Efectos moduladores de ROS de los polifenoles de arándano rojo (Vaccinium vitis-idaea L.) sobre la hipertrofia de adipocitos obesos y la disfunción endotelial vascular Parte 1

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Resumen:El estrés oxidativo y la secreción desregulada de adipocitoquinas que acompañan al tejido adiposo hipertrofiado inducen inflamación crónica, lo que conduce a una disfunción del endotelio vascular. El presente estudio investigó la capacidad de las fracciones de polifenoles (PP) de antocianina (ACN) y no antocianina de la fruta de arándano rojo para mitigar la hipertrofia del tejido adiposo y la disfunción endotelial utilizando adipocitos 3T3-L1 y células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). Este estudio mostró que la fracción PP disminuyó la generación de ROS intracelular en adipocitos hipertrofiados al mejorar la expresión de enzimas antioxidantes (SOD2) e inhibir la expresión de enzimas oxidantes (NOX4, iNOS). Además, las fracciones PP y ACN redujeron el contenido de triglicéridos en los adipocitos acompañados de una disminución de la expresión de genes lipogénicos como aP2, FAS y DAGT1. El tratamiento con ambas fracciones moduló la expresión de ARNm y la secreción de proteínas de adipocinas clave en adipocitos hipertrofiados. La expresión y secreción de leptina y adiponectina estaban, respectivamente, reguladas al alza y a la baja. Además, las fracciones de PP y ACN aliviaron la respuesta inflamatoria en las HUVEC inducidas por TNF- - al inhibir la expresión de genes proinflamatorios (IL-6, IL-1) y moléculas de adhesión (VCAM{{ 14}}, ICAM-1, SELE). Los resultados obtenidos sugieren que el consumo de arándano rojo rico en polifenoles puede ayudar a prevenir y tratar la obesidad y la disfunción endotelial debido a sus acciones antioxidantes y antiinflamatorias.

Palabras clave:polifenoles; antocianinas;arándano rojo; potencial antioxidante; antiobesidad; antiinflamatorio;extracto de cistanche tubulosa;3T3-Ll adipocitos; hipertrofia;adipoquinas; Disfunción endotélica

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1. Introducción

La obesidad es un factor de riesgo independiente de enfermedad cardiovascular y una de las principales causas del aumento del riesgo de dislipidemia, resistencia a la insulina, hipertensión y aterosclerosis tanto en adultos como en niños [1]. En la obesidad, el tejido adiposo blanco (WAT) por acumulación excesiva de grasa en adipocitos hipertrofiados se vuelve disfuncional, lo que conduce a inflamación crónica, estrés oxidativo y secreción desregulada de adipocinas que contribuye a la diabetes mellitus tipo 2 y también se asocia de forma independiente con disfunción endotelial coronaria [2]. ,3]. Los adipocitos hipertróficos son el factor esencial que vincula el balance energético positivo, la diabetes y las enfermedades cardiometabólicas [2]. WAT actúa como un órgano endocrino y, a través de adipocinas y citocinas secretadas, media en la comunicación cruzada entre WAT visceral o subcutáneo y tejidos cardiovasculares.Cistanche tubulosa redditAdipocinas como leptina, adiponectina y resistina, citocinas, TNF-, IL-1, IL-6, IL-8 y MCP-1, y especies reactivas de oxígeno y nitrógeno ( ROS y RNS) afectan el desarrollo de la disfunción endotelial a través de mecanismos directos e indirectos [4]. Además, el tejido adiposo perivascular (PVAT), principalmente de individuos obesos, promueve la inflamación local y el deterioro de la función endotelial.

PVAT contribuye a la homeostasis vascular al producir compuestos vasoactivos como adipocinas, ROS y óxido nítrico (NO). Al secretar una amplia gama de moléculas bioactivas, la PVAT influye en la contracción, proliferación y migración de las células del músculo liso vascular [4].

