Inmunidad innata y envejecimiento específicos del sexo en tortugas de agua dulce longevas (Kinosternon Favescens: Kinosternidae)
Oct 12, 2023
Abstracto
Fondo
La desregulación progresiva del sistema inmunológico con la edad, denominada inmunosenescencia, ha sido bien estudiada en sistemas de mamíferos, pero los estudios de la función inmune en poblaciones no mamíferas silvestres y longevas son escasos. En este estudio, aprovechamos un estudio de marca-recaptura de 38-años para cuantificar las relaciones entre la edad, el sexo, la supervivencia, el rendimiento reproductivo y el sistema inmunológico innato en un reptil de larga vida, las tortugas de barro amarillas (Kinosternon favescens;Testudines; Kinosternidae).
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Métodos
Estimamos las tasas de supervivencia y mortalidad específica por edad por sexo con base en datos de marcado y recaptura de 1530 hembras adultas y 860 machos adultos durante 38 años de capturas. Analizamos la competencia bactericida (BC) y dos respuestas inmunes a glóbulos rojos extraños (hemaglutinación natural mediada por anticuerpos (NAb) y capacidad de hemólisis mediada por complemento (Lys)) en 200 adultos (102 mujeres; 98 hombres) que oscilaban entre 7 a 58 años de edad capturados en mayo de 2018 durante su salida de la brumación, y para los cuales se disponía de datos de producción reproductiva y marcaje-recaptura a largo plazo.
Resultados
Descubrimos que las mujeres son más pequeñas y viven más que los hombres en esta población, pero la tasa de mortalidad acelerada a lo largo de la edad adulta es la misma para ambos sexos. Por el contrario, los hombres exhibieron una inmunidad innata más alta que las mujeres para las tres variables inmunes que medimos. Todas las respuestas inmunes también variaron inversamente con la edad, lo que indica inmunosenescencia. Para las hembras que se reprodujeron en la temporada reproductiva anterior, la masa de huevos (y por lo tanto la masa total de puesta) aumentó con la edad. Además de la inmunosenescencia de la competencia bactericida, las hembras que produjeron puestas más pequeñas también tuvieron una menor competencia bactericida.
Conclusiones
Contrariamente al patrón general de vertebrados de respuestas inmunes más bajas en los machos que en las hembras (posiblemente reflejando los efectos supresores de los andrógenos), encontramos niveles más altos de las tres variables inmunes en los machos. Además, a diferencia de trabajos anteriores que no encontraron evidencia de inmunosenescencia en tortugas pintadas o tortugas de orejas rojas, encontramos una disminución en la competencia bactericida, la capacidad de lisis y los anticuerpos naturales con la edad en las tortugas de barro amarillo.
Palabras clave
Función inmune innata, Reptil, Senescencia, Específica por sexo, Envejecimiento
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Fondo
El envejecimiento en muchos sistemas de vertebrados se caracteriza por la senescencia del organismo: una disminución de la eficiencia y el rendimiento de los procesos fisiológicos y celulares [1] que conduce a una disminución de la supervivencia y la fertilidad específicas de la edad a medida que avanza la edad [2]. Los estudios sobre el envejecimiento en poblaciones silvestres de vertebrados a menudo se han centrado en cuantificar los cambios relacionados con la edad en la fecundidad y la mortalidad [3], pero con menor frecuencia en los mecanismos fisiológicos que pueden contribuir a dicho envejecimiento demográfico (por ejemplo, [4-6]). Uno de esos mecanismos fisiológicos candidatos es la función inmune, que desempeña un papel fundamental en la supervivencia. Se ha demostrado que la función inmune reducida afecta negativamente la supervivencia y la reproducción [6–8]. La desregulación progresiva del sistema inmunológico con la edad, denominada inmunosenescencia, ha sido bien estudiada en humanos tanto para las inmunidades innatas (cuya desregulación con la edad puede provocar inflamación crónica [9]) como para la inmunidad adquirida, donde los cambios mejor estudiados son un aumento de las células T de memoria y una disminución de las células T vírgenes a medida que avanza la edad (pero aquí también la inmunosenescencia sigue siendo enigmática [10]). Sin embargo, los cambios específicos de la edad en el sistema inmunológico de poblaciones no mamíferas silvestres de larga vida no están bien descritos en la literatura, y los estudios centrados en la inmunosenescencia de los reptiles son incluso raros (revisado en [8]). La senescencia de los organismos, que da lugar a la senescencia demográfica en las poblaciones, evolucionó en la naturaleza. Por lo tanto, los estudios sobre poblaciones naturales están bien posicionados para revelar procesos senescentes conservados evolutivamente que son posibles limitaciones de cómo ocurre el envejecimiento. Al mismo tiempo, el estudio de la senescencia demográfica y de organismos en la naturaleza proporciona contextos ecológicos realistas y revela hasta qué punto los mecanismos de envejecimiento son flexibles. En particular, los reptiles tienen muchas características que los recomiendan para estudios de los mecanismos de senescencia, incluida la inmunosenescencia. Primero, son el clado hermano de los mamíferos, que juntos forman el clado monofilético de los amniotas; La función inmune y las vías de señalización celular están altamente conservadas en los amniotas (revisado en [11]). En segundo lugar, los reptiles exhiben varios fenotipos que permiten el estudio de la senescencia en una variedad de contextos fisiológicos y morfológicos, lo que no es posible en la mayoría de las especies de