Abstracto

La depresión representa un trastorno psiquiátrico altamente prevalente e incapacitante a nivel mundial. Cada vez hay más pruebas que indican que la activación neuroinflamatoria excesiva dentro del hipocampo contribuye sustancialmente a la aparición y progresión de los síntomas depresivos. Cistanche feniletanol glucósidos (CPhG), principales componentes bioactivos extraídos de hierbas medicinales comestibles tradicionalesCistanche deserticolaycistanche tubulosa, han mostrado múltiples propiedades farmacológicas neuroprotectoras en estudios previos. Esta presente investigación tuvo como objetivo explorar los impactos terapéuticos y los mecanismos moleculares ejercidos por las CPhG en fenotipos conductuales similares a la depresión desencadenados por estrés leve crónico impredecible (CUMS) en ratones C57BL/6.

Se separaron aleatoriamente sesenta ratones C57BL/6 de grado SPF en seis cohortes experimentales: grupo de control, grupo modelo CUMS, grupo de CPhG en dosis alta (700 mg/kg), grupo de CPhG en dosis media (350 mg/kg), grupo de CPhG en dosis baja (175 mg/kg) y grupo de fluoxetina de control positivo (15 mg/kg). Después de una intervención de alimentación forzada durante cuatro semanas siguiendo el modelo CUMS, se implementaron evaluaciones neuroconductuales integrales que incluyeron la prueba de preferencia de sacarosa (SPT), la prueba de campo abierto (OFT), la prueba de suspensión de la cola (TST) y la prueba de nado forzado (FST). Los kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) cuantificaron las concentraciones séricas de neurotransmisores monoaminas, junto con citoquinas proinflamatorias y mediadores inflamatorios del hipocampo. La tinción con hematoxilina-eosina (HE) y la tinción de Nissl visualizaron lesiones patológicas neuronales dentro de las regiones del giro dentado del hipocampo. La inmunohistoquímica detectó la intensidad de la expresión de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), la molécula adaptadora de unión al calcio ionizada-1 (Iba-1), las proteínas NLRP3 y Caspasa-1. La tinción de inmunofluorescencia evaluó aún más el estado de activación de la cascada de señalización TLR4/NF-κB aguas arriba.

Nuestros resultados experimentales demostraron que la administración oral de CPhG mitigó notablemente las anomalías de conducta relacionadas con la depresión. Los CPhG elevaron el porcentaje de preferencia de sacarosa y disminuyeron la duración de la inmovilidad en paradigmas conductuales basados ​​en la desesperación. Además, el tratamiento con CPhG restableció los niveles agotados de serotonina (5-HT) sérica y del hipocampo, así como los niveles de dopamina (DA). La detección bioquímica reveló una supresión significativa de los mediadores proinflamatorios del hipocampo y la sobreproducción de citocinas. Las observaciones histopatológicas ilustraron el alivio dosis-dependiente del daño neuronal del hipocampo provocado por CUMS. Los resultados inmunohistoquímicos mostraron que las CPhG aumentaron la densidad de los astrocitos marcados por GFAP, inhibieron la hiperactivación patológica de la microglía positiva para Iba-1 y regularon negativamente la abundancia de proteínas relacionadas con el inflamasoma NLRP3. Los ensayos de inmunofluorescencia validaron que las CPhG restringieron el exceso de TLR4 y la activación fosforilada de NF-κB p65 dentro del tejido del hipocampo.

En conjunto, estos hallazgos confirman que las CPhG ejercen una eficacia similar a la de los antidepresivos contra las manifestaciones similares a la depresión estimuladas por CUMS en ratones. Su mecanismo farmacológico está mediado parcialmente a través de funciones reguladoras duales: restaurar la homeostasis del neurotransmisor monoamina y restringir las respuestas neuroinflamatorias mediadas por el eje de señalización TLR4/NF-κB/NLRP3. Este estudio en animales proporciona una base experimental preclínica que respalda una mayor explotación de los CPhG como agentes candidatos naturales prometedores o ingredientes alimentarios funcionales para la intervención adyuvante en la depresión.

Palabras clave: Cistanche feniletanol glucósidos (CPhG); depresión; estrés leve crónico e impredecible; neuroinflamación; astrocitos; microglía; Vía del inflamasoma TLR4/NF‑κB/NLRP3

1. Introducción

La depresión es una enfermedad psiquiátrica afectiva multifacética caracterizada por manifestaciones clínicas básicas que comprenden mal humor persistente, anhedonia, retraso psicomotor, alteraciones del sueño-vigilia y disfunción somática. Los episodios depresivos graves pueden provocar autolesiones e ideas suicidas, lo que impone enormes cargas para la salud pública en todo el mundo. Los datos de una encuesta epidemiológica de China informaron que la prevalencia nacional de la depresión alcanzó el 2,1 %, y la Organización Mundial de la Salud ha clasificado el trastorno depresivo mayor entre las principales enfermedades que contribuyen a la pérdida global de años de vida ajustados en función de la discapacidad.

Sin embargo, la etiología molecular completa que subyace a la patogénesis de la depresión aún no está completamente aclarada, lo que dificulta soluciones terapéuticas clínicas perfectas. Las hipótesis fisiopatológicas contemporáneas han cambiado el enfoque hacia los mecanismos de interferencia neuroinmunes. La acumulación de investigaciones preclínicas y clínicas destaca la neuroinflamación persistente como un factor patogénico vital para los trastornos depresivos. Bajo desafíos de estrés psicológico o fisiológico crónico, las poblaciones de células gliales del hipocampo sufren una activación anormal. La microglía sobreactivada y los astrocitos disfuncionales desencadenan una liberación intensa de múltiples mediadores proinflamatorios, creando efectos de amplificación en cascada de citoquinas proinflamatorias. Estas agresiones neuroinflamatorias inducen aún más el deterioro morfológico neuronal, la alteración metabólica de los neurotransmisores y el deterioro de la plasticidad sináptica, lo que en última instancia facilita la progresión patológica similar a la depresión.

Las intervenciones antidepresivas clínicas convencionales actuales se basan predominantemente en antidepresivos químicos sintéticos representados por la fluoxetina, un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina (ISRS). A pesar del alivio parcial de los síntomas en ciertos pacientes, los antidepresivos sintéticos presentan inconvenientes bien reconocidos: índices de remisión completa insatisfactorios, frecuentes síntomas depresivos residuales, alta probabilidad de recaída después de la interrupción de la medicación, además de efectos secundarios adversos gastrointestinales, hepáticos y metabólicos durante la administración a largo plazo. Por el contrario, las medicinas herbarias tradicionales presentan características moduladoras de múltiples objetivos y perfiles de seguridad relativamente leves, por lo que despiertan un creciente interés en la investigación sobre la terapia adyuvante de los trastornos del estado de ánimo.

Cistanche deserticolaycistanche tubulosa, comúnmente llamado "ginseng del desierto", pertenece a la familia Orobanchaceae. Sus tallos carnosos sirven como materias primas medicinales homólogas clásicas en la práctica herbaria tradicional asiática. Las investigaciones farmacológicas modernas documentan múltiples bioactividades neuroprotectoras paracistancheextractos, incluidos efectos antineurodegenerativos contra la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. Los glucósidos de feniletanol constituyen las principales fracciones bioactivas en su interior.cistancheextractos, que contienen principalmente echinacósido y verbascósido. Los glucósidos de feniletanol (CPhG) de Cistanche exhiben bioactividades antitumorales, antioxidantes, inmunomoduladoras y neuroprotectoras en múltiples plataformas experimentales.

Trabajos de laboratorio preliminares anteriores han demostrado que las CPhG podrían elevar la concentración de dopamina estriatal y aliviar los fenotipos depresivos asociados a la menopausia en modelos animales de roedores. Sin embargo, todavía falta una exploración sistemática para determinar si las CPhG producen influencias protectoras sobre la depresión provocada por el estrés crónico y las cascadas detalladas de transducción de señales que median tales bioactividades. El paradigma animal del estrés leve crónico impredecible (CUMS, por sus siglas en inglés) es un modelo de depresión preclínica bien establecido. Al exponer a roedores de laboratorio a diversos factores estresantes leves aleatorios durante semanas sucesivas, CUMS recapitula de manera confiable las características depresivas centrales, como la anhedonia, la desesperación conductual y el daño neuropatológico del hipocampo.

En consecuencia, esta investigación construyó un modelo de ratón depresivo inducido por CUMS para evaluar sistemáticamente la potencia antidepresiva in vivo de tres dosis graduales de CPhG. Nos centramos particularmente en la recuperación del neurotransmisor monoamina, la transformación fenotípica de las células gliales del hipocampo y la vía neuroinflamatoria del inflamasoma NLRP3 gobernada por TLR4/NF-κB. Este estudio tiene como objetivo proporcionar evidencia experimental objetiva para respaldar el futuro desarrollo farmacéutico y la aplicación de CPhG en alimentos funcionales dirigidos a la mejora de los síntomas depresivos.

2. Materiales y métodos

2.1 Materiales, reactivos e instrumentos experimentales

El extracto crudo estandarizado de CPhG se adquirió de Hotan Dichen Pharmaceutical Biological Co., Ltd (lote número . 20231221, Xinjiang, China). Contenido total de feniletanol glucósido Mayor o igual al 85 %, conteniendo equinacósido Mayor o igual al 40 % y verbascósido Mayor o igual al 16 %. Las cápsulas de clorhidrato de fluoxetina se obtuvieron de Patheon France. Los kits de ensayo ELISA comerciales para 5‑HT, DA, iNOS, COX‑2, PGE2, TNF‑, IL‑1, IL‑18, IL‑6, IFN‑ se obtuvieron de proveedores calificados de reactivos biológicos. Los anticuerpos primarios aplicados para inmunohistoquímica e inmunofluorescencia incluyeron anticuerpos anti‑GFAP, anti‑Iba‑1, anti‑NLRP3, anti‑Caspasa‑1, anti‑TLR4 y anti‑fosfo‑NF‑κB p65. Se prepararon kits de tinción histológica para tinción HE y Nissl para el procesamiento de secciones de cerebro en parafina.

Los instrumentos analíticos de laboratorio clave incluyeron una balanza analítica electrónica de alta precisión, una estación de trabajo de purificación de agua ultrapura Milli-Q, un lector de microplacas multimodo SpectraMax, un microscopio de fluorescencia vertical Leica, además de hardware completo de análisis del comportamiento de roedores y un sistema de software de seguimiento de movimiento SMART 3.0.

Se compraron sesenta ratones macho SPF de grado C57BL/6, de siete semanas de edad con un rango de peso corporal inicial de 18 a 22 g, de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Todas las manipulaciones experimentales con ratones obtuvieron la aprobación ética formal del Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina China de Shaanxi (ID de aprobación ética: SUCMDL20231015003). Los ratones se alojaron en instalaciones de alojamiento para animales libres de patógenos específicos. Los parámetros ambientales se mantuvieron a temperatura ambiente (21 ± 2) grados, humedad relativa 60 % ± 10 %, implementando ciclos de iluminación estándar de 12 horas de luz y oscuridad. La comida para roedores y el agua potable eran accesibles ad libitum. Se realizó un período de aclimatación adaptativa de una semana antes de iniciar flujos de trabajo experimentales formales.

2.2 Agrupación de animales, modelado CUMS y administración de fármacos

Después de una semana de crianza adaptativa, la evaluación preliminar de la preferencia de sacarosa excluyó a ratones individuales con una preferencia inherente baja en el consumo de azúcar. Los ratones experimentales calificados se asignaron al azar a seis grupos de estudio (n = 10 animales en cada grupo):

Grupo control (Con): sin estrés CUMS, administración intragástrica de agua desionizada isovolumétrica;

Grupo modelo CUMS (Mod): recibe estimulación CUMS completa, alimentación forzada con agua desionizada de igual volumen;

Grupo de CPhG en dosis altas (CPhG-H): exposición a CUMS, CPhG 700 mg/kg de peso corporal mediante alimentación forzada diaria;

Grupo de CPhG de dosis media (CPhG-M): exposición a CUMS, CPhG 350 mg/kg por alimentación forzada diaria;

Grupo de CPhG en dosis bajas (CPhG-L): exposición a CUMS, CPhG 175 mg/kg por alimentación forzada diaria;

Grupo de control positivo de fluoxetina (FLX): exposición a CUMS, 15 mg/kg de fluoxetina por alimentación forzada una vez al día.

Para la construcción del modelo CUMS, se adoptaron diez tipos diferentes de factores estresantes leves: restricción física (60 min), agitación horizontal (60 min), suspensión de la cola (60 min), jaula inclinada en un ángulo de 45 grados (24 h), ambiente de cama húmedo (24 h), aislamiento de la jaula vacía (24 h), iluminación nocturna (12 h), natación en agua caliente a 41 grados durante 5 min, natación en agua fría a 4 grados durante 5 min y estimulación con pinza de cola duradera. 2 min. Se aplicaron aleatoriamente dos factores estresantes distintos todos los días; Un factor estresante idéntico no aparecería consecutivamente en dos días adyacentes. El procedimiento de modelado CUMS persistió durante cuatro semanas.

Al finalizar el modelado de estrés de cuatro semanas, se administraron por vía intragástrica las sustancias de prueba correspondientes o el vehículo solvente una vez al día durante otras cuatro semanas continuas. En la octava semana experimental, todos los proyectos de detección neuroconductual se implementaron de forma secuencial.

2.3 Batería de pruebas neuroconductuales

2.3.1 Prueba de preferencia de sacarosa (SPT)

La prueba de preferencia de sacarosa evalúa el fenotipo depresivo central similar a la anhedonia en roedores. Antes de la medición formal, cada ratón estaba alojado individualmente. Se ejecutó una fase de adaptación a las bebidas de sacarosa de tres días. Día uno: dos botellas de solución de sacarosa al 1 % colocadas dentro de cada jaula durante 24 h. Día dos: una botella de solución de sacarosa combinada con una botella de agua purificada. Día tres: intercambiar la posición de los contenedores de agua azucarada y de agua pura para eliminar la influencia del sesgo de ubicación. Después del ciclo de adaptación, los ratones ayunaron sin comida ni agua durante 24 horas. Posteriormente, se les proporcionó una botella de agua con sacarosa al 1 % pesada previamente y una botella de agua purificada. Las posiciones de las botellas se intercambiaron después de 12 h. Después de una duración total de la prueba de 24 h, se registró con precisión el peso del líquido restante de ambas botellas. Tasa de preferencia de sacarosa (%)=(consumo de solución de sacarosa)/(consumo de solución de sacarosa + consumo de agua purificada) × 100 %.

2.3.2 Prueba de campo abierto (OFT)

El aparato de campo abierto formó una caja cúbica de 50 cm × 50 cm × 50 cm con la parte superior abierta. La región del cuadrado central se definió como una zona central de 25 cm × 25 cm centrada dentro de la arena. Cada ratón se colocó suavemente sobre la superficie central de la caja de campo abierto. Se permitió un tiempo de adaptación gratuito de cinco minutos. El registro del comportamiento y el análisis de datos se concentraron en un período de observación posterior de cinco minutos. Los indicadores de lectura primarios contenían la distancia total de movimiento, el tiempo pasado dentro de la zona central y la frecuencia de las entradas a la zona central. Estos parámetros reflejan la actividad locomotora espontánea y la voluntad exploratoria en condiciones ambientales desconocidas.

2.3.3 Prueba de suspensión trasera (TST)

La porción de la cola del ratón se fijó de forma segura permitiendo que el animal colgara boca abajo sobre la superficie del suelo. El tiempo total de grabación fue de seis minutos. Se documentó la duración del tiempo de inmovilidad durante el último segmento de cuatro minutos. El aumento del tiempo de inmovilidad representa un mayor estado conductual de tipo depresivo y desesperado.

2.3.4 Prueba de Natación Forzada (FST)

Se llenó un barril de natación cilíndrico transparente (diámetro 15 cm, altura 50 cm) con agua mantenida a (25 ± 2) grados; La profundidad del agua alcanzó los 20 cm. Cada ratón se colocó suavemente en un recipiente de natación durante un intervalo de registro total de seis minutos. Se cuantificó estadísticamente el tiempo de inmovilidad flotante de los últimos cuatro minutos. Un período de inmovilidad más prolongado indica un desempeño conductual intensificado relacionado con la desesperación.

2.4 Recolección de muestras y preparación de tejidos

En el punto terminal experimental de la semana 8, los ratones se sometieron a una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 3 % (10 ml/kg) para anestesia profunda. Las muestras de sangre se recolectaron mediante la técnica de sangrado por extracción del globo ocular. Posteriormente se realizó la eutanasia por luxación cervical. La perfusión cardíaca fría con solución salina normal eliminó la sangre circulante dentro de los tejidos cerebrales. Se diseccionaron rápidamente muestras completas de todo el cerebro. Se sumergió la mitad del tejido cerebral en una solución de paraformaldehído al 4 % durante 72 horas para fijar el tejido para su posterior histología. Se aislaron rápidamente regiones del cerebro del hipocampo a partir de muestras de cerebro restantes en una plataforma de hielo preenfriada y se conservaron dentro de un entorno de almacenamiento de nitrógeno líquido. Para la medición bioquímica, se mezclaron 10 mg de muestra de tejido del hipocampo con solución salina normal preenfriada siguiendo una relación masa-volumen de 1:9, y se sometió a una homogeneización mecánica en baño de hielo. El homogeneizado de tejido se centrifugó a 4000 r/min durante 15 minutos y se recogieron las fracciones sobrenadantes para la cuantificación del biomarcador ELISA.

2.5 Medición del índice bioquímico

De acuerdo con los manuales de funcionamiento de los fabricantes de los kits ELISA comerciales, se midieron muestras sobrenadantes de suero y homogeneizado de hipocampo para adquirir valores de concentración de neurotransmisores monoamina, incluidos 5-HT y DA. El sobrenadante del homogeneizado de hipocampo se analizó adicionalmente para detectar indicadores mediadores inflamatorios iNOS, COX-2, PGE2, junto con citoquinas proinflamatorias TNF-, IL-1, IL-18, IL-6 e IFN-. Las lecturas de absorbancia de densidad óptica se capturaron mediante un espectrofotómetro de microplacas. La concentración de proteína de la muestra se calibró aplicando el kit de cuantificación de proteínas BCA antes de la detección de citoquinas.

2.6 Tinción histopatológica del hipocampo

Se incluyeron muestras de tejido cerebral fijadas en cera de parafina y se cortaron en secciones histológicas de 4 μm de espesor. Para la tinción con HE: las secciones de parafina se sometieron a desparafinado con xileno, hidratación en gradiente de etanol, tinción nuclear con hematoxilina, contratinción citoplásmica con eosina, diferenciación de alcohol clorhídrico, deshidratación en gradiente de etanol, tratamiento de transparencia de xileno y montaje de goma neutra. La observación microscópica se centró en la morfología celular, el estado nuclear y la integridad estructural citoplasmática dentro de la región del giro dentado del hipocampo.

La tinción de Nissl visualiza corpúsculos neuronales de Nissl que reflejan la actividad biosintética neuronal y la vitalidad celular. Se incubaron rodajas de parafina desparafinadas en solución de trabajo de tinción de Nissl. Después de los pasos de lavado con agua destilada, las secciones recibieron deshidratación, procedimiento de transparencia y sellado. Se observaron variaciones histomorfológicas de las neuronas del hipocampo bajo un microscopio óptico.

2.7 Ensayo de inmunohistoquímica

Se desparafinaron e hidrataron secciones de tejido del hipocampo incluidas en parafina. Se implementaron secuencialmente pasos de recuperación de antígeno, bloqueo de peroxidasa endógena y bloqueo de unión a proteínas no específicas. Los cortes de tejido se incubaron durante la noche a una temperatura de 4 grados con anticuerpos primarios diluidos: anti‑GFAP (1:400), anti‑Iba‑1 (1:400), anti‑NLRP3 (1:300), anti‑Caspasa‑1 (1:400). Después de la incubación del anticuerpo secundario, se realizó la reacción cromogénica DAB. Se completaron los procedimientos de contratinción, deshidratación y montaje del núcleo. El microscopio óptico capturó imágenes digitales del campo de visión. El software de procesamiento de imágenes Image-J calculó los valores promedio de densidad óptica para evaluar semicuantitativamente la intensidad de expresión de la proteína objetivo.

2.8 Tinción por inmunofluorescencia

Las secciones de hipocampo preparadas en parafina experimentaron operaciones de desparafinado, recuperación de antígenos y bloqueo. Se aplicaron anticuerpos primarios anti-TLR4 (1:400) y anti-fosfo-NF-κB p65 (1:200) y se incubaron durante la noche a cuatro grados Celsius. Se agregaron anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia para una incubación de una hora en condiciones de protección contra la luz. La contratinción nuclear DAPI se incluyó en el medio de montaje. Un microscopio de fluorescencia láser fotografió señales de fluorescencia. El software Image‑J calculó la intensidad de fluorescencia promedio que representa la magnitud de activación de la proteína p65 TLR4 y p‑NF‑κB.

2.9 Análisis estadístico

Los datos experimentales originales se procesaron utilizando el software estadístico SPSS 26.0 y el programa de gráficos GraphPad Prism 9.0. Todos los datos de resultados cuantitativos se expresaron como media ± desviación estándar (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Las comparaciones estadísticas entre grupos se llevaron a cabo con pruebas estadísticas apropiadas. Un valor de p inferior a 0,05 se consideró una diferencia estadísticamente significativa; PAG< 0.01 represented highly significant statistical distinction.

3. Resultados experimentales

3.1 Los CPhG mejoraron los síntomas de anhedonia y restauraron los niveles de neurotransmisores monoamina

Antes de iniciar el modelo CUMS, las tasas iniciales de preferencia de sacarosa no mostraban una variación estadística obvia en todas las cohortes de animales experimentales. Después de cuatro semanas de estrés CUMS más ciclos de intervención de cuatro semanas, el grupo del modelo CUMS exhibió una proporción de preferencia de sacarosa claramente disminuida en relación con los animales de control no estresados ​​(P< 0.01), demonstrating successful establishment of anhedonia depressive‑like phenotype. Serum and hippocampal tissue 5‑HT and DA concentrations in Mod group were significantly reduced compared with Con group (P < 0.05 or P < 0.01).

En comparación con la cohorte del modelo Mod, los grupos de tratamiento con CPhG en dosis alta, media y baja, así como el grupo positivo para fluoxetina, generaron una elevación prominente en el porcentaje de preferencia de sacarosa, los contenidos séricos de 5-HT, suero de DA, 5-HT del hipocampo y DA del hipocampo (P< 0.05 or P < 0.01). Pharmacological improvement effect exhibited apparent dose‑dependent tendency; high‑dose CPhGs group achieved more robust biomarker‑rescue outcome than medium‑dose and low‑dose subgroups. This set of findings illustrated CPhGs could ameliorate anhedonic behavioral performance and reverse stress‑provoked depletion of key mood‑regulating monoamine neurotransmitters inside peripheral circulation and hippocampal brain tissue.

3.2 Actividad exploratoria mejorada de CPhG en pruebas de campo abierto

En la evaluación del comportamiento en campo abierto, los ratones modelo CUMS manifestaron una reducción notable en la distancia total de movimiento, el tiempo de permanencia en la zona central y la frecuencia de entrada en la región central en comparación con los ratones de control (P< 0.01). Chronic unpredictable stress suppressed spontaneous exploratory behaviors. Following CPhGs or fluoxetine intervention, those three open‑field‑test indicators increased observably (P < 0.05 or P < 0.01). High‑dose CPhGs‑treated mice displayed 46.63 % increase of total travel distance, 127.92 % growth of central‑zone residence time compared against Mod group. Medium‑dose and low‑dose CPhGs also produced measurable but weaker improvement effects. It indicated CPhGs alleviated stress‑induced suppression of autonomous exploration activity.

3.3 Los CPhG acortaron el tiempo de inmovilidad en paradigmas conductuales basados ​​en la desesperación

La prueba de suspensión de la cola y la prueba de nado forzado detectan la desesperación conductual, lo que representa lecturas conductuales centrales similares a las depresivas. El grupo Mod mostró un tiempo de inmovilidad drásticamente prolongado tanto en TST como en FST (P< 0.01) relative to Con group. After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M, CPhGs‑L and FLX groups generated statistically significant shortening of immobility durations (P < 0.05 or P < 0.01). For forced‑swim immobility time, high‑dose CPhGs brought 34.67 % reduction; medium‑dose 30.71 % reduction; low‑dose 20.78 % reduction. For tail‑suspension immobile time: CPhGs‑H achieved 35.91 % decrease. Results suggested CPhGs mitigated despair‑related passive coping behavioral patterns triggered by long‑term unpredictable stress stimulation.

3.4 Las CPhG redujeron las citocinas proinflamatorias del hipocampo sobreexpresadas

Las concentraciones de citocinas proinflamatorias del hipocampo (TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN-) en animales modelo CUMS fueron drásticamente elevadas en comparación con sus homólogos de control (P< 0.01). After CPhGs intervention, these pro‑inflammatory cytokine contents descended in dose‑responsive fashion. High‑dose CPhGs generated the most powerful inhibitory influence. For instance, relative to Mod group, CPhGs‑H decreased TNF‑α level by 42.93 %, lowered IL‑1β by 45.72 %, and reduced IL‑18 by 35.17 %. Medium‑dose CPhGs delivered moderate anti‑inflammatory potency, and low‑dose group exerted limited but detectable inhibitory impacts. This data demonstrated CPhGs could suppress excessive pro‑inflammatory‑cytokine release inside hippocampal tissue under chronic‑stress challenge.

3.5 Biomarcadores mediadores inflamatorios del hipocampo regulados negativamente por CPhG

Los mediadores inflamatorios del hipocampo iNOS, COX-2 y PGE2 en ratones modelo CUMS aumentaron significativamente (P< 0.01). After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M markedly diminished iNOS, COX‑2 and PGE2 concentrations (P < 0.05 or P < 0.01). Low‑dose CPhGs‑L group showed limited statistical significance for partial indicators. High‑dose CPhGs treatment group exhibited iNOS reduction rate reaching 49.55 %, COX‑2 reduction 39.58 %. Collectively, CPhGs suppressed stress‑induced up‑regulation of inflammatory‑mediator molecules inside hippocampus.

3.6 Lesión patológica neuronal del hipocampo desencadenada por CUMS atenuada por CPhG

Resultados de la tinción HE: las neuronas del giro dentado del hipocampo del grupo Mod presentaron lesiones patológicas graves: disposición celular desordenada, picnosis del núcleo, degeneración vacuolar citoplasmática, manifestándose un daño neuronal prominente. El grupo CPhGs-L mostró sólo un efecto de mejora trivial. Obviamente, las CPhG en dosis medias y altas revirtieron dichas alteraciones patológicas; El grupo de dosis altas de CPhGs-H mostró un efecto de protección neuronal superior en comparación con el grupo de fluoxetina en campos visuales parciales.

Resultados de la tinción de Nissl: las neuronas del hipocampo del grupo Mod exhibieron una disposición desorganizada, una reducción notoria de la cantidad de corpúsculos de Nissl, lo que reflejaba una función sintética neuronal deteriorada y una baja vitalidad celular. La administración de CPhG restableció la abundancia del cuerpo de Nissl de forma dosis dependiente. La morfología neuronal y la densidad de corpúsculos de Nissl dentro del grupo CPhGs-H se acercaron al nivel normal del grupo de control. Los hallazgos histopatológicos confirmaron que las CPhG protegían la integridad de las neuronas del hipocampo contra la destrucción mediada por el estrés crónico.

3.7 Estado de activación de las células gliales del hipocampo reguladas por CPhG

GFAP es un biomarcador específico de la población de astrocitos. En comparación con el grupo Con, la intensidad de la señal positiva del GFAP del hipocampo del grupo Mod disminuyó significativamente (P< 0.01), indicating massive astrocyte functional impairment induced by CUMS stress. CPhGs‑H and CPhGs‑M intervention groups distinctly elevated GFAP expression level (P < 0.05 or P < 0.01); high‑dose CPhGs‑H enhanced GFAP average optical density by 64.23 % relative to Mod group. Low‑dose CPhGs‑L generated upward trend without statistical significance.

El marcador de proteína iba-1 representa la microglía. El grupo del modelo CUMS mostró un aumento espectacular de la señal de expresión positiva de Iba-1 (P< 0.01), implying robust microglia hyper‑activation. After CPhGs intervention, Iba‑1 expression intensity decreased dose‑dependently. CPhGs‑H produced 23.73 % reduction of Iba‑1 optical‑density value versus Mod group. It illustrated CPhGs preserved astrocyte abundance while dampening pathological microglia over‑activation inside hippocampal compartments.

3.8 Los CPhG inhibieron la expresión de la proteína relacionada con el inflamasoma NLRP3 del hipocampo

La detección inmunohistoquímica manifestó que la expresión de la proteína NLRP3 y Caspasa-1 dentro del hipocampo del grupo Mod estaba marcadamente regulada positivamente (P< 0.01). Following CPhGs treatment, NLRP3 and Caspase‑1 protein abundance declined dose‑responsively. High‑dose CPhGs‑H decreased NLRP3 expression by 50.00 %, lowered Caspase‑1 expression level by 57.65 %. It demonstrated CPhGs suppressed pathological NLRP3 inflammasome complex activation in CUMS‑damaged hippocampal tissue.

3.9 CPhG suprimió la sobreactivación de la vía de señalización TLR4/NF-κB

La detección de inmunofluorescencia demostró que los ratones modelo CUMS mostraban una intensidad de fluorescencia significativamente aumentada del receptor TLR4 y la subunidad p65 NF-κB fosforilada (P< 0.01). CPhGs intervention obviously reduced TLR4 and p‑NF‑κB p65 fluorescence signal strength (P < 0.05 or P < 0.01). Combined with above‑mentioned NLRP3 inflammasome‑protein detection results, these observations supported the inference: CPhGs inhibited TLR4/NF‑κB upstream signal‑cascade hyper‑activation, which sequentially restrained downstream NLRP3 inflammasome assembly and neuro‑inflammatory cascade amplification.

4. Discusión

El trastorno depresivo mayor constituye una enfermedad neuropsiquiátrica grave. En los últimos años, la teoría neuroinflamatoria de la depresión ha atraído una amplia atención de la investigación. El estrés psicológico repetido y crónico puede desencadenar la activación del sistema inmunológico innato dentro del sistema nervioso central. El hipocampo, una región del cerebro muy vulnerable a los ataques de estrés, está estrechamente correlacionado con la modulación del estado de ánimo, el procesamiento de recompensas y la función de la memoria. Bajo estimulación sostenida por estrés, la homeostasis de las células gliales del hipocampo colapsa. La microglía hiperactivada y los astrocitos dañados secretan grandes cantidades de citocinas proinflamatorias, lo que da lugar a una lesión estructural neuronal y un trastorno metabólico de los neurotransmisores monoamino, y eventualmente promueve la aparición de un comportamiento similar a la depresión.

Los productos naturales activos derivados de las medicinas tradicionales a base de hierbas poseen ventajas farmacológicas para múltiples objetivos, lo que los convierte en recursos candidatos prometedores para el descubrimiento de fármacos antidepresivos. Los CPhG son componentes bioactivos exclusivos aislados decistanchehierba medicinal. Esta investigación construyó un modelo de ratón con depresión por estrés crónico inducido por CUMS, verificando exhaustivamente la eficacia antidepresiva in vivo de los CPhG en dosis graduales. Los resultados experimentales de comportamiento demostraron que el tratamiento con CPhG mejoró significativamente los síntomas de anhedonia, mejoró la actividad exploratoria y redujo el tiempo de inmovilidad relacionado con la desesperación en ratones modelo de depresión, lo que muestra una clara correlación dosis-efecto.

La hipótesis del neurotransmisor monoamina es la teoría clásica de la patogénesis de la depresión. La serotonina y la dopamina desempeñan funciones reguladoras críticas que abarcan la estabilización emocional, la percepción de recompensa y retroalimentación y la modulación del comportamiento relacionada con la motivación. El estrés CUMS condujo a una disminución obvia de las concentraciones de 5-HT y DA en el suero y el tejido del hipocampo en nuestros animales modelo. La intervención de CPhG restableció eficazmente estos dos niveles de neurotransmisores monoaminas. Este resultado es consistente con informes de investigación publicados anteriormente sobrecistancheExtractos que modulan los neurotransmisores monoaminas cerebrales.

Otras pruebas de biomarcadores bioquímicos revelaron que CUMS indujo una fuerte elevación de múltiples citoquinas proinflamatorias (TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN-) más mediadores inflamatorios (iNOS, COX-2, PGE2) dentro del tejido del hipocampo. La intervención con CPhG revirtió significativamente dicho estado de sobreexpresión inflamatoria. La tinción histopatológica con HE y Nissl demostró intuitivamente que las CPhG mitigaron el daño a las neuronas del hipocampo causado por el estrés y protegieron la integridad morfológica neuronal.

Las poblaciones de células gliales actúan como participantes centrales que median las respuestas neuroinflamatorias. Los astrocitos mantienen el reciclaje de neurotransmisores, la estabilidad estructural de la barrera hematoencefálica y el suministro de nutrición neuronal. La microglia funciona como células efectoras del sistema inmunológico innato residentes dentro del parénquima cerebral. El estrés crónico provoca pérdida de astrocitos o incompetencia funcional, junto con una hiperactivación patológica de la microglía. Nuestros datos de inmunohistoquímica indicaron que el tratamiento con CPhG elevó la densidad de astrocitos positivos para GFAP, mientras que redujo la cantidad de microglia sobreactivada marcada con Iba-1 en el hipocampo. Esta propiedad reguladora del fenotipo de las células gliales puede ser parcialmente la base de la potencia farmacológica neuroprotectora y antidepresiva de las CPhG.

El inflamasoma NLRP3 representa una plataforma molecular vital que media en la cascada neuroinflamatoria. Su activación impulsa la maduración y la secreción de citocinas proinflamatorias IL-1 e IL-18. El eje de señal TLR4/NF‑κB actúa como señal de cebado ascendente esencial para la activación del inflamasoma NLRP3. La estimulación del receptor TLR4 promueve la fosforilación de la subunidad NF-κB y la translocación nuclear, y transactiva aún más la transcripción del gen NLRP3, pro-IL-1. En nuestro presente estudio, el estrés CUMS desencadenó una mejora concurrente para la expresión de las proteínas TLR4, NF-κB p65 fosforilada, NLRP3 y Caspasa-1. La intervención de CPhG inhibió claramente la activación de toda esta cascada de señales. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que los CPhG alivian parcialmente la lesión neuroinflamatoria al restringir la activación del inflamasoma NLRP3 mediada por TLR4/NF-κB.

En conjunto, nuestra evidencia experimental en modelos animales respalda el modelo mecanicista: los CPhG generan efectos similares a los de los antidepresivos en ratones depresivos inducidos por CUMS a través de dos dimensiones principales: (1) restaurar la homeostasis de los neurotransmisores monoamínicos relacionados con el estado de ánimo (5-HT, DA); (2) modular la homeostasis de las células gliales del hipocampo y suprimir la cascada patológica neuroinflamatoria dependiente del inflamasoma NLRP3 impulsada por TLR4/NF-κB.

Varias limitaciones de esta investigación merecen consideración. Este trabajo implementó únicamente experimentos in vivo a nivel animal. No hemos realizado validación mecanística a nivel celular ni ensayos clínicos en humanos. Por lo tanto, la inferencia traslacional hacia la terapia de la depresión humana debe seguir siendo prudente. Además, esta investigación no analizó las contribuciones de los compuestos monoméricos individuales (equinacósido, verbascósido) dentro del extracto mixto de CPhG. Las investigaciones futuras pueden concentrarse en la verificación mecanicista de cultivos celulares, la comparación de la actividad de los componentes individuales, así como la observación piloto preliminar de sujetos humanos.

5. Conclusión

Los glucósidos de feniletanol (CPhG) de Cistanche producen importantes acciones farmacológicas similares a las de los antidepresivos contra fenotipos conductuales crónicos, impredecibles, leves, provocados por estrés, similares a la depresión, en ratones C57BL/6. Sus mecanismos relacionados con la terapéutica están asociados con la recuperación de los niveles de neurotransmisores de serotonina y dopamina en suero y en el hipocampo, la preservación de la integridad de la estructura neuronal del hipocampo, la modulación del equilibrio funcional de los astrocitos y la microglía, así como la supresión de la cascada patológica neuroinflamatoria mediada por el inflamasoma TLR4/NF-κB/NLRP3. Este estudio preclínico en animales proporciona una referencia experimental para un mayor desarrollo de las CPhG como sustancia adyuvante terapéutica natural o ingrediente alimentario funcional destinado a mejorar los síntomas depresivos.

Referencias

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