efectos protectores significativos contra la lesión por I/R (Figura 1). Las concentraciones medias de BUN y creatinina sérica en el grupo no tratado fueron 89:92 ± 7:29 mg/dL y 0:48 ± 0:16 mg/dL, respectivamente. Los grupos pretratados mostraron BUN significativamente reducido (bajo: 22 : 6 ± 3: 67 mg/dL; alto: 21: 6 ± 3: 17 mg/dL) y creatinina sérica (bajo: 0: 25 ± {{19} }:04mg/dL; concentraciones altas: 0:23 ± 0,04mg/dL) en comparación con las del grupo no tratado (p<0:01), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" two="" pretreatment="" groups.="" these="" results="" indicated="" that="" pretreatment="" with="" beluga="" lentils="" can="" protect="" against="" acute="" renal="" functional="">

3.2. Efectos del pretratamiento de lentejas beluga sobre la lesión de células epiteliales tubulares y la apoptosis.

La lesión tubular, especialmente la atrofia de las células epiteliales, se observó con frecuencia en la médula renal externa, y la pérdida nuclear de células exfoliadas, los desechos luminales en el túbulo renal, el espacio luminal colapsado y los infiltrados de neutrófilos intersticiales se identificaron ocasionalmente en los riñones de los riñones. grupo no tratado (Figura 2(a)). Por el contrario, los riñones de los grupos pretratados mostraron morfologías celulares casi normales, y la lesión tubular se observó con menos frecuencia en el grupo de dosis alta que en el grupo de dosis baja. Cuando la lesión se expresó como porcentaje por unidad de área, la puntuación de la lesión se redujo en los grupos pretratados (baja: 2:0±0:93; alta: 1:5± {{ 11}}:53) en comparación con la del grupo no tratado (2:87 ± 1:25) (Figura 2(b)). Al examinar la secreción de KIM-1 y NGAL (Figura 2(c)), los resultados de ELISA demostraron que los contenidos de KIM-1 disminuyeron en los grupos pretratados (bajo: 1, 922:83 ± 199:42 pg/ mg; alto: 1827:83 ± 278:26 pg/mg) en comparación con el del grupo no tratado (1977:83 ± 184:49 pg/mg). La expresión de NGAL se redujo significativamente en el grupo de dosis alta (489:34 ± 19:95 pg/mg) en comparación con los del grupo de dosis baja (527:36 ± 15: 19 pg/mL) y sin tratamiento (537:05 ± 15: 70pg/mg) grupos (p<>

A continuación, se analizó si la lesión de las células epiteliales tubulares provocaba apoptosis. La apoptosis celular se evaluó mediante la detección de ADN cromosómico fragmentado mediante el ensayo TUNEL (Figura 2(d)). Rara vez se observaron células positivas para TUNEL en los grupos pretratados (bajo: 5:00 ± 1:22; alto: 2:25 ± 1:09). Por el contrario, el grupo no tratado mostró un número relativamente mayor de células positivas para TUNEL en la región externa de la médula (47:50 ± 16:77) (p<0:01), showing="" apoptotic="" bodies="" that="" extruded="" into="" the="" tubular="" lumen="" (figure="" 2(e)).="" when="" the="" secretion="" of="" apoptosis-related="" molecules="" (fas="" and="" caspase="" 3)="" was="" analyzed="" by="" elisa="" (figure="" 2(f)),="" fas="" expression="" was="" high:="" 3:96="" ±="" 0:55ng/mg)="" compared="" with="" that="" in="" the="" untreated="" group="" (7:10="" ±="" 0:87ng/mg),="" and="" caspase="" 3="" expression="" showed="" similar="" results="" (low:="" 8:44="" ±="" 2:05ng/mg;="" high:="" 8:25="" ±="" 1:28ng/="" mg;="" and="" untreated:="" 11:99="" ±="" 0:63ng/mg)="" (p=""><0:05). these="" results="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="">

apoptosis de células epiteliales tubulares inducida por I/R.

3.3. Efectos del pretratamiento de lentejas beluga en la lesión de células endoteliales.

Los efectos del pretratamiento con lentejas beluga en las células endoteliales se verificaron mediante IHC, usando un anticuerpo CD31 (Figura 3(a)). En el grupo normal, se identificaron vasos sanguíneos CD31-positivos, pero no se identificaron células CD31-positivas en el grupo no tratado, lo que indica una alteración vascular inducida por I/R. El grupo de pretratamiento de dosis alta mostró células CD31-positivas en los capilares peritubulares, lo que indica un efecto protector de los vasos del pretratamiento con lentejas beluga de dosis alta. Las células endoteliales se examinaron mediante la detección de ICAM- 1, una molécula de adhesión, y las células positivas se identificaron con más frecuencia en la región tubular del grupo no tratado (46:4±41:7 células/portaobjetos) en comparación con los grupos pretratados ( bajo: 5:77 ± 1:01 celdas/portaobjetos, alto: 3:72 ± 1:05 celdas/portaobjetos) (Figura 3(b)). Estos resultados indicaron que el pretratamiento con lentejas beluga preservó los capilares e inhibió la activación de las moléculas de adhesión en la superficie de las células endoteliales.

3.4. Efectos del pretratamiento de lentejas beluga sobre el estrés oxidativo.

To evaluate the antioxidant effects of beluga lentil pretreat- ment, MDA, SOD, CAT, GSH, and GPx levels were detected by ELISA (Figure 4). MDA levels decreased in the pretreated groups (low: 0:85 ± 0:23nmol/mg; high: 0:81 ± 0:22nmol/ mg) compared with that in the untreated group (0:96 ± 0:11nmol/mg) (p >0:05) (Figure 4(a)). However, the antioxidant enzyme activities increased in the pretreated groups (Figure 4(b)) compared with those in the untreated group (p >{{{{20}}}}:05), para SOD (bajo: 360:21 ± 56:42U/mL; alto: 362:7{{ 36}} ± 70 :32U/mL y sin tratar: 333:52 ± 41:58U/mL), CAT (bajo: 3:64 ± 1:09 nmol/g; alto: 3:21 ± 0:76 nmol/g; y sin tratar: 3:18 ± 0:40 nmol/g), GSH (bajo: 4:13 ± 0:53 nmol/mg; alto: 4:56 ± 0:69 nmol/mg; y sin tratamiento: 3:59 ± 0 :53 nmol/mg) y GPx (baja: 198:89 ± 48:43U/ug; alta: 219:61 ± 138:08U/ug; y sin tratar: 165:14 ± 34:73U/ug). Aunque estas diferencias no fueron estadísticamente significativas, estos resultados sugirieron que el pretratamiento con lentejas beluga previno el estrés oxidativo renal inducido por I/R al mejorar la potencia antioxidante en los riñones.

3.5. Efectos del pretratamiento de lentejas beluga sobre la infiltración de células inmunitarias, las citocinas y la inflamación. Se analizaron la infiltración de macrófagos (F4/80 plus) y células T (CD4 plus) y la liberación de citoquinas proinflamatorias (IL-1 , IL-6 y TNF- ) para evaluar la inflamación inducida por apoptosis. Se observaron menos células inmunitarias infiltrantes F4/80 plus y CD4 plus en los grupos pretratados que en el grupo no tratado, según lo evaluado por análisis IHC (Figura 5(a)). El análisis de PCR en tiempo real mostró que los niveles de ARNm renal de citocinas proinflamatorias (IL-1, TNF- e IL 6) disminuyeron en el grupo pretratado en comparación con los del grupo no tratado (Figura 5(b )). Sin embargo, los niveles de ARNm de citoquinas antiinflamatorias (TGF- e IL-22) aumentaron en los grupos pretratados en comparación con el grupo no tratado, excepto para IL-10 (Figura 5(c)). Estos resultados indicaron que la lesión inflamatoria inducida por I/R en los riñones puede prevenirse mediante un pretratamiento con lentejas beluga debido a los efectos antiinflamatorios, aunque la IL-10 no se vio afectada.

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4. Discusión

La lesión renal inducida por I/R se caracteriza tradicionalmente por una disminución rápida de la función renal [20]. La función renal se puede estimar utilizando los valores de BUN y creatinina sérica, que son productos finales metabólicos nitrogenados que indican la función del filtro glomerular [21]. El grupo no tratado mostró valores significativamente elevados de BUN (89:92 ± 7:29 mg/dL) y creatinina (0: 48 ± {{20}}: 16 mg/dL), lo que indica insuficiencia renal funcional inducida por I/R. Sin embargo, los grupos pretratados con lentejas beluga mostraron BUN significativamente reducido (bajo: 22:6±3:67mg/dL; alto: 21:6±3:17mg/dL) y creatinina sérica (bajo: 0: 25 ± 0:04mg/dL; alto: 0:23 ± 0:04mg/dL) valores (p<0:01) compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" group.="" these="" values="" are="" similar="" to="" those="" observed="" in="" normal="" mice="" (male,="" 6wks;="" bun:="" 22:68="" ±="" 3:05mg/dl;="" creatinine:="" 0:25="" ±="" 0:06mg/dl)="" [22].="" the="" significantly="" decreased="" bun="" and="" serum="" creatinine="" values="" observed="" in="" the="" pretreated="" groups="" relative="" to="" the="" untreated="" group="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="" exerted="" protective="" effects="" on="" renal="" function="" against="" i/r-induced="" renal="">

La disminución de la función renal indica problemas de filtración glomerular causados ​​por la retrofuga del filtrado glomerular a través del epitelio tubular, que representa la región más gravemente lesionada por I/R [23]. I/R resultó en pérdida nuclear de células exfoliadas, desechos luminales en el túbulo renal y espacios luminales colapsados ​​en células epiteliales tubulares. Los grupos pretratados mostraron una lesión tubular histopatológica reducida de una manera dependiente de la dosis. La lesión histopatológica del túbulo observada se confirmó mediante la evaluación de marcadores moleculares, KIM-1 y NGAL [24]. KIM-1 es un receptor de fosfatidilserina que actúa como una molécula de reconocimiento de células apoptóticas, transfiriendo una célula lesionada al lisosoma para la fagocitosis de células apoptóticas/necróticas, eliminación de desechos apoptóticos y limitación de la respuesta proinflamatoria [25]. NGAL es una pequeña proteína siderófora que se une a gelatinasas derivadas de neutrófilos humanos. NGAL rara vez se expresa en riñones normales, pero los daños renales agudos, isquémicos o tóxicos dan como resultado la secreción de NGAL por las células epiteliales en los túbulos proximal/distal, lo que aumenta las concentraciones de NGAL en la orina y la sangre; por lo tanto, NGAL se puede utilizar como un nuevo biomarcador temprano para la insuficiencia renal aguda inducida por I/R [26]. Los grupos pretratados mostraron una secreción reducida de KIM-1 y NGAL, y el grupo de pretratamiento de dosis alta mostró una reducción significativa en la secreción de NGAL en comparación con el grupo no tratado. Las reducciones observadas en la lesión tubular y la secreción de proteínas KIM-1 y NGAL indicaron que el pretratamiento con lentejas beluga ejerció efectos protectores contra el daño de las células epiteliales tubulares inducido por I/R.

Cuando la lesión por I/R es grave, las células dañadas se eliminan a través de la vía apoptótica, que es un mecanismo fisiopatológico de muerte celular [27]. El daño en el ADN específico de la apoptosis se puede detectar a través del ensayo TUNEL.

Las células positivas para TUNEL se observaron con frecuencia en el grupo no tratado, mientras que los grupos pretratados con lentejas beluga mostraron números de células positivas para TUNEL significativamente reducidos, de una manera dependiente de la dosis. Esta evidencia histológica de apoptosis se confirmó examinando las expresiones de Fas y caspasa 3. Fas es un ligando que se une al receptor de muerte celular y se observa inicialmente durante la muerte celular programada [28]. La caspasa 3 es una enzima de ejecución intracelular de la vía de muerte celular apoptótica, que da como resultado la formación de cuerpos apoptóticos [29]. Las síntesis de proteínas Fas y caspasa 3 se redujeron significativamente en el grupo pretratado en comparación con las del grupo no tratado, lo que confirma que el pretratamiento con lentejas beluga puede inhibir la transducción de señales apoptóticas después de una lesión por I/R.

La lesión por I/R también induce la pérdida de microvasos renales [30], lo que da lugar a cambios patohistológicos en las células endoteliales [20]. El daño de los microvasos renales se detectó utilizando un anticuerpo contra CD31, un marcador de células endoteliales [30]. No se detectó la expresión de CD31 en el grupo no tratado, lo que indica la pérdida de microvasos renales. Sin embargo, el grupo pretratado con dosis altas mostró una expresión positiva de CD31, con una densidad vascular similar a la observada en el grupo normal, lo que indica que el pretratamiento con lentejas beluga, a dosis altas, ejerció un efecto protector sobre la preservación de las células endoteliales. Las células endoteliales dañadas expresan moléculas de adhesión endotelio-leucocitos, como ICAM-1 [31]. El aumento de las moléculas de adhesión puede conducir a la activación de leucocitos, obstrucción capilar, producción de citocinas y respuestas proinflamatorias [32]. El grupo no tratado mostró una expresión positiva de ICAM-1, lo que indica una mayor expresión de la molécula de adhesión inducida por el daño de las células endoteliales. Sin embargo, el grupo pretratado con dosis altas mostró una expresión negativa de ICAM-1, lo que indica los efectos protectores del pretratamiento con lentejas beluga para el mantenimiento de las células endoteliales, tanto funcional como fisiológicamente. Las estructuras vasculares mantenidas pueden proporcionar un flujo sanguíneo constante, proporcionando oxígeno y nutrientes a los tejidos y células dañados por I/R, ayudando en la recuperación funcional e histológica del riñón.

La reperfusión restaura el suministro de oxígeno a las células dañadas, lo que puede desencadenar la expresión de enzimas relacionadas con el estrés oxidativo, que convierten el oxígeno en ROS [33]. Las ROS son productos inestables y altamente reactivos que generan radicales libres, los cuales causan daño en el ADN, apoptosis y necrosis, a través del cambio en las proteínas celulares, lípidos y ácidos nucleicos. Los radicales libres dañan los ácidos grasos insaturados de la membrana celular, lo que provoca la peroxidación lipídica [34]. Luego, el peróxido de lípido se degrada en MDA, que reduce las actividades de las enzimas antioxidantes, como SOD, GPx, GSH y CAT [35]. SOD cataliza la dismutación de superóxido en oxígeno y peróxido de hidrógeno, que se degrada aún más por CAT. GPx es una enzima antioxidante clave que elimina el peróxido, usando GSH. GSH puede desintoxicar varios productos oxidativos, en combinación con GPx. Los niveles de MDA y enzimas antioxidantes demostraron una relación inversa en el análisis ELISA. En los grupos pretratados, la expresión de MDA fue relativamente baja, pero las enzimas antioxidantes se expresaron mucho en comparación con sus niveles respectivos en el grupo no tratado.

Estos resultados indicaron que el pretratamiento con lentejas beluga puede reducir el daño renal inducido por I/R al bloquear la vía del estrés oxidativo, a través de la inhibición de la peroxidación lipídica de la membrana y la activación de enzimas antioxidantes.

La reperfusión también desencadena la activación de las células endoteliales vasculares, lo que da como resultado la expresión de ICAM-1 en la superficie celular. La ICAM expresada-1 se conecta con los neutrófilos a través del antígeno asociado a la función de los linfocitos-1 (LFA-1), lo que resulta en la unión de los neutrófilos a las células endoteliales, la infiltración de neutrófilos y la secreción de sustancias inflamatorias. citocinas por los neutrófilos [36]. Después de que aparecen los neutrófilos en una región dañada, se produce la infiltración de macrófagos F4/80 plus. Los macrófagos se diferencian en fenotipos proinflamatorios M1 y antiinflamatorios M2, según el tiempo y el entorno circundante. Los macrófagos M1 secretan citocinas proinflamatorias (IL-1, TNF- e IL- 6) que están asociadas con el daño renal inducido por I/R, mientras que los macrófagos M2 secretan citocinas antiinflamatorias (TGF-, IL{ {19}} e IL-22) [37, 38]. Los macrófagos también estimulan la activación de las células T CD4 plus. Las células T activadas sintetizan interferón-(IFN-), que amplifica la respuesta inmunitaria a través de la activación de los macrófagos M1 [39]. En este estudio, los grupos pretratados con lentejas beluga mostraron efectos inhibidores contra la infiltración de F4/80 más macrófagos y CD4 más células T en la región de la corteza renal, lo que resultó en una disminución de la expresión de IL-1 , IL-6, y ARNm de TNF- y la expresión mejorada de ARNm de TGF-, IL-10 e IL-22. Estos resultados indicaron que el tratamiento previo con lentejas beluga puede reducir la respuesta inflamatoria al inhibir la infiltración de células inmunitarias y reducir la expresión de citoquinas inflamatorias.

5. Conclusiones

En resumen, los grupos de pretratamiento con lentejas beluga mostraron una reducción de la lesión del túbulo proximal, una disminución de la secreción de moléculas relacionadas con la lesión, una reducción de las células positivas para TUNEL, una disminución de la secreción de moléculas relacionadas con la apoptosis, expresión positiva de microvasos, expresión negativa de marcadores de adhesión, un efecto antioxidante e inflamación inflamatoria inhibida. respuestas Por lo tanto, el pretratamiento con lentejas beluga ejerció efectos protectores contra el daño renal inducido por I/R, a través de actividades antiapoptóticas, antiinflamatorias y antioxidantes. Según los resultados de este estudio, la función renal se puede preservar mediante tratamientos con lentejas beluga en situaciones clínicas asociadas con lesiones por I/R, como la nefrectomía parcial.

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Disponibilidad de datos

Los datos están disponibles bajo petición.

Divulgación

El resumen del manuscrito se informó en la 72ª reunión anual de la Asociación de Urología de Corea.

Conflictos de interés

No hay conflictos de interés.

Contribuciones de los autores

Syng-ook Lee y So Young Chun contribuyeron igualmente a este trabajo.

Expresiones de gratitud

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto de Investigación Biomédica del Hospital de la Universidad Nacional de Kyungpook (2019).

1Departamento de Ciencia y Tecnología de Alimentos, Universidad de Keimyung, Daegu 42601, República de Corea

2Instituto de Investigación Biomédica, Hospital Universitario Nacional Kyungpook, Daegu 41940, República de Corea

3Departamento del Equipo de Apoyo a la Investigación en Animales de Laboratorio, Hospital Universitario de Yeungnam, Daegu 42415, República de Corea

4Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina de la Universidad de Yeungnam, Daegu 42415, República de Corea

5Departamento de Urología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Kyungpook, Daegu 41566, República de Corea

6 Departamento de Patología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Kyungpook, Daegu 41566, República de Corea

7 Departamento de Urología, Facultad de Medicina de la Universidad de Yeungnam, Daegu 42415, República de Corea

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