mamíferos (por ejemplo, resistencia a la hipoxia, tolerancia a la congelación, veneno, armadura, tolerancia al calor, revisado en [8 ]). A excepción de las aves, los reptiles son poiquilotérmicos y muchos continúan creciendo como adultos (por ejemplo, [12] pero ver [13]) y aumentando su fecundidad a medida que avanza la edad ([14-17], revisado en [8]). Además, muchos linajes de reptiles tienen características morfológicas únicas. Ejemplos de estos últimos incluyen fenotipos protectores, como las cajas torácicas externas de las tortugas y el veneno de algunas serpientes. Análisis filogenéticos recientes de las tasas de envejecimiento de la mortalidad mostraron un fuerte apoyo a la hipótesis de que los linajes de reptiles con fenotipos protectores tenían vidas más largas y un envejecimiento más lento que los mamíferos de tamaño similar, particularmente entre las tortugas [18], (ver también [19, 20]). De hecho, entre 300 especies de tetrápodos muestreados en el medio silvestre [18], las tortugas eran únicas en el sentido de que todo el linaje se caracterizaba por especies con una mortalidad casi insignificante y una larga esperanza de vida, una sensación que se refleja en cautiverio [21]. Dado que el crecimiento (y por lo tanto la fecundidad) puede continuar durante la vida adulta, la selección contra mutaciones perjudiciales con fenotipos tardíos puede ser más fuerte en edades más avanzadas en tortugas y otros reptiles con estas características en relación con los mamíferos (como en [22]). Estos rasgos sugieren que la inmunosenescencia puede no manifestarse de la misma manera en los reptiles en comparación con otros vertebrados amniotas, como mamíferos o aves, e incluso puede estar ausente debido a presiones selectivas sobre el mantenimiento de la función inmune con una mayor reproducción (p. ej., [5]) . Aquí nos centramos en ampliar el panorama comparativo de los estudios de envejecimiento en tortugas para promover su uso como modelos de envejecimiento lento. El sistema inmunológico de las tortugas, al igual que otros amniotas, incluye componentes innatos y adquiridos (revisado en [23]), pero análisis recientes sugieren que los reptiles pueden depender más de las defensas innatas en comparación con los mamíferos y las aves [24]. Específicamente, aunque los reptiles tienen células B y T asociadas con la inmunidad adaptativa, la respuesta rápida adaptativa tradicional ante la exposición secundaria a patógenos puede depender más de la inmunidad innata [24]. Existe una creciente literatura sobre patrones de inmunidad innata asociados a la edad en reptiles ectotérmicos [4, 25-27], que proporciona una primera línea de defensa contra patógenos extraños. Al mismo tiempo, el estudio de las diferencias sexuales tanto en la senescencia de los organismos como en el envejecimiento demográfico se ha ampliado a una mejor cobertura filogenética, incluidos los reptiles [28]. Es importante destacar que estos estudios son posibles en poblaciones silvestres solo si se puede determinar la edad de los individuos con precisión, lo que requiere estudios a largo plazo para especies longevas ([29, 30], revisado en [31]). Por lo tanto, nos sumamos a esta literatura investigando aspectos de la especificidad de sexo y edad de la inmunidad innata, la supervivencia, la reproducción femenina y las relaciones entre ellos en un reptil de larga vida. Aprovechamos un estudio de marcación y recaptura de 38-años de tortugas de barro amarillas de edad conocida (Kinosternon favescens) para cuantificar las relaciones entre edad, sexo, supervivencia y rendimiento reproductivo en el sistema inmunológico innato como un enfoque integrador para comprender la inmunosenescencia. Al igual que otras tortugas, se descubrió que esta especie tiene un envejecimiento lento cuando se consideran los sexos juntos [18]. Específicamente, evaluamos tres medidas inmunes innatas (anticuerpos naturales circulantes, capacidad de lisis mediada por complemento y competencia bactericida del plasma) en nuestra población de estudio a largo plazo en Nebraska (EE. UU.). Según el paradigma existente de inmunosenescencia innata, predijimos que las medidas de inmunidad innata disminuirían con el avance de la edad, a pesar de algunas pruebas de lo contrario [5, 32].
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Resultados
En 2018 se tomaron muestras de doscientos animales para determinar variables inmunitarias (N=98 machos, N=102 hembras) y estas observaciones comprenden nuestros datos inmunitarios. De estas 102 hembras, 85 se reprodujeron en 2017 y estos constituyen nuestros datos reproductivos femeninos. Finalmente, para el análisis de la senescencia de la mortalidad en la población en su conjunto, utilizamos nuestra base de datos a largo plazo de N=2380 individuos únicos de edad conocida (N=860 hombres, N=1530 mujeres ). En nuestra muestra de individuos con datos inmunológicos (200 adultos), la edad estaba altamente correlacionada con el tamaño corporal; los animales más viejos eran más grandes tanto en masa como en longitud (p. ej., masa corporal, r=0.58, Pr.<0.0001; plastron length, r=0.60, Pr. <0.0001). Therefore body size was not included in models where age was an explanatory factor. In the immune data individuals, adult females were smaller than males and tended to be older (Table 1, Fig. S2), a result that is mirrored in the population as a whole (see Fig. 5 in [33]). Because adult females in our immune sample were significantly older than males, we z-transformed age for all analyses of innate immune function to dissociate the confound of age and sex. This allowed for a comparison of relatively old and young adult males and females.
Tabla 1 Tamaño, edad y mortalidad de las tortugas de barro amarillas
En la población en su conjunto, las mujeres tenían una mayor esperanza de vida adulta media y máxima (edades en las que habían muerto entre el 50 y el 95% de los adultos). Tanto las tortugas adultas, machos como hembras, exhibieron aumentos de moralidad relacionados con la edad, lo que indica envejecimiento. La tasa inicial de mortalidad adulta fue mayor en los hombres que en las mujeres, pero las tasas de aceleración de la mortalidad fueron equivalentes (Tabla 1, Figura 1). En nuestra submuestra inmune de individuos, las tres medidas de la función inmune innata se correlacionaron significativamente (positivamente) entre sí (hemaglutinación mediada por anticuerpos naturales, hemólisis mediada por complemento y competencia bactericida, Tabla S1). Pero debido a que las correlaciones eran débiles (todas |r|< 0.28), we analyzed each variable separately. For all three variables, batch represents the reagents used. For bactericidal competence, five individual lyophilized pellets of Escherichia coli were used to generate control plates across the experiment; as control plates decreased in their colony count, a fresh control solution was made. For natural antibodies and cell lysis capability, two separate bottles of rabbit red blood cells were used sequentially. Significant variation among E. coli pellets and individual rabbits (that generate the red blood cells) is expected, and we controlled for it here as a batch effect in our models. All three immune variables declined with advancing age (BC and Lysis, Pr< 0.05; Nabs, Pr=0.08, Table 2, Fig. 2) and were higher in males than females (Table 2, Fig. 3). For the 85 females in our data for which we had both most-recent reproductive output and immune measures, clutch size did not change with age, whereas egg mass increased with age (Tables 3, S2, Fig. 4). Because clutch size did not change with age, a third measure of reproductive effort, total clutch mass followed the identical trend as egg mass and was not considered further. Interestingly, the three females greater than 50 years old had lower age-corrected egg mass (age>50 años) que las mujeres en el siguiente intervalo de edad más bajo (N=13 edad de 40 a 50 años (t=2.45, Pr.=0.014)), lo que sugiere la posibilidad de senescencia. en el rendimiento reproductivo en hembras muy ancianas (ver Fig. 4). Para estas 85 mujeres reproductivas, las mujeres mayores siguieron la misma tendencia observada para todos los adultos: competencia bactericida reducida y hemólisis mediada por complemento con la edad (Tabla 3, ver Fig. 1). Además, las hembras con nidadas más grandes, independientemente de la edad, tenían una mayor competencia bactericida que aquellas con nidadas más pequeñas (Fig. S1). A diferencia del tamaño de la nidada, no encontramos efectos de la masa de huevos sobre la función inmune (datos no mostrados).
Discusión
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Mortalidad y senescencia reproductiva.
Las hembras de las tortugas de barro amarillas viven más que los machos en esta población; sin embargo, envejecen a tasas similares (Fig. 1) y la mortalidad específica por edad aumenta con la edad en ambos sexos (Fig. 1), aunque lentamente. Estos datos demuestran una lenta senescencia de la mortalidad en esta especie, pero no encontramos evidencia de senescencia reproductiva en nuestras muestras de hembras. Se ha informado de una pequeña aceleración en la mortalidad específica por edad de los adultos en las tortugas en el gran estudio filogenético de los tetrápodos [18], así como en estudios individuales a largo plazo para tortugas gigantes [34] y tortugas pintadas ([35, 36], pero ver [ 37, 38] y especies de tortugas con bisagras [39]); sin embargo, en otras especies de tortugas, la mortalidad a menudo permanece constante a medida que avanza la edad adulta [40], o disminuye con la edad [3, 15, 41]. A través de poblaciones cautivas de tortugas (por ejemplo, registros de zoológicos) da Silva et al. [21] encontraron que la mayoría de las especies de tortugas exhibían disminuciones lentas o insignificantes en la mortalidad con la edad. El envejecimiento reproductivo femenino (es decir, disminuciones en la producción reproductiva específica de la edad) no se observa hasta el momento en las especies de tortugas (tortugas pintadas [30], tortugas de Blanding [15, 41], tortugas del desierto [3] y tortugas de caja [42]). . Warner y colegas [30] observaron una disminución en la supervivencia de las crías de tortugas pintadas en las tortugas pintadas hembras más viejas, a pesar de que no hubo disminución en la producción reproductiva. Además, muchos estudios reproductivos de tortugas han demostrado correlaciones positivas entre el tamaño de la nidada, el tamaño de los huevos y/o la masa de la nidada con el tamaño corporal de las tortugas ([43]; revisado [44]), donde el tamaño corporal a menudo se asocia positivamente con la edad en las tortugas. tortugas (por ejemplo, el presente estudio, [17, 32], pero ver [41]). Estos datos sugieren que la senescencia reproductiva rara vez ocurre en las tortugas, si es que ocurre.
Fig. 1 Supervivencia y mortalidad específica por edad en machos y hembras adultos de K. favescens. La esperanza de vida media (50% viva) y máxima (5% viva) es mayor en las tortugas de barro amarillas hembras adultas (líneas discontinuas negras) que en los machos adultos (líneas continuas grises). El eje Y es la supervivencia Lx para adultos, a partir de los 11 años. Las líneas que caen hasta el eje x muestran la mediana específica por sexo y la esperanza de vida máxima en edad cronológica. El recuadro muestra los modelos de Gompertz de aceleración de la mortalidad a lo largo de la edad adulta; la mortalidad adulta inicial para los machos es significativamente mayor que para las hembras (elevación de las líneas), con aumentos equivalentes (pendientes de las líneas) (Tabla 1). El eje Y es el logaritmo natural de la mortalidad específica por edad del modelo de aceleración de Gompertz ajustado.
Longevidad y envejecimiento específicos del sexo
Los estudios sobre las diferencias sexuales en la senescencia demográfica y de organismos siguen siendo raros en especies no mamíferas. Probablemente hay dos razones para esto: los informes iniciales de demografía de las poblaciones silvestres a menudo reúnen datos con suficiente poder para estimar la aceleración de la mortalidad; y en muchas especies se desconoce el sexo de los juveniles debido a la falta de genitales externos y debe depender del desarrollo de fenotipos sexuales secundarios para asignar el sexo en animales recién maduros. En una revisión de los datos de longevidad en cautiverio, da Silva y colegas [21] informaron que la esperanza de vida promedio de los machos adultos excedía la de las hembras en aproximadamente un 20%, contrariamente a nuestros resultados para las tortugas de barro amarillas. Sin embargo, el patrón parece ser una mayor longevidad en las hembras en poblaciones silvestres de tortugas (tortugas pintadas [28, 45]), tortugas manchadas [46, 47], tortugas de bosque [48], tortugas mapa [49], cotorras [50], tortugas de caja [51] y tortugas de orejas rojas [52]). Por el contrario, sólo conocemos dos estudios que han informado que las tortugas macho sobreviven a las hembras en la naturaleza (tortugas de tuza [53], pero véase [54], y una población de tortugas pintadas [36]. Se necesitan más datos, pero estos Los datos de campo contrastan con los registros en cautiverio resumidos por [21] y sugieren una posible interacción sexo-ambiente relacionada con la longevidad y el envejecimiento.
Tabla 2 Análisis de varianza de variables inmunes para tortugas de barro amarillas, machos y hembras adultos
Función inmune específica del sexo
Encontramos niveles más altos de función inmune en hombres que en mujeres, lo opuesto al patrón general en los vertebrados [55, 56], y se presume que está relacionado, al menos en parte, con la supresión del sistema inmunológico por los andrógenos [57, 58]. Muchas especies de tortugas son modelos apropiados para esta pregunta porque carecen de cromosomas sexuales y, por lo tanto, los sexos tienen una arquitectura genómica idéntica en el momento de la concepción. En cambio, tienen una determinación del sexo dependiente de la temperatura (TSD), mediante la cual el sexo está determinado por el ambiente térmico experimentado durante el período crítico del desarrollo embrionario, eliminando cualquier confusión entre los genomas específicos del sexo y el desarrollo sexual específico del sexo [59]. López-Pérez y colegas [60] no encontraron diferencias en la competencia bactericida entre machos y hembras en una especie de tortuga almizclera (otra tortuga kinosternida con TSD). Asimismo, Zimmerman y colegas [32, 61, 62] no encontraron diferencias de sexo en las medidas de inmunidad innata en las tortugas de orejas rojas (también con TSD). Por el contrario, en las tortugas pintadas [5] –otra especie con TSD–, se informó una mayor capacidad de hemólisis mediada por el complemento en los machos y mayores títulos de anticuerpos naturales en las hembras, sin que el sexo tenga efecto sobre la competencia bactericida. Además, Freedberg y sus colegas [63] descubrieron que las temperaturas de incubación frías que producían machos en otra tortuga TSD mejoraban la inmunocompetencia en los machos más que en las hembras, pero no encontraron tales efectos en un congénere estrechamente relacionado. Aunque estos datos preliminares parecen sugerir que las tortugas pueden no seguir el patrón general de los vertebrados de respuestas inmunes más bajas en los machos, claramente se necesita más investigación. Siguiendo la teoría de la ecoinmunología que postula asociaciones entre las defensas inmunes y las estrategias de la historia de vida [64, 65], esperaríamos que el sexo más longevo invirtiera más en inmunidad adquirida que en inmunidad innata [66]; Los datos limitados sobre longevidades específicas por sexo impiden una prueba exhaustiva entre especies.
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Las diferencias de comportamiento y los patrones de actividad pueden someter a las hembras de tortugas de barro amarillas a mayores presiones de infección que los machos, lo que puede suprimir la función inmune femenina [55, 56]. Nuestra especie de estudio tiene un ciclo de actividad anual inusual (ver Métodos). En nuestro sitio de estudio, los machos adultos emergen de la brumación un promedio de 5 días antes que las hembras en la primavera [Iverson y Greene, datos no publicados], permanecen activos en el agua en junio durante las incursiones prolongadas de anidación de las hembras y, en promedio, pasan a la estivación de verano. más tarde que las mujeres [67]. Por lo tanto, el período de actividad anual de esta especie es inusualmente corto: un macho típico permanece activo en el agua quizás un 25% más que una hembra típica. Sin embargo, no está claro por qué la temporada de actividad más corta de las mujeres las expondría a mayores presiones del sistema inmunológico. Además, la actividad reproductiva difiere entre machos y hembras, ya que el apareamiento y la fertilización se producen en la columna de agua, después de lo cual las hembras deben emerger del agua a la tierra para depositar sus huevos (mientras que los machos no tienen esa incursión obligatoria en la tierra) [67]. estacional (p. ej., [las concentraciones de esteroides circulantes en reptiles son altas 68, 69]) y, por lo tanto, el patrón que observamos de una mayor función inmune en los machos podría atribuirse al muestreo solo durante la emergencia de primavera, es decir, muy temprano en la temporada. La variación estacional en los andrógenos de las tortugas ha sido razonablemente bien estudiada, y los niveles circulantes de testosterona en las tortugas macho son generalmente muy bajos a principios de la primavera (revisión en [69]), mientras que alcanzan su punto máximo en la primavera en el caso de las hembras, mientras se preparan para la ovulación [69- 74]. Se sabe que la testosterona suprime la función inmune ([57], pero ver [58]) y esto podría explicar las respuestas inmunes más bajas en las mujeres en comparación con los hombres. Sin embargo, se sabe que el estradiol mejora la función inmune [23] y generalmente está elevado en las mujeres a principios de la primavera, seguido de un pico poco después en asociación con la ovulación y la oviposición ([75], revisado en [69]). Por lo tanto, según nuestro muestreo de principios de primavera, los patrones de estradiol y testosterona son explicaciones poco probables de las respuestas inmunes más bajas observadas en nuestras mujeres. Desafortunadamente, carecemos de datos sobre los niveles hormonales circulantes en las especies de nuestro estudio, pero dados los patrones generales que acabamos de describir, el impacto de los esteroides circulantes en la función inmune aún no está claro.
Fig. 2 La inmunidad innata disminuye con la edad en K. favescens adulto. La competencia bactericida A y la lisis mediada por el complemento B disminuyeron con la edad de manera similar para las tortugas de barro amarillas, machos y hembras, adultas (consulte la Tabla 2 para obtener resultados estadísticos). Los anticuerpos naturales C (NAbs) mostraron la misma tendencia. En todos los paneles, el eje Y representa los residuos de modelos lineales sin edad del modelo (Tabla 2). El eje X es una edad transformada en z con líneas insertadas para indicar la edad en años de las tortugas adultas machos y hembras. Regresiones: residuos BC=−{{10}}.138(zAge), R2=0.06; Residuos de lisis=−0,01(zAge), R2=0.02; Residuos NAbs=−0,01(zEdad), R2=0.01
Reproducción femenina y función inmune.
No encontramos evidencia de un costo inmunológico para la reproducción femenina. Ni el tamaño de la nidada (Tabla 3) ni la masa del huevo (datos no mostrados) impactaron negativamente ninguna variable inmune. De hecho, las hembras que pusieron nidadas de huevos más grandes tenían una mayor capacidad bactericida (Fig. S1). La teoría de la historia de vida predice que los individuos deben asignar recursos a rasgos como aquellos que apoyan el automantenimiento y la reproducción para maximizar la aptitud [76]. Sin embargo, la reproducción representa un costo energético significativo para las hembras y, por lo tanto, los recursos asignados a la reproducción pueden realizarse a expensas de otros rasgos [77]. Por lo tanto, se puede esperar que las mujeres que invierten mucho en la reproducción actual experimenten una compensación con la eficacia inmune actual [78]. Este equilibrio entre reproducción y función inmune se ha examinado en otros reptiles con resultados mixtos. Las culebras terrestres occidentales grávidas (Tamnophis elegans) mostraron una menor capacidad proliferativa de linfocitos T en respuesta a un mitógeno en comparación con sus congéneres no grávidas, pero no mostraron diferencias en BC entre estados reproductivos [27]. Por el contrario, las serpientes de cascabel pigmeas grávidas (Sistrurus milarius) mostraron una capacidad de BC disminuida en relación con las serpientes no grávidas [79]. Las medidas de inmunidad innata entre estados reproductivos en tortugas pintadas (Chrysemys picta) dependieron de la edad [5]. Específicamente, las hembras más jóvenes que tenían nidadas grandes exhibieron una mayor capacidad de lisis que las hembras mayores con nidadas igualmente grandes. Sin embargo, este mismo estudio encontró un aumento de BC en mujeres mayores, lo que contrasta con los hallazgos de este estudio sobre la disminución de la función inmune a medida que avanza la edad. Además, independientemente de la edad, encontramos que los tamaños de nidada más grandes se correlacionaban con una BC más alta y que no hubo ningún efecto de la reproducción sobre la producción natural de anticuerpos o la capacidad de lisis. Estos resultados sugieren que las compensaciones entre la función inmune y la reproducción probablemente sean específicas de los componentes inmunes.
Fig. 3 La inmunidad innata es significativamente mayor en machos que en hembras adultas de K. favescens. Los mínimos cuadrados retrotransformados significan ±1 SE para A) competencia bactericida (el eje y es la proporción de colonias de E. coli muertas) y B) anticuerpos naturales (el eje y es el título de dilución máximo en el que se produce la hemaglutinación de los glóbulos rojos de conejo) ) y lisis mediada por complemento (título de dilución máximo al que se produce la lisis de los glóbulos rojos de conejo). Los asteriscos representan una diferencia de sexo significativa para una medida inmune determinada. (Ver Tabla 2 para resultados estadísticos). LS significa: BC=0.37, 0.62; NAbs=4.0, 4,6; Lys=8.2, 9.0
Tabla 3 Análisis de variables inmunes y esfuerzo reproductivo para hembras reproductoras de tortuga de barro amarilla
Fig. 4 La masa del huevo, no el tamaño de la nidada, aumenta con la edad en las hembras reproductoras de K. favescens. El eje Y representa los residuos del modelo lineal en la Tabla 3 sin la edad del modelo. Residuos de masa de huevo=0.025(Edad) – 0,73, R2=0.40
Inmunosenescencia
De las variables inmunes innatas que examinamos en las tortugas de barro amarillas, encontramos evidencia de inmunosenescencia en las tres (Fig. 2; Tabla 2). Los resultados de otros estudios son mixtos. Por ejemplo, las tortugas de orejas rojas más grandes (presumiblemente más viejas) no mostraron cambios en BC en comparación con individuos más pequeños [32, 61], similar a los hallazgos de competencia bactericida en tortugas pintadas donde se conocía la edad [5]. Este último estudio también informó aumentos en la hemaglutinación en animales más viejos. Obviamente, todavía no es evidente ningún patrón de cambios relacionados con la edad en el sistema inmunológico innato de las tortugas. Entre otros reptiles no aviares, los resultados también son bastante variables (revisado en [8, 26]). Por ejemplo, en poblaciones de culebras, tanto la capacidad de hemaglutinación como de hemólisis disminuyen en las serpientes más viejas [27, 80], al igual que la respuesta inmune al mitógeno fitohemaglutinina en los lagartos de collar de Dickerson [81]. Mientras que en las pitones de agua, la hemaglutinación aumenta con la edad [82]. Será necesaria más investigación para comprender esta variación en la dirección de los cambios relacionados con la edad en la inmunidad innata en los reptiles en general, y en las tortugas en particular. Por el contrario, los datos de mamíferos y aves muestran en términos generales una disminución de la función inmune con la edad. Además, en estos taxones, la mayor parte de la inmunosenescencia observada ocurrió en el sistema inmunológico adaptativo [83-85] y se encontraron cambios menos pronunciados en la inmunidad innata (revisado en [6]), aunque aquí también los patrones no son necesariamente consistentes en todas las medidas de inmunidad innata [ 86]. Sin embargo, en los reptiles, el sistema inmunológico adaptativo responde más lentamente a los desafíos y no muestra respuestas sólidas durante la exposición repetida a patógenos (revisado en [24, 87]). Por lo tanto, la función inmune innata y los cambios relacionados con la edad en dicha función pueden ser críticos para la salud inmune general de los reptiles.
Conclusiones
Aquí hemos intentado ampliar las consideraciones comparativas de la inmunosenescencia innata y sus interacciones con la mortalidad y el envejecimiento reproductivo. Elegimos una población silvestre de tortugas (de barro amarillo) estudiada durante mucho tiempo para probar las asociaciones entre estas medidas de envejecimiento porque estudios comparativos amplios recientes han identificado que el clado de las tortugas tiene un envejecimiento excepcionalmente lento y una esperanza de vida larga. No obstante, las medidas de los mecanismos de envejecimiento requieren edades conocidas, lo que sólo se puede lograr mediante estudios a largo plazo de especies silvestres y longevas. Descubrimos que la mortalidad y la inmunidad tenían características específicas de cada sexo; las hembras vivían más tiempo y tenían una función inmune innata más baja que los machos. Este resultado es sorprendente si se tiene en cuenta la dependencia de la temperatura en la determinación del sexo, descartando así las contribuciones de los cromosomas sexuales al envejecimiento específico del sexo. Las tres medidas de inmunidad innata disminuyeron con la edad. En las hembras, la masa de las nidadas aumentó a medida que avanzaba la edad, y el rendimiento reproductivo no predijo la función inmune innata, aparte de que las hembras con nidadas más grandes tenían una mayor competencia bactericida, lo que sugiere que no hay un costo obvio del esfuerzo reproductivo para la inmunidad innata en las hembras. Este es el primer estudio que examina tres ejes del envejecimiento en las tortugas, un grupo caracterizado por un envejecimiento lento o insignificante. Estos hallazgos sobre inmunosenescencia, mortalidad y reproducción sugieren a las tortugas como un nuevo modelo para comprender los mecanismos del envejecimiento lento o, más precisamente, el estudio de los mecanismos universales de envejecimiento (como la inmunosenescencia) en un grupo monofilético caracterizado por una lenta aceleración de la mortalidad en adultos y Senescencia reproductiva insignificante.
Métodos
Muestreo de campo
El muestreo de tejido de las tortugas de barro amarillas (YMT) para este estudio se llevó a cabo el 2018 de mayo en el lago Gimlet en nuestro sitio de investigación a largo plazo en el Refugio Nacional de Vida Silvestre Crescent Lake (CLNWR), en el condado de Garden, Nebraska. , EE. UU. (41 grados 45,24′N, 102 grados 26,12′W). El complejo pantanoso del lago Gimlet es un lago arenoso poco profundo (profundidad promedio de 0,8 m) con hábitat de pantanos [88]. Los YMT exhiben determinación del sexo dependiente de la temperatura (TSD), con hembras producidas en condiciones de incubación cálidas y tanto machos como hembras producidos en condiciones más frías [59]. Se llevaron a cabo aquí estudios ecológicos de marcación, recaptura y anidación desde 1981 hasta 2018. En este sitio, los YMT generalmente pasan el invierno enterrados terrestres en colinas de arena adyacentes a humedales, emergen en abril y mayo y migran al agua, y luego la mayoría de las hembras regresan al mismos médanos anidan en junio, aunque algunos no se reproducen todos los años [67, 87]. En julio, todas las tortugas comienzan a abandonar los humedales para estivar en las colinas arenosas durante el resto del verano (ver también [89]). Durante las temporadas de campo, se construyeron cercas paralelas a la costa entre tres sitios de invernada y el lago, y se monitorearon continuamente todos los días. Durante los años (incluido 2017) en los que las cercas estuvieron colocadas durante la temporada de anidación, se tomó una radiografía de cada hembra capturada para determinar el tamaño de la nidada y se midió el ancho de cada huevo en cada radiografía. Una ecuación de regresión que relaciona el ancho medio de los rayos X de la nidada con la masa media real de huevos de un subconjunto de nidos que fueron excavados posteriormente nos permitió estimar la masa de los huevos y la masa de la nidada (ambas en g) para cada hembra grávida en 2017 (n{{24} }). Las ecuaciones para estas relaciones y ft son las siguientes: Ancho real del huevo=0.98(Ancho estimado del huevo)+1.52, R2=0.89; Masa real del huevo=0.64 (Masa estimada del huevo): 6,07, R2=0.85; y en una muestra de N=1795 huevos YMT recolectados durante varios años, el ancho del huevo se puede usar de manera confiable para estimar la masa del huevo (y por lo tanto la masa total de la nidada) Masa del huevo=0.68(Ancho del huevo) – 6.77, R2=0.85 (Iverson, datos no publicados). Esto nos permitió examinar los efectos de esas medidas de producción reproductiva sobre la inmunidad en la primavera de 2018 cuando estas 85 tortugas hembras emergieron de la brumación. Una vez capturadas, las tortugas fueron transportadas de regreso al laboratorio de campo donde se registraron datos morfométricos, incluida la longitud máxima del caparazón (CL en mm), la longitud máxima del plastrón (PL en mm) y la masa corporal (BM en g). Se recogieron hasta 0,5 ml de sangre completa del seno cervical mediante una jeringa heparinizada de calibre 26 y se centrifugaron (7000 rpm) en un criotubo durante 5 minutos para separar los componentes sanguíneos. El plasma sanguíneo se pipeteó a un criotubo separado. Tanto el plasma como los glóbulos rojos concentrados se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido hasta su transporte a la Universidad Estatal de Iowa para su almacenamiento a -80 grados. Las tortugas muestreadas (98 machos y 102 hembras) fueron transportadas de regreso a su lugar de captura inicial y liberadas en el lado opuesto de la cerca para continuar hacia el lago.
Determinación de la edad
Desde que comenzó este estudio en 1981, la edad en años en el momento de la captura inicial de cada tortuga se estimó como el número de inviernos posteriores a la eclosión. La estimación de la edad es la misma todos los años y, por lo tanto, nuestros métodos para la determinación de la edad se aplican a todos los datos aquí considerados (población y submuestra inmune). Debido a que en esta población solo se produce un anillo de escudo cada año, la edad de las tortugas inmaduras generalmente es igual al número total de anillos presentes. Sin embargo, durante años extremadamente duros, puede que no haya ningún crecimiento y dos anillos pueden parecer uno solo. Por lo tanto, los recuentos de anillos son edades mínimas y podrían subestimarse si los anillos no se cuentan y evalúan en el contexto de los patrones generales de crecimiento de la concha en toda la población. Al comparar el patrón de incrementos en el crecimiento del escudo de una tortuga juvenil no envejecida con el patrón general de crecimiento del escudo de la población, se podría determinar de manera confiable la edad en la primera captura hasta al menos 12 años. Contamos el número mínimo de anillos en las tortugas adultas capturadas en los primeros años del estudio, y se estimó la edad de todas esas tortugas si el número de anillos era inferior a 20. Sin embargo, la mayoría de las tortugas fueron marcadas inicialmente individualmente y envejecidas antes de su sexto invierno, y envejecidas posteriormente según el intervalo de recaptura real. Las hembras adultas eran significativamente mayores (y más pequeñas) que los machos en nuestras muestras (Tabla S3; prueba t no apareada, P=0. 0003, ver Fig. S2 y Fig. 5 en [33]). Por lo tanto, la edad se transformó en z dentro de cada sexo a una media de 0 con varianza unitaria. Esta variable "edad" se utilizó en todos los análisis estadísticos. Excluimos los datos de 26 juveniles sin sexo.
Análisis reproductivo
El rendimiento reproductivo (tamaño de la nidada, masa total de la nidada) aumentó con el aumento del tamaño y la edad. Por lo tanto, para los análisis que incluyeron el rendimiento reproductivo femenino junto con la edad en el modelo, utilizamos valores brutos del rendimiento reproductivo sin corregir el tamaño corporal. Todos los modelos lineales se realizaron en SAS v. 9.4 (SAS Institute, Cary, NC, EE. UU.).
Análisis de supervivencia
Las tasas de supervivencia y mortalidad específicas por edad de Kinosternon favescens adultos del oeste de Nebraska se estimaron con base en el modelo de Gompertz (Tabla 1) [18, 90, 91] que estima una probabilidad de mortalidad inicial en la edad inicial y la tasa de mortalidad acelerada a lo largo del esperanza de vida. Los modelos más complicados (por ejemplo, que incluyen un término Makeham constante para la mortalidad independiente de la edad, incluido un parámetro de desaceleración) no fueron respaldados por estos datos basados en el cambio en el AIC (calculado en el paquete BaSTA R [90]). Se aplicó el modelado de Gompertz a nuestro conjunto de datos de marcación y recaptura a largo plazo del lago Gimlet, incluidos datos de 1530 hembras individuales y 860 machos individuales. La edad de madurez promedió 11 años para ambos sexos, lo que se conoce a partir del seguimiento a largo plazo de la edad y la reproducción en esta población [88, 92, 93]. Debido a que la maduración depende del tamaño, estas estimaciones de la edad de maduración (es decir, 11 años) son estimaciones máximas (por ejemplo, ocasionalmente se puede identificar una tortuga macho a edades más tempranas). Probamos la sensibilidad del uso de una edad de maduración promedio de 10 años sin ningún efecto apreciable en las estimaciones de la esperanza de vida y la mortalidad por envejecimiento (datos no mostrados). La esperanza de vida máxima y mediana de los adultos se calculó como el número de años después de la edad de la primera reproducción hasta que se estimó que habían muerto entre el 95 y el 50% de los adultos de la cohorte sintética. Los conjuntos de datos se analizaron utilizando la función 'basta' del paquete BaSTA para R [90].
Medidas inmunes
Se informa que la capacidad natural de hemaglutinación mediada por anticuerpos y hemólisis mediada por complemento (NAbs, lisis) es la primera línea de defensa contra patógenos en vertebrados (revisada en [94]), y estas medidas de la función inmune innata se han estudiado en muchos reptiles. especies (p. ej., [4, 5, 32, 80, 82, 95]). Completamos los ensayos de NAbs y capacidad de lisis de acuerdo con el ensayo de hemólisis-hemaglutinación adaptado de [96] para su uso en tortugas pintadas [5, 97]) utilizando glóbulos rojos de conejo. Utilizamos dos frascos de glóbulos rojos de conejo (HemoStat HemoStat Laboratories, Dixon, CA, EE. UU.) para completar todos los ensayos. Analizamos todas las placas con controles positivos y negativos y muestras por duplicado. Los títulos más altos de hemaglutinación indican una mayor abundancia de anticuerpos naturales en la muestra de plasma, ya que los títulos altos son una indicación de que los anticuerpos naturales se encuentran en concentraciones altas incluso en plasma cada vez más diluido [96]. De manera similar, los títulos más altos de hemólisis indican que el plasma es capaz de lisar los glóbulos rojos incluso en concentraciones más diluidas [96]. Por lo tanto, el aumento de los niveles de anticuerpos naturales y la capacidad de lisis se asocian con una mayor función inmune. Evaluamos la competencia bactericida (BC) del plasma cuantificando su capacidad para inhibir el crecimiento de Escherichia coli utilizando nuestro protocolo publicado para tortugas pintadas [5, 97], adaptado de [98]. En el presente experimento se utilizaron cinco gránulos liofilizados de E. coli (Microbiologics, ATCC#8739), y cada nuevo gránulo se utilizó para generar una nueva solución de control a medida que avanzamos en las muestras. Una mayor competencia bactericida corresponde a una mayor función inmune. Todos los ensayos inmunológicos se realizaron en la primavera de 2019 con muestras recolectadas en la primavera de 2018.
Medida inmune: análisis estadísticos.
Las variables dependientes se analizaron mediante modelos lineales generales con variables explicativas de zAge (edad estandarizada dentro de cada sexo); Sexo (machos adultos y hembras adultas); la interacción bidireccional entre zAge y Sex; y el lote de ensayo de variables molestas (BC: N=4; NAbs y lisis: N=2) para tener en cuenta los gránulos de control (BC) o el frasco de glóbulos rojos de conejo (NAbs y lisis). La competencia bactericida se transformó en Arcsine para tener en cuenta datos proporcionales y cumplir condiciones de normalidad. NAbs y Lysis se transformaron log-10 para cumplir con las condiciones de normalidad. Todos los modelos lineales se realizaron en SAS v. 9.4 (SAS Institute, Cary, NC, EE. UU.). Los gráficos se realizaron en ggplot2 [99].
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