La interleucina -22 derivada de células T impulsa la expresión de CD155 por las células cancerosas para suprimir la función de las células NK y promover la metástasis
Oct 10, 2023
RESUMEN
Aunque las células T pueden ejercer una potente inmunidad antitumoral, un subconjunto de células T colaboradoras (Th) que producen interleucina-22 (IL-22) en tumores de mama y pulmón está relacionado con resultados desalentadores para los pacientes. Aquí, examinamos los mecanismos por los cuales estas células T contribuyen a la enfermedad. En modelos murinos de cáncer de pulmón y de mama, la eliminación constitucional y específica de células T de Il22 redujo las metástasis sin afectar el crecimiento del tumor primario. La eliminación del receptor de IL-22 en las células cancerosas disminuye la metástasis en un grado similar al observado en ratones con deficiencia de IL-22-. IL-22 indujo una alta expresión de CD155, que se unía al receptor activador CD226 en las células NK. La activación excesiva condujo a una disminución de las cantidades de CD226 y a células NK con deterioro funcional, lo que elevó la carga metastásica. La señalización de IL-22 también se asoció con la expresión de CD155 en conjuntos de datos humanos y con malos resultados en los pacientes. En conjunto, nuestros hallazgos revelan un circuito inmunosupresor activado por IL-22 derivada de células T que promueve la metástasis pulmonar.
Beneficios de la cistanche tubulosa-Antitumoral
INTRODUCCIÓN
La principal característica de la progresión neoplásica y la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer es la capacidad de las células cancerosas para diseminarse a sitios secundarios y formar metástasis.1,2 La formación de metástasis se puede prevenir mediante inmunovigilancia que incluya células asesinas naturales (NK), citotóxicas , y células T colaboradoras (Th) 1.3,4 Por el contrario, las células T reguladoras (Treg), los monocitos circulantes y la IL-17A derivada de células Th forman un microambiente inmunosupresor que permite el escape inmunológico y promueve metástasis. 4–6 Por lo tanto, es fundamental identificar las cascadas de señalización que definen la función de las células inmunitarias pro versus antitumorales.7,8 La interleucina-22 (IL-22) es una citoquina producida por Th17 y, en humanos, también por el subconjunto Th1, conocido por promover el crecimiento de células cancerosas, mejorar la migración, proteger de la apoptosis, inducir la transición epitelial a mesenquimatosa y mantener la capacidad madre de las células malignas.9–13 También promueve la carcinogénesis temprana, actuando sobre lesiones precursoras o células madre cancerosas inmaduras.14–18 Células productoras de IL-22-, principalmente células Th, pero también células T gamma delta (gd), células T asesinas naturales invariantes (iNKT) y células linfoides innatas (ILC). ), se han detectado en lesiones de cáncer primario.19–24 La IL-22 se expresa en niveles biológicamente relevantes en carcinomas de mama, colon, pulmón, gástrico y hepatocelular.9,11,12,25,26 En la mayoría de los estudios , su expresión se asocia con un mal pronóstico, un estadio más alto de la enfermedad y una progresión tumoral más rápida.13,22–24,27–29 La IL-22 actúa exclusivamente a través del receptor de IL-22 (IL{{40 }}R) compuesto por dos subunidades, IL-22RA1 e IL-10RB.30,31 La acción de la IL-22 secretada está modulada por un inhibidor, la IL{{47} } proteína de unión (IL-22BP, IL-22RA2), un homólogo de IL-22RA1, que es producida principalmente por células mieloides.32,33 En condiciones de estado estacionario, IL -22 es una citoquina homeostática esencial en las barreras epiteliales como el intestino, los pulmones y la piel.34,35 En estos sitios, la IL-22 promueve la protección, la regeneración y la reparación para mantener la integridad de la barrera,36, 37 y su ausencia exacerba la carcinogénesis inducida por inflamación.13,38 En conjunto, estos datos resaltan las funciones amplias y dependientes del contexto de la IL-22 tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. Tras la unión al receptor, la IL-22 activa las Janus quinasas Jak1 y Tyk2 para fosforilar STAT3, STAT1 o STAT5, pero la IL-22 puede iniciar otras vías posteriores, incluida la cascada de proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK). o señalización PI3K-AktmTOR, dependiendo del contexto celular.13,36,39–44 Esta diversidad de vías de señalización se refleja en la multitud de efectos fisiológicos que se han asociado con la señalización de IL-22, incluidos los descritos anteriormente. así como protección contra daños genotóxicos y la inducción de péptidos antibacterianos, moco, citocinas pro y antiinflamatorias y quimiocinas.36,38,39,45,46 Las células cancerosas inducen la producción de IL-22 de células Th en pacientes con cáncer de mama y pulmón.12,47,48 La liberación de IL-1b impulsada por el inflamasoma NLRP3 induce la producción de IL-22 a partir de células T en el tumor, y ambas IL-22+ Se pueden encontrar células Th y una firma NLRP3-IL-1b en muestras tumorales de cáncer de mama y de pulmón.48,49 Aquí, nos propusimos delinear un mecanismo por el cual IL-22 promueve Progresión del cáncer de mama y pulmón. Descubrimos que la IL-22 promueve la diseminación de metástasis al pulmón, lo que revela un circuito en el que la IL-22 media la inmunosupresión en el nicho metastásico al promover la expresión de CD155 en las células cancerosas, lo que se asocia con una disminución de la expresión de CD226. sobre las células NK y redujo la producción de interferón-g (IFNg). Los datos clínicos indican que la activación de dichas vías está relacionada con los resultados de los pacientes.
RESULTADOS
Beneficios del suplemento cistanche: aumentar la inmunidad.
IL-22 afecta a las células cancerosas diseminadas en modelos de ratón singénicos de carcinoma de pulmón y mama
To understand the impact of the IL-22-IL-22R1 signaling axis on cancer progression, we analyzed syngeneic murine models of breast and lung carcinoma. As cancer patients mostly succumb to metastatic disease, we recapitulated this with phenotypically relevant models. We implanted either 4T1 breast cancer or Line-1 lung cancer cells subcutaneously (s.c.) in the right flank of wild-type mice (WT) and mice lacking IL-22 expression (Il22 / ) (Figure 1A). IL-22 did not impact the outgrowth of the primary tumors in either model (Figures 1B and 1C). Upon reaching pre-defined termination criteria (tumor >225 mm2 o ulceración), los pulmones fueron el principal sitio metastásico en nuestro modelo, con metástasis ocasionales encontradas en otros lugares (no mostrado). Los ratones Il22/demostraron una diseminación metastásica disminuida de células Line-1 y 4T1 al pulmón en comparación con animales de tipo salvaje independientemente del tamaño del tumor primario usando diferentes métodos de detección de metástasis (Figuras 1B, 1C y S1A). También hemos observado un fenotipo metastásico similar en un modelo ortotópico de cáncer de mama, donde se implantaron células 4T1 en la almohadilla de grasa mamaria (Figura S2B). Todos los métodos utilizados de recuento macroscópico ciego, ensayos clonogénicos o histología mostraron una alta consistencia en la detección de una carga metastásica más baja en Il22/animales (Figuras 1B, 1C y S1C). Esto implica el papel fundamental de IL-22 en el proceso metastásico. A continuación, forzamos la metástasis mediante la inyección intravenosa de células cancerosas, lo que evita la necesidad de desprendimiento e invasión del tejido (Figura 1D). Las inyecciones intravenosas (iv) de ambas líneas celulares reflejaron el fenotipo en el modelo subcutáneo. De hecho, pudimos confirmar una carga metastásica más baja en ratones Il22/(Figuras 1E y 1F). Estos resultados indican un papel específico de la IL-22 en las células diseminadas en circulación. Para discernir los efectos específicos de la cepa, utilizamos un modelo de cáncer de mama E0771 (Figura 1G).50,51 La inyección intravenosa de células E0771- GFP reveló una carga metastásica disminuida en animales Il22/validados mediante citometría de flujo (Figuras 1H y S1D). De manera similar, observamos una menor carga metastásica en el hígado de ratones cuando se inyectaron células E0771-GFP por vía intraesplénica (Figura S1E). Todo el pulmón izquierdo de ratones inyectados con E0771-GFP se eliminó ópticamente siguiendo un protocolo iDISCO para cuantificar las metástasis con microscopía de lámina luminosa in situ (Figura 1I).52 Aquí, los ratones Il22/mostraron una propensión reducida a desarrollar metástasis. , mientras que el tamaño de las metástasis visualizadas no difería y no tenía un patrón específico de localización (Figura 1J). En resumen, la IL-22 actuó sobre las células cancerosas diseminadas, permitiendo la metástasis del cáncer de mama y de pulmón en el pulmón.