Cistanche puede mejorar la inmunidad

Las células endoteliales que recubren la pared interna de la vasculatura regulan las funciones homeostáticas, y su disfunción es un predictor temprano de aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares [5]. El estrés oxidativo contribuye a la activación de las células endoteliales, preparándolas para la adhesión, la infiltración y la activación de las células inmunitarias, lo que conduce a un fenotipo inflamatorio de bajo grado en la vasculatura [5,6]. Las ROS pueden alterar la relajación vascular dependiente del endotelio a través de una mayor degradación de NO [6]. Se puede revertir la disfunción endotelial, lo que podría retrasar o incluso prevenir la progresión de la aterosclerosis y mejorar la función arterial y reducir la incidencia de eventos cardiovasculares I5]. Estudios clínicos recientes han demostrado que las terapias no farmacológicas y farmacológicas dirigidas a la obesidad y la resistencia a la insulina mejoran la función endotelial y reducen la inflamación de bajo grado [7]. Estos hallazgos han demostrado la asociación entre obesidad, resistencia a la insulina y disfunción endotelial; por lo tanto, la reducción de la función adipocitaria patológica en la obesidad debe ser el objetivo de la prevención de enfermedades cardiovasculares. Las estrategias terapéuticas y nutricionales que disminuyen el estrés oxidativo y la inflamación en el tejido adiposo hipertrofiado pueden convertirse en un objetivo clave para prevenir la enfermedad cardiovascular [7].

Las bayas son fuentes ricas en polifenoles, como flavonoles, ácidos fenólicos y antocianinas, y los estudios epidemiológicos han informado una asociación entre un aumento en el consumo de bayas con una disminución de la obesidad y las enfermedades cardiovasculares]8]. Las bayas se conocen como antioxidantes naturales y, debido a su alto potencial antioxidante, se les conoce cada vez más como alimentos funcionales naturales [9]. Los arándanos rojos se clasifican como "superfrutas", ya que son particularmente ricos en antioxidantes como las vitaminas C, A y E (tocoferol) y polifenoles [10]. Los estudios in vitro e in vivo han indicado varios efectos beneficiosos para la salud de los arándanos rojos, como actividades antiinflamatorias [11], antioxidantes [11] y antiproliferativas [8,9]. Además, se ha demostrado que los arándanos rojos previenen la obesidad inducida por la dieta y la inflamación de bajo grado en animales diabéticos [12]. Nuestro estudio anterior mostró el potencial antiinflamatorio del extracto acuoso de la fruta de arándano rojo liofilizado [11]. El extracto reguló la expresión génica proinflamatoria (IL-6, MCP-1 e IL-1) y antiinflamatoria (IL-10) en TNF inflamado{{20} }indujo adipocitos 3T3-L1 y suprimió la respuesta inflamatoria en macrófagos RAW 264.7 activados mediante la regulación negativa de la expresión de mediadores proinflamatorios (TNF-, IL-1, IL-6, MCP{{30 }}, iNOS, COX-2). Además, se observaron efectos antioxidantes significativos en los adipocitos inflamados tratados con el extracto de fruta de arándano rojo. La acumulación intracelular de ROS disminuyó como resultado de la expresión mejorada de enzimas de defensa antioxidantes (SOD, catalasa, GPx) y la enzima prooxidante inhibida (NADPH oxidasa 4) [11].

El presente estudio investigó la capacidad de la fracción de antocianina (ACN) y la fracción de polifenoles no antocianina (PP) del fruto del arándano rojo para prevenir y tratar la obesidad hipertrófica y la disfunción endotelial imitada en los modelos in vitro. Se analizó el efecto de las fracciones de ACN y PP en las vías moleculares del estrés oxidativo, la inflamación y la secreción desregulada de adipoquinas en adipocitos obesos hipertrofiados 3T3-L1. El potencial protector contra la disfunción endotelial se evaluó utilizando células endoteliales de vena umbilical humana inducidas por TNF-x (HUVEC).

2. Materiales y métodos

2.1.Preparación de fracciones de polifenoles antociánicos y no antociánicos

La fruta de arándano rojo (Vaccinium Vitis-idea L.) congelada obtenida de la empresa DANEX (PHU"DANEX", Wielen, Polonia) se homogeneizó en pulpa de fruta, que posteriormente se congeló a-80 grado y se sometió a liofilización. según el procedimiento descrito anteriormente[11]. El polvo de fruta se suspendió en una solución acuosa de 0,75 por ciento (v/v) de ácido acético. La proporción de sólidos (g) y extractante (mL) fue de 1:10. Después de mezclar en un mezclador de vórtice durante 30 s, la suspensión se colocó en un baño sónico (5 min, 20 grados). Nuevamente, la mezcla de extracción se agitó en un mezclador de vórtice durante 30 segundos y se dejó reposar a 20 grados.

Después de 10 min, la muestra se centrifugó a 3600 x g (10 min, 20 grados) y se recogió el sobrenadante obtenido. El extractante fresco se vertió en los sólidos restantes para iniciar la segunda etapa de extracción. El procedimiento de la segunda etapa fue el mismo que el de la primera. Los extractos de ambas etapas se combinaron y centrifugaron a 12,000xg para eliminar los pequeños residuos de frutas.

En el siguiente paso de preparación de fracciones, se realizó la eliminación de azúcares y ácidos orgánicos del extracto. La separación se realizó con el sistema de cromatografía AKTA Explorer 100 Air (GE Healthcare, Chicago, IL, EE. UU.) equipado con una columna de vidrio XK 26/20 (GE Healthcare, Chicago, IL, EE. UU. ). La columna se llenó con 40 ml de resina adsorbente macroporosa Amberlite XAD-7 HP (DuPont, Wilmington, DE, EE. UU.). Antes de la infección a la columna, la solución (50 ml del extracto obtenido en la etapa de extracción) se filtró utilizando un filtro de jeringa de tamaño de poro de 0,45-um (Millex-HV Durapore PVDF) membrana con prefiltro de fibra de vidrio (Merck Millipore, Burlington, MA, EE. UU.). Se aplicaron tres eluyentes: A—5 por ciento (v/o) de ácido fórmico, B—metanol y C—0,1 por ciento (u/o) de ácido fórmico. Las soluciones de ácido fórmico se prepararon mezclando una cantidad apropiada de ácido fórmico con agua desionizada. El caudal de eluyente se ajustó a 5 ml/min. Durante la separación, se empleó el siguiente programa cromatográfico: Equilibrado de columna: 95 por ciento A, 5 por ciento B, 3 CV (volumen de columna); inyección de muestra-50 mL del extracto; lavado de sustancias no ligadas-1:100 % C,6 CV;lavado de sustancias no ligadas-2:100 % A,1 CV;elución:20 % A,80 % B,5 CV;lavado de columna: 100 % B, 2,5 CV.

Todo el efluente de la etapa de elución que mostró la absorbancia (controlada a λ{{0}},320 y 520 nm） se evaporó a sequedad a 30 grados utilizando un evaporador rotatorio (Laborota 4003 HB control, Heidolph, Alemania). Los sólidos se disolvieron en una solución acuosa de ácido acético al 0,75 por ciento (o/o). La solución se transfirió a viales de vidrio y se congeló a -85 grados, y luego se colocó en un liofilizador Beta {{8 }}(Martin Christ, Alemania). La liofilización se llevó a cabo durante 48 h. El secado real se llevó a cabo bajo la presión de 10 Pa durante 40 h (20 h a una temperatura de almacenamiento de -15 grados y 20 h a 15 grados). El secado final se realizó a una temperatura de 22 grados durante 8 h sin control de presión. Las preparaciones sólidas se almacenaron en viales herméticamente cerrados bajo atmósfera de nitrógeno a -85 C.

El contenido sólido del vial se disolvió en la solución acuosa de ácido fórmico al 5 por ciento (o/o) y se filtró utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,45-μm (Merck Millipore). La separación de las antocianinas del resto de compuestos polifenólicos de las muestras se realizó mediante un cromatógrafo AKTA Explorer 100 Air, equipado con detector UV/VIS y una columna Agilent Zorbax SB C18 (250×21,2 mm). La separación se llevó a cabo a 20 grados. El caudal de la fase líquida fue de 21 ml/min. Se aplicaron dos eluyentes: un -5 por ciento (v/v) de ácido fórmico en agua y B-metanol. Después del equilibrio de la columna (95 por ciento A, 5 por ciento B, 3 CV) y la inyección de la muestra en un volumen de 2 ml, la separación se realizó en un gradiente complejo. El programa de gradiente fue el siguiente: 5 por ciento B-0.5 CV; 20 por ciento B-2 CV; 20 por ciento B-1.2 CV; 30 por ciento B-3. 5 CV;30 por ciento B-1.2CV;45 por ciento B-3.5 CV;45 por ciento B-1.2CV;100 por ciento B-2.5 CV;100 por ciento B-2.5 CV. El efluente con absorbancia a λ=520 nm se recogió y se denotó como una fracción de antocianina (ACN). El flujo de salida que muestra la absorbancia a 入=320 nm también se recopiló y denotó como la fracción de polifenoles sin antocianina (PP). Ambas fracciones se evaporaron, se disolvieron en una solución acuosa de ácido acético, se secaron por congelación y se almacenaron como se describe anteriormente. Todos los productos químicos utilizados para preparar las fracciones de ACN y PP se adquirieron de Sigma-Aldrich (Merck Group, Poznan, Polonia).

2.2.Identificación y cuantificación de polifenoles en fracciones ACN y PP

La composición de polifenoles de las fracciones de ACN y PP se analizó mediante el método HPLC-DAD-ESI-MS en un sistema HPLC Agilent serie 1200 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, EE. UU.) equipado con un detector de matriz de fotodiodos G1315D y acoplado en línea con un sistema MS de tiempo de vuelo Agilent 6224. Las separaciones cromatográficas se llevaron a cabo en una columna C18 de 150 × 2,1 mm, 3-μm (Advanced Chromatography Technologies, Aberdeen, Escocia). Un estudio publicado anteriormente detalla las condiciones de separación (fase móvil, programa de elución en gradiente, caudal, volumen de inyección de la muestra)[11].

Los cromatogramas de HPLC se registraron a 280, 325, 355 y 520 nm, recomendados para detectar flavan-3-oles, derivados del ácido hidroxicinámico, flavonoles y antocianinas, respectivamente.

Los compuestos de polifenoles en las fracciones de ACN y PP se cuantificaron como equivalentes de cianidina-3-O-glucósido (antocianinas), catequina ((epi)catequina y procianidinas), 4-ácido hidroxibenzoico (derivados del ácido hidroxibenzoico), ácido ferúlico (derivado del ácido ferúlico), ácido clorogénico (3-ácido O-cafeoilquínico), ácido p-cumárico (derivado del ácido cumárico), ácido trihidroxibenzoico-ácido gálico (ácido benzoico y derivados de la arbutina) y quercetina (glucósidos de quercetina) . Todas las muestras se inyectaron por triplicado a partir de soluciones de fracciones de ACN y PP preparadas de forma independiente.

Después de pasar por el detector DAD, el eluato de la columna se dirigió al sistema MS equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) operada en modo de iones positivos y de iones negativos. Un artículo publicado anteriormente presenta los parámetros ESI-MS empleados para identificar compuestos fenólicos en fracciones de ACN y PP [11]. El control del instrumento, la recopilación de datos y el análisis se lograron con el software MassHunter B.04.00 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, EE. UU.). Sigma-Aldrich suministró estándares fenólicos y otros reactivos para análisis HPLC/DAD/MS.

2.3. Cultivo y tratamiento de adipocitos 3T3-L1

Se obtuvieron células L1 de preadipocitos 3T3-de ratón de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, CL-173). Las células se cultivaron a 37 grados bajo un 5 por ciento de CO, la atmósfera en medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich, Poznan, Polonia) con 10 por ciento (o/o) de suero fetal bovino (FBS) (Gibco, Thermo Fisher Scientific Polska, Varsovia, Polonia) suplementación. Los preadipocitos 3T3-L1 fueron sometidos al proceso de diferenciación siguiendo el protocolo descrito previamente [11]. Los preadipocitos se sembraron a una densidad de 2,5 × 104 células/cm² en 12-placas de pocillos y se cultivaron hasta que alcanzaron la confluencia. Luego fueron estimulados durante 2 días por una mezcla de diferenciación que contenía 0,25 μM de dexametasona (Sigma-Aldrich, Poznan, Polonia), 3-isobutil-1-metilxantina 0,5 mM (Sigma-Aldrich, Poznan, Polonia) y 1 μM de insulina (Sigma-Aldrich, Poznan, Polonia) en DMEM con 10 por ciento de FBS. El medio se reemplazó con DMEM suplementado con FBS al 10 por ciento e insulina 1 µM. Después de 2 días, el medio de cultivo se reemplazó con DMEM con una adición de FBS al 10 % y se actualizó a intervalos de 2-días hasta el análisis en el día 12.3T3-Los adipocitos L1 se trataron durante 24 h con fracciones de ACN y PP en concentraciones de 5, 10 y 20 ug/mL.

2.4.Cultivo y Tratamiento HUVEC

Se obtuvieron células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) de ATCC (CRL{{0}}). Las HUVEC se cultivaron en F-12Kmedium (ATCC) complementado con 10 por ciento de FBS (Gibco), suplemento de crecimiento de células endoteliales de tejido neural bovino (30 ug/ml) (Sigma-Aldrich, Poznan, Polonia) y heparina ( 100ug/mL)(Sigma-Aldrich, Poznan, Polonia). Las HUVEC se sembraron a una densidad de 6 × 103 células/cm² en 24-placas de pocillos recubiertas con solución de colágeno de cola de rata (Sigma-Aldrich, Poznan, Polonia). Luego se expusieron 24-h cultivos de HUVEC durante 3 h a fracciones de ACN y PP a concentraciones de 0,1, 1 y 10 ug/mL y posteriormente se trataron con TNF- (10 ng/mL)(Sigma-Aldrich, Poznan , Polonia) durante 3 h adicionales para inducir la inflamación.

2.5. Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad de adipocitos 3T3-L1 hipertrofiados y HUVEC inducidos por TNF- -, no tratados y tratados con fracciones de ACN y PP, se analizó aplicando el MTT(3-(4,{{7 }}dimetiltiazol-2-il)-25-bromuro de difeniltetrazolio) (Sigma-Aldrich, Poznan, Polonia) siguiendo el procedimiento descrito anteriormente[13]. Las bajas concentraciones de fracciones de ACN y PP aplicadas para el tratamiento celular no afectaron el color del medio ni la lectura de absorbancia en la prueba MTT.

2.6.Determinación de la producción de ROS intracelular

La generación de ROS en adipocitos 3T3-L1 se midió mediante el ensayo de nitro azul tetrazolio (NBT) basado en el procedimiento descrito anteriormente [14]. Después de 90-min de incubación en solución de 00,2 por ciento de NBT (Sigma-Aldrich, Poznan, Polonia), las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato y se fijaron con metanol. Después de la extracción del formazán usando KOH y DMSO, se leyó la absorbancia a 620 nm (Tecan Infinite M200, Tecan Group Ltd., Männedorf, Suiza).

2.7.Medición del contenido de lípidos intracelulares

El efecto de las fracciones de PP y ACN sobre el contenido de lípidos en adipocitos hipertrofiados se determinó mediante el método de tinción Oil Red O (Sigma-Aldrich, Poznan, Polonia) descrito anteriormente [13] y mediante la medición de triglicéridos totales (TG) utilizando el kit de ensayo Adipogenesis ( Sigma-Aldrich, Poznan, Polonia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El contenido de TG intracelular se determinó mediante un ensayo enzimático. Se midió un producto colorimétrico correspondiente a los TG presentes a 570 nm. La concentración de TG se calculó en base a la curva trazada para el estándar de TG.

2.8.Extracción de ARN y análisis de PCR en tiempo real

Los adipocitos 3T3-L1 y HUVEC se trataron con TRI-Reagent (Sigma-Aldrich, Poznan, Polonia) para el aislamiento de ARN total. La síntesis de cDNA de primera cadena se realizó con 1 ug de RNA total usando un Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Polonia) basado en las instrucciones del fabricante. La cuantificación de la expresión génica se realizó mediante un sistema de PCR en tiempo real (SmartCycler DX real-time PCR System Cepheid, Sunnyvale, CA, EE. UU.). cebadores inversos (5 μM/1 μL) y SYBR⑧ Select Master Mix (12,5 μL) (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.). Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla S1. Las condiciones del ciclo de PCR incluyeron una desnaturalización inicial a 94 grados para 10 min, seguido de 40 ciclos de PCR: 40 segundos a 95 grados, 30 segundos a 59 grados C y 30 segundos a 72 grados. La expresión génica relativa se calculó mediante el método 2-△ACT. Los niveles de transcripción se normalizaron a -actina para adipocitos 3T3-L1 y GAPDH para HUVEC. La expresión de ARNm relativa se expresó como cambio de veces en comparación con las células de control (no tratadas). Todas las reacciones se realizaron por triplicado.

2.9.Determinación de la Producción de Adipoquinas

Las concentraciones de leptina y adiponectina se midieron con kits ELISA (Sigma-Aldrich, Poznan, Polonia) siguiendo los protocolos del fabricante. La cuantificación se realizó utilizando la calibración de estándares. Cada estándar y muestra se analizó por triplicado. Los coeficientes de variabilidad interensayo e intraensayo se calcularon respectivamente en 12,5 por ciento y 9,3 por ciento para leptina y 11,2 por ciento y 7,9 por ciento para adiponectina.

2.10.Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando el software STATISTICA versión 13.3 (Stat-soft, Inc., Tulsa, OK, EE. UU.). Se aplicó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y la prueba post hoc de Tukey para estimar las diferencias entre los valores medios de múltiples grupos. La prueba de Levene verificó el supuesto de igualdad de varianzas. La significación estadística se fijó en p<>

3. Resultados y discusión

3.1. Composición de polifenoles en las fracciones ACN y PP de arándano rojo

El estudio se centró en dos preparaciones polifenólicas separadas de la fruta de arándano rojo: la fracción ACN de antocianina y la fracción PP sin antocianina. Los perfiles de polifenoles en las fracciones de ACN y PP determinados con base en el análisis HPLC-DAD-ESI-MS se presentan en la Tabla 1. La fracción de ACN constaba de tres compuestos principales de antocianina, contenidos en el extracto de fruta de arándano rojo[11], que son derivados a base de cianidina, incluyendo 3-O-galactósido (82,5 por ciento),3-O-arabinósido (13,0 por ciento) y 3-O-glucósido (4,5 por ciento) (Tabla 1A) .

Tabla 1. Los compuestos identificados en la fracción (A) de antocianina (ACN) y la fracción (B) de polifenoles no antocianina (PP) se obtuvieron de la fruta de arándano rojo.

The purity of ACN preparation was evaluated at 97.3%; among the non-anthocyanin constituents, 1-O-Benzoyl-β-glucose was identified by HPLC-ESI-MS analysis in positive ion mode (precursor ion at m/z307.079, production at m/z 185.0432). The PP fraction contained polyphenolic compounds belonging to three predominant groups: Flavan-3-ols, hydroxycinnamic acid derivatives, and flavonols, which accounted for 40.4%, 22.8%, and 31.0%, respectively. In addition, the anthocyanin compounds' residue (5.8%)was detected in the PP fraction with cyanidin-3-O-galactoside as dominant anthocyanin, cyanidin-pentoxide, and cyanidin 3-O-(6"-acetyl)-glucoside (Table 1B), trace amounts of which have been identified previously in the original lingonberry fruit extract [11]. In the PP fraction, the following polyphenols were quantified in a significant amount (>5 por ciento): procianidinas de tipo A y B, catequina,3-ácido O-cafeoilquínico, ácido ferúlico-hexósido, quercetina y sus derivados (3-O-galactósido,3-O- arabinofuranósido,3-O-ramnósido). La Tabla 1B muestra los datos del espectro de masas de todos los compuestos polifenólicos tentativamente identificados en la fracción PP de la fruta de arándano rojo.

Este artículo está extraído de Nutrients 2021, 13, 885 7