Progreso de la investigación sobre la clasificación del linfoma difuso de células B grandes

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El linfoma difuso de células B grandes (DLBCL, por sus siglas en inglés) representa del 25 al 35 por ciento de todos los linfomas no Hodgkin y es un grupo heterogéneo y agresivo con diferentes características clínicas, patológicas y biológicas. linfoma Estudios clínicos previos identificaron a rituximab, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona (R-CHOP) como el tratamiento estándar de primera línea para pacientes con DLBCL, de los cuales del 50 al 70 por ciento de los pacientes pueden, Sin embargo, una gran cantidad de pacientes muestran refractario o remisión completa y luego recaída, mientras que solo el 10 por ciento de los pacientes refractarios y recidivantes pueden curarse con inmunoquimioterapia de rescate tradicional combinada con trasplante autólogo de células madre hematopoyéticas, y el 90 por ciento restante de los pacientes tienen malos resultados de tratamiento. Por tanto, cómo mejorar el pronóstico de estos pacientes se ha convertido en un gran reto. En la actualidad, también hay estudios clínicos que discuten la combinación de otros fármacos (como lenalidomida, ibrutinib, etc.) sobre la base de R-CHOP para mejorar aún más la eficacia, pero no se han logrado avances significativos. DLBCL tiene una heterogeneidad significativa, por lo que cómo hacer diagnósticos estratificados precisos y guiar el tratamiento individualizado es también uno de los puntos críticos de investigación actuales. Este artículo resume el progreso de la clasificación DLBCL.

cistamcheAumentar la proliferación celular.

1. Tipificación COO de DLBCL usando un chip de perfil de expresión génica

DLBCL tiene una heterogeneidad obvia en la morfología celular y el pronóstico. En 2000, ALIZADEH y otros aplicaron la tecnología de chips genéticos para evaluar y detectar 3 186 genes que juegan un papel importante en el desarrollo, la diferenciación y la carcinogénesis de los linfocitos y mapearon la expresión génica de DLBCL. El perfil de expresión génica (GEP) mostró que DLBCL se originó a partir de linfocitos B en diferentes etapas de diferenciación. Según GEP, DLBCL se puede dividir en dos subtipos: tipo de células B del centro germinal (GCB) y tipo de células B activadas (ABC). Estudios posteriores de ROSENWALD et al. también confirmó este resultado. Estudios posteriores incluyeron más casos y más tipos de cribado genético y encontraron que algunos pacientes no podían determinar el origen de las células, que se caracterizaban entre dos subtipos, denominados tipo 3, también conocidos como no clasificados. Para DLBCL de diferentes orígenes, el estudio encontró que mostraba diferentes pronósticos, entre los cuales DLBCL derivado de GCB podría obtener un mayor tiempo de supervivencia. La tipificación celular de origen (COO) reveló la heterogeneidad del DLBCL y, bajo el tratamiento con R-CHOP, hubo diferencias significativas en la supervivencia entre los subtipos, lo que proporcionó una base teórica para evaluar el pronóstico y la selección del régimen. Los resultados de la prueba GEP basados ​​en la tecnología de chips genéticos se reconocen actualmente como el estándar de oro para juzgar el origen de las células DLBCL. Los resultados de las pruebas son los más confiables, pero son costosos y requieren muestras altas, generalmente muestras de tejido vivo fresco congelado, por lo que la operabilidad no es fuerte. No es muy utilizado en la práctica clínica.

2. Uso de la tecnología NanoString para la tipificación COO de DLBCL

NanoString (Fluorescent Barcode Labeled Single-Molecule Detection) es una nueva tecnología de perfilado de expresión génica de detección de alto rendimiento basada en la medición directa de códigos de barras moleculares fluorescentes en sondas después de que las moléculas de ácido nucleico se hibridan con las sondas. Cada etiqueta de código de barras corresponde a una secuencia de ARNm específica, y se pueden medir hasta 800 códigos de barras en la misma muestra, mientras que el volumen de muestra requerido puede ser tan bajo como 100 ng de ARN. La tecnología de cuantificación digital de NanoString elimina la necesidad de transcripción, amplificación o construcción de bibliotecas, eliminando largos procedimientos experimentales y recursos humanos, y minimizando el posible sesgo introducido por las reacciones enzimáticas. Para muestras clínicas con muestras escasas, la tecnología NanoString puede usar directamente muestras incluidas en parafina para cuantificar el ARN sin extracción de ARN. Esta ventaja técnica lo hace más práctico en la práctica clínica. SCOTT et al. examinó 20 genes en función de los datos de tipificación GEP y utilizó la tecnología NanoString para realizar la tipificación COO en 119 muestras de DLBCL. La consistencia entre los resultados de la investigación y el "estándar de oro" alcanzó el 95 por ciento, y los pacientes también se pueden dividir en tipo GCB, tipo ABC y tipo no clasificado, los dos últimos se denominan colectivamente tipo no GCB, lo que también muestra que el el pronóstico del tipo GCB es mejor que el del tipo no GCB. Otros estudios basados ​​en la tecnología NanoString han confirmado aún más el valor de esta tecnología en la tipificación COO de DLBCL.

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3. Tipificación COO de DLBCL utilizando tecnología de PCR cuantitativa

Tanto la tipificación de chips de genes como la tipificación de NanoString requieren un equipo especial costoso, que es difícil de aplicar ampliamente en la práctica clínica. La PCR cuantitativa es un método comúnmente utilizado para verificar la expresión génica. Tiene las características de operación simple, alta sensibilidad y precisión, y se puede obtener a partir de muestras incluidas en parafina. El equipo de Li Xiaoqiu utilizó por primera vez la PCR cuantitativa para realizar una validación clínica a gran escala en poblaciones de pacientes chinos y desarrolló un producto adecuado para las pruebas genéticas clínicas, a saber, el ensayo DLBCL-COO. En este estudio, se seleccionaron 32 genes significativamente relacionados con la tipificación DLBCL-COO en la base de datos pública, y se inscribieron 160 pacientes, y luego se usaron los métodos de inmunohistoquímica, PCR cuantitativa y chip genético para detectar sus muestras incluidas en parafina y las muestras frescas correspondientes. especímenes de tejido, los resultados mostraron que los resultados de tipificación del ensayo DLBCL-COO fueron consistentes en un 92 por ciento con el "estándar de oro"; El análisis de supervivencia mostró que los resultados de tipificación del ensayo DLBCL-COO se correlacionaron significativamente con la supervivencia general, y el pronóstico del tipo GCB fue significativamente mejor que el del tipo ABC (P =0.023), lo cual es muy consistente con la supervivencia doméstica. y resultados de investigaciones extranjeras. En términos relativos, la plataforma de métodos para la tipificación mediante tecnología de PCR cuantitativa es más abierta, la operación es más simple y es adecuada para el desarrollo de rutina en la mayoría de los laboratorios de patología molecular.

4. Tipificación COO de DLBCL por inmunohistoquímica

Para algunas áreas donde los fondos y las tecnologías son escasos, la tecnología de tipificación basada en GEP es difícil de usar ampliamente, por lo que el método de tipificación basado en inmunohistoquímica (IHC) sigue siendo el más utilizado clínicamente. En 2005, HANS y otros aplicaron la tecnología de micromatrices de tejido para la tipificación y establecieron un modelo de tipificación IHC mediante la detección de CD10, BCL6 y MUM-1. DLBCL se puede dividir en tipo GCB y tipo no GCB. El pronóstico de los primeros es significativamente mejor que el de los segundos. (PAGS<0.001), the="" agreement="" of="" this="" typing="" method="" with="" the="" gold="" standard="" was="" 84%.="" in="" order="" to="" further="" improve="" the="" accuracy="" of="" prognostic="" judgment,="" new="" typing="" systems,="" such="" as="" choi="" and="" tally,="" have="" been="" proposed="">

La tipificación de Choi se basa en cinco biomarcadores, incluidos CD10, BCL6, MUM-1, FOXP1 y GCET1, y se agregan dos marcadores, FOXP1 y GCET1 al método de tipificación de Hans, que es 93 por ciento consistente con el "oro estándar". Estudios previos han demostrado que FOXP1 se expresa en gran medida en el tipo ABC, y la alta expresión se asocia con un mal pronóstico. Cuando el valor crítico de FOXP1 es del 80 por ciento, se puede distinguir específicamente DLBCL de tipo ABC. Sin embargo, GCET1 se expresa mucho en las células B derivadas del centro germinal, por lo que agregar GCET1 a la tipificación de Hans es útil para distinguir el DLBCL tipo GCB y tipo ABC. En cuanto a la predicción del pronóstico, la clasificación de Choi se usó para predecir la tasa de supervivencia de 3-años de los pacientes, de los cuales el tipo GCB fue del 88 %, el tipo ABC fue del 44 % y los resultados de predicción de la clasificación GEP "estándar de oro" (El tipo GCB fue 92 por ciento, el tipo ABC fue 44 por ciento) 44 por ciento) está bastante cerca. Li Min et al. comparó la capacidad predictiva de la clasificación de Choi y la clasificación de Hans y también mostró que la primera era más precisa. La supervivencia global del grupo GCB y el grupo sin GCB bajo la clasificación de Hans no mostró diferencias significativas (P=0.102), mientras que la clasificación de Choi no mostró diferencias significativas en la supervivencia global (P=0 .102). El pronóstico del grupo de GCB fue significativamente mejor que el del grupo sin GCB (las tasas de supervivencia de 3-años fueron del 61,8 % y el 42,5 %, respectivamente, P<0.05). however,="" it="" is="" worth="" noting="" that="" in="" recent="" years,="" with="" the="" high="" inconsistency="" of="" bcl6="" found="" by="" different="" research="" centers,="" the="" inclusion="" of="" bcl6="" in="" the="" improved="" classification="" of="" choi="" and="" hans="" has="" been="" canceled.="" operation="" and="" result="">

Como se mencionó anteriormente, la tipificación de Hans basada en IHC y la tipificación de Choi tienen funciones similares, y los resultados de varios anticuerpos se juzgan en un cierto orden, lo que da como resultado que algunos anticuerpos tengan mayor prioridad que otros. El método de tipo permite excluir resultados de anticuerpos posteriores si se cumplen las condiciones anteriores. Sin embargo, la tipificación GEP no sigue un cierto orden ni excluye ciertos resultados. Para reducir tales diferencias, MEYER et al. desarrolló un método de tipificación que no juzga los resultados de anticuerpos en un orden específico, a saber, el método de tipificación Tally. La concordancia más alta con el "estándar de oro" fue del 93 por ciento, mientras que la tipificación de Hans y Choi fue del 87 por ciento. El método de tipo de conteo incluye cantidades iguales de anticuerpos GCB (GCET1 y CD10) y ABC (FOXP1 y MUM-1), y la clasificación está determinada por el par inmunofenotípico que es más antígeno positivo. Se utilizan dos anticuerpos para cada tipo, por lo que en el caso del mismo resultado positivo para cada tipo, se necesita LMO2 para determinar el inmunofenotipo (LMO2 Mayor o igual al 30 por ciento es el valor de corte). Los estudios han confirmado que LMO2 se expresa específicamente en linfocitos B o linfomas derivados de GCB, y su alta expresión se asocia significativamente con un buen pronóstico en DLBCL.

En conclusión, aunque el método de tipificación COO de DLBCL basado en IHC no es tan bueno como la tipificación NanoString y la PCR cuantitativa, la consistencia con el "estándar de oro" también es del 74 por ciento -93 por ciento. Tiene las ventajas de requisitos bajos y otras ventajas, que son convenientes para el desarrollo de rutina de varios hospitales. Entre ellos, los métodos de tipificación de Choi y Tally son más consistentes con el "estándar de oro", pero GCET1, FOXP1 y LMO2 no son anticuerpos permanentes, lo que limita su amplia aplicación hasta cierto punto.

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5. Exploración de la tipificación de DLBCL basada en mutación genética

Casi todos los pacientes con DLBCL tienen mutaciones genéticas, y los pacientes con ciertas mutaciones pueden afectar la eficacia de medicamentos dirigidos específicos y, por lo tanto, afectar el pronóstico. Por lo tanto, la subtipificación de DLBCL basada en firmas mutacionales tiene utilidad clínica. SCHMITZ et al. Seleccionó especímenes frescos congelados de 574 pacientes con DLBCL y utilizó la secuenciación del exoma y transcriptoma para analizar el número de copias de ADN del chip genético. Entre ellos, se seleccionaron 372 genes para amplificación y resecuenciación dirigidas a fin de identificar aquellos con genes reproducibles. Genes mutados sexualmente. Los resultados del estudio dividieron el DLBCL en 4 genotipos: tipo MCD (principalmente mutación MYD88L265P y CD79B), tipo BN2 (principalmente fusión BCL6 y mutación NOTCH2), tipo N1 (principalmente mutación NOTCH1) y tipo EZB (principalmente mutación EZH2) Mutación y BCL2 translocación), entre los cuales los tipos MCD y N1 se derivan principalmente de ABC, el tipo EZB se deriva principalmente de GCB y el tipo BN2 representa una cierta proporción de pacientes ABC, GCB y no clasificados respectivamente (el tipo GCB representó el 19 por ciento, el tipo ABC tipo representó el 41 por ciento, y el tipo no clasificado representó el 40 por ciento). El estudio también encontró que los nuevos genotipos pueden determinar mejor el pronóstico, entre los cuales los tipos BN2 y EZB tienen un mejor pronóstico que los tipos MCD y N1. Los tipos MCD, N1, BN2 y EZB predicen tasas de supervivencia de 5-años del 26 %, 36 %, 65 %, 68 %; el análisis multivariante también mostró que el nuevo genotipo era un factor independiente que afectaba el pronóstico y no se vio afectado por la puntuación del IPI. El equipo de investigación creó el algoritmo LymphGen para clasificar DLBCL en 7 genotipos según investigaciones anteriores, agregando A53 (con inactivación de TP53), ST2 (con mutaciones SGK1 y TET2) y otros inclasificables. Este método de genotipado podría identificar el 63,1 por ciento de los genotipos de DLBCL. . Entre ellos, el subtipo BN2 tiene mejor pronóstico en el tipo ABC, y el subtipo ST2 en el tipo GCB tiene mejor pronóstico que el subtipo EZB. Por lo tanto, se cree que la nueva genotipificación revela aún más la patogenia del DLBCL, con patogenia diferente entre los subtipos, y diferentes genotipos responden de manera diferente a la inmunoquimioterapia, lo que puede afectar la elección de la terapia dirigida, pero la mayor limitación de este método de clasificación es que algunos los pacientes no pueden clasificarse en ningún subtipo, lo que amerita mayor estudio.

A través de la secuenciación del exoma completo de 3{{30}}4 pacientes con DLBCL, CHAPUY et al. obtuvo datos sobre mutaciones de baja frecuencia, mutaciones recurrentes, cambios en el número de copias somáticas y variantes estructurales, y definió a los pacientes como cinco genotipos: tipo C1 (principalmente BCL10, TNFAIP3, UBE2A, mutación CD70 y translocación BCL6, en su mayoría de origen ABC), Tipo C2 (hay inactivación bialélica de TP53, que afecta la estabilidad cromosómica y el ciclo celular, y no tiene nada que ver con el origen ABC/GCB), tipo C3 (principalmente mutaciones BCL2, CREBBP2, EZH2, KMT2D, TNFRSF14, principalmente origen GCB), Mutaciones tipo C4 (principalmente SGK1, HIST1H1E, NFKBIE, BRAF y CD83, en su mayoría de origen GCB), tipo C5 (principalmente CD79B, MYD88L265P, ETV6), mutaciones PIM1 y TBL1XR1, en su mayoría de origen ABC, comunes en el sistema nervioso central primario y DLBCL testicular) y tipo C0 (falta de impulsores genéticos claros). El estudio también analizó más a fondo la relación entre los nuevos genotipos y el pronóstico. Los resultados mostraron que C0, C1 y C4 tenían mejores pronósticos, mientras que C3 y C5 tenían peor pronóstico. Entre los pacientes derivados de ABC, el pronóstico del tipo C1 fue significativamente mejor que el del tipo C5. , mientras que el tipo C4 fue significativamente mejor que el tipo C3 en los pacientes derivados de GCB. El nuevo genotipado también define el LDCBG tipo ABC (tipo C1) de bajo riesgo, cuyas células pueden originarse en la zona marginal extrafolicular; y DLBCL tipo GCB de alto riesgo con variantes estructurales BCL2 y PETN y enzimas epigenéticas. Alteraciones (tipo C3), mientras que el LDCBG tipo GCB de bajo riesgo se asocia a alteraciones en cinasas y múltiples proteínas recombinantes de múltiples vías (BCR/PI3K, JAK/STAT, BRAF) (tipo C4); tipificación no relacionada con el origen ABC/GCB Con inactivación bialélica de TP53, inestabilidad de 9p21.3/CDKN2A y genes relacionados (tipo C2). Las características genéticas clave de estos DLBCL incluyen mutaciones, cambios en el número de copias somáticas y variaciones estructurales y alteraciones en estas tres clases de información genética que pueden usarse para explicar las diferencias en los resultados de la enfermedad y el tratamiento.

Sobre la base de la secuenciación dirigida de 293 genes, LACY et al. analizó las características de mutación genética de 928 pacientes con DLBCL y dividió a los pacientes en 5 subtipos: tipo MYD88 (principalmente mutaciones MYD88L265P, PIM1, CD79B, principalmente de origen ABC, la mayoría de los pacientes con DLBCL originales con el sistema nervioso central, los testículos y las mamas pertenecen a este subtipo ); Tipo BCL2 (con EZH2, BCL2, CREBBP, T

Las mutaciones de NFRSF14, KMT2D y MEF2B son principalmente, principalmente de GCB, algunos pacientes con linfoma de alto grado y DLBCL transformados de linfoma folicular pertenecen a este tipo); tipo SOCS1/SGK1 (principalmente, las mutaciones SOCS1, CD83, SGK1, NFKBIA, HIST1H1E y STAT3 se derivan principalmente de GCB, y la mayoría de los DLBCL mediastínicos primarios pertenecen a este tipo); tipo TET2/SGK1 (principalmente incluidas las mutaciones TET2, SGK1, KLHL6, ZFP36L1, BRAF, MAP2K1 y KRAS, principalmente de origen GCB); tipo NOTCH2 (que incluye principalmente las mutaciones NOTCH2, BCL10, TNFAIP3, CCND3, SPEN, TMEM30A FAS y CD70, compuestas por ABC, GCB y origen no clasificado, con características similares al linfoma de la zona marginal); subtipo no clasificado (no clasificado en otra parte, NEC). El estudio analizó la relación entre los diferentes genotipos y el pronóstico, y los resultados mostraron que MYD88 tenía el peor pronóstico, con una tasa de supervivencia de 5-años del 42 por ciento; BCL2, SOCS1/SGK1 y TET2/SGK1 tuvieron un buen pronóstico, con una tasa de supervivencia de 5-años del 64,9 %, 62,5 % y 60,1 %, respectivamente; mientras que el pronóstico de los tipos NOTCH2 y NEC estaba entre los dos, y las tasas de supervivencia de 5-años eran del 48,1 % y el 53,6 %, respectivamente.

En resumen, se puede ver que los tres sistemas de clasificación no solo son diferentes sino que también tienen algunos contenidos superpuestos. Entre ellos, los tipos MYD88, C5 y MCD están todos relacionados con la fuente de ABC. Los linfomas primarios del sistema nervioso central y testiculares ocurren principalmente en estos tres tipos, y el pronóstico es malo. El tipo C2 se caracteriza por la mutación/deleción de TP53, y la mayoría tiene mal pronóstico, y A53 corresponde a C2. Los tipos BCL2, C3 y EZB están asociados con la fuente de GCB, tienen la misma firma mutacional que el linfoma folicular y, aunque los linfomas de alto grado y de doble impacto son más comunes en este tipo, el pronóstico general es bueno. Los tipos SOCS1/SGK1 y C4 son principalmente DLBCL derivados de GCB, que tienen características genéticas similares al linfoma primario de células B grandes del mediastino y tienen el mejor pronóstico. Sin embargo, la tipificación de mutaciones actual es compleja y los métodos y resultados de los diferentes estudios son diferentes. Por lo tanto, el proceso de análisis aún debe simplificarse en el futuro para aclarar aún más el impacto de los genes de mutación central en el pronóstico y el tratamiento.

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Resumen

La tipificación de COO basada en GEP es el "estándar de oro", pero requiere muestras altas, es costosa y no es fácil de realizar de forma rutinaria en la práctica clínica. Como alternativa, la tipificación de COO basada en NanoString, PCR cuantitativa y técnicas inmunohistoquímicas se han optimizado aún más en términos de requisitos de muestras, dificultad técnica y costos experimentales, pero la precisión del juicio pronóstico y el papel de guiar el tratamiento aún es mayor que el Estándar dorado. Hay una cierta brecha. Los estudios actuales también han demostrado que casi todos los pacientes con DLBCL contienen mutaciones genéticas, y las mutaciones genéticas desfavorables pueden afectar significativamente el pronóstico. La terapia dirigida de algunas mutaciones específicas también puede mejorar el pronóstico, por lo que la nueva clasificación basada en mutaciones genéticas tiene una importancia clínica importante. La tipificación de mutaciones genéticas es complementaria a la tipificación de COO, lo que explica que también existe una heterogeneidad significativa dentro del mismo subtipo de COO. Sin embargo, la tipificación de mutaciones genéticas no puede incluir a todos los pacientes, y se necesita más investigación para confirmar la importancia de la guía del pronóstico clínico y si los medicamentos dirigidos tradicionales y nuevos que se usan actualmente pueden guiar el tratamiento a través de esta tipificación.