Las células T son la fuente relevante de IL-22 en el nicho metastásico del pulmón
Anteriormente identificamos células T CD4+ como la principal fuente de IL-22 en tumores primarios de pulmón humano y muestras de lavado broncoalveolar.12,47,48 Para delinear la fuente de IL-22 en el En los pulmones de nuestros modelos, inyectamos por vía intravenosa células E0771 en animales indicadores Foxp3mRFP Il17aGFPIl22sgBFP y cuantificamos células IL-22+ mediante citometría de flujo (Figuras 2A y S2A).53 Las poblaciones se definieron como CD4+, CD{{15 }} y células T ab doble negativas (DN) (CD4, CD8) (CD3+ gdTCR NK1.1), células T gd (CD3+ gdTCR+ NK1.1) y CD{{ 26}} células NK1.1+ y CD3 NK1.1+ (Figuras 2B y S2B). Observamos un aumento en la fracción de células T CD4+, CD8+ y células NK1.1+ que produjeron IL-22 en los pulmones de animales inyectados con tumores ( Figuras 2C, S2C y S2D). Aquí, las células T CD4+ y CD8+ constituyeron la mayoría de las células productoras de IL-22- en ratones portadores de tumores (Figura 2C). Además, identificamos que dichas células T CD4+ producían IL-22 pero no IL-17A (Figura 2D). Estas células tenían una baja expresión de CD44, lo que confirma su fenotipo de memoria de acuerdo con nuestras observaciones anteriores (Figura S2E). 48 Para explorar más a fondo estos hallazgos en todos los modelos, utilizamos tinción intracelular para evaluar la producción de IL-22 en la Línea{ {56}} modelo sc, que arrojó resultados similares excepto por una fracción disminuida de productores de IL-22 de células T CD8+ (Figuras S2F-S2I). También pudimos identificar que las células IL-22+ no coexpresaban IFNg, lo que distingue a los productores de IL-22 de ratón del subconjunto Th1 (Figura 2G).49 Además, utilizamos microscopía confocal en cortes de precisión. cortes de pulmón de animales reporteros para interrogar su distribución espacial en los pulmones de ratones inyectados con tumores. Aquí, podríamos identificar que dichos productores de IL-22 e IL-17A se localizan casi exclusivamente en los focos metastásicos (Figura 2E). Como lo demuestra la citometría de flujo, no encontramos correlación entre la producción de IL-22 e IL-17A de las células informadoras en los focos metastásicos, lo que indica que IL-22 e IL-17 De hecho, son producidos por dos subconjuntos celulares diferentes. También confirmamos que una gran parte de las células productoras de IL-22-son células T CD4+ (Figura 2E). Como estos datos indicaron un papel predominante de las células T en la producción de IL-22, generamos un ratón Il22floxCd4cre con una eliminación condicional de Il22 en todas las células T maduras (Figura 2F). Cuando se expusieron a células E0771-GFP, los ratones Il22floxCd4cre tuvieron una propensión reducida a desarrollar metástasis en el pulmón, lo que recuerda el fenotipo observado en los animales Il22 globales (Figura 2F). Sin embargo, también pudimos confirmar que la cre-recombinasa bajo el control del promotor CD4 abolió completamente la producción de IL-22 no sólo en CD4+, sino también en células T CD8+ aisladas del bazo. de ratones Il22floxCd4cre y, por lo tanto, este modelo no pudo utilizarse para identificar una fuente específica de IL-22 (Figura S2J). Para confirmar el papel de las células Th como fuente crucial de IL-22 en nuestro modelo, transferimos células T de tipo salvaje e Il22/CD4+ a animales Rag1/II22/ que posteriormente recibieron E{{ 104}} células GFP iv (Figura 2G). Aquí, pudimos confirmar que la producción de IL-22 por células T CD4+ transferidas adoptivamente es suficiente para promover metástasis pulmonares en nuestro modelo, pero se elimina cuando se usan células T CD4+ aisladas de II22/animales. (Figura 2G). Es importante destacar que las diferencias en la metástasis se vieron afectadas por el injerto de células T tras la transferencia (Figura S2K). En conclusión, identificamos las células Th como una fuente suficiente de IL-22 que provoca metástasis en el pulmón de ratones con tumores, y luego buscamos identificar la célula diana relevante.
Figura 1. La eliminación de IL-22- reduce el número de metástasis pulmonares pero no afecta el crecimiento tumoral en modelos de ratón singénicos de carcinoma de pulmón y mama.
Figura 2. Las células T son la fuente principal de IL-22 en el pulmón de ratones con tumores
La expresión de IL-22RA1 en células tumorales es indispensable para la formación de metástasis
La expresión de IL-22RA1 está restringida a células no hematopoyéticas y sirve como factor limitante para la señalización de IL-22. Para interrogar su influencia en el fenotipo metastásico, generamos una eliminación estable de Il22ra1 en células 4T1 y Line-1 (Figura 3A). De acuerdo con nuestros hallazgos anteriores, el crecimiento tumoral de las células 4T1 Il22ra1 no se vio afectado en gran medida en comparación con las células de control 4T1 (Figura 3B). Sin embargo, los ratones a los que se les inyectaron células 4T1 Il22ra1 sc o iv tuvieron menos metástasis macroscópicas y clonogénicas en el pulmón en comparación con las células 4T1 de control (Figuras 3B y 3C). Para confirmar que este efecto no depende de los clones, generamos y analizamos tres clones de Line-1 Il22ra1 y los probamos con tres clones de control, que arrojaron resultados similares (Figuras 3D y 3E). Esto confirma que las células cancerosas que expresan IL-22RA1- son el objetivo relevante de IL-22 para provocar metástasis pulmonares. Para descartar los efectos no deseados de la metodología, utilizamos IL-22BP para inhibir la señalización de IL-22. Establecimos líneas celulares 4T1 y Line-1 que secretaban constitutivamente IL-22BP (Il22ra2+) (Figura S3A). Cuando se inyectaron sc, las células Line-1 Il22ra2+ crecieron de manera comparable con el control en el sitio de implantación, como se observó previamente en los modelos Il22ra1 y los ratones Il22/, aunque las células 4T1 Il22ra2+ crecieron más lento (Figura S3B). Aquí, las células 4T1 Il22ra2+ tuvieron un número muy reducido de metástasis cuando se inyectaron sc (Figura S3B y S3C). A pesar de la mayor variabilidad, las células Line-1 Il22ra2+ también formaron menos metástasis cuando se inyectaron sc o iv (Figura S3D y S3E). Así, la neutralización de IL-22 a través de IL-22BP imitó en gran medida el fenotipo observado con células Il22ra1 e Il22/ratones, corroborando la relevancia de la citocina para el proceso metastásico.
Beneficios del suplemento cistanche: aumentar la inmunidad.
IL-22 controla el crecimiento de células tumorales durante la etapa inicial del injerto metastásico
To determine the role of IL-22 signaling during the dissemination process, we analyzed the kinetics of metastatic seeding in our models. For this, we injected 4T1-GFP cells i.v. and analyzed lungs at 12 and 48 h after injection (Figure S4A). We used confocal microscopy to quantify the numbers of GFP+ colonies (defined as cell clusters of >100 mm) y células individuales por mm2 de tejido pulmonar (Figura S4B). No pudimos detectar diferencias a las 12 h después de la inyección, lo que indica que la siembra podría no verse afectada en gran medida por IL-22 (Figuras S4C y S4D). Sin embargo, en el momento 48- h, el número de células y colonias GFP+ disminuyó en el pulmón de ratones Il22/(Figuras S4C y S4D). Esto sugirió un papel de la IL-22 en el impulso de la metástasis temprana en los pulmones. Para evaluar la tasa de proliferación, coinyectamos a los ratones 5-etinil-20 -desoxiuridina (EdU) 4 h antes de la investigación a las 12, 24, 48 h y 7 días después de la inyección del tumor (Figura S4E) . De manera similar al recuento microscópico, no detectamos diferencias en el número de células GFP+ antes de las 48 h después de la inyección (Figuras S4F-S4G). Por el contrario, pudimos detectar diferencias en la incorporación de EdU, lo que indica una mayor fracción de células en división solo el día 7 después de la inyección (Figura S4G). Por lo tanto, razonamos que las diferencias en la carga de tumores pulmonares afectados por IL-22 observadas ya a las 48 h están mediadas por un mecanismo independiente de la proliferación.
Figura 3. La expresión de IL-22RA1 en células tumorales es indispensable para la formación de metástasis
IL-22 regula la expresión de CD155 en células tumorales y, por lo tanto, promueve la metástasis
Según nuestros hallazgos de que IL-22 actúa sobre las células cancerosas IL-22ra1+ para promover la metástasis, realizamos una secuenciación masiva de ARN de células 4T1 tratadas con IL-22 para delinear mejor el mecanismo subyacente (GEO: GSE202314) (Figura 4A). Descubrimos 147 genes que estaban regulados diferencialmente. De estos, la expresión de 133 genes aumentó y 14 disminuyó con el tratamiento con IL-22 (Figuras 4B y S5A). Validamos Pvr (receptor de poliovirus, Pvr) como uno de los objetivos con mayor aumento usando qPCR (Figura S5B). Esto es notable porque CD155, el producto de Pvr, se sobreexpresa en varios cánceres y posee propiedades promotoras de tumores, incluida la metástasis.54–56 Para confirmar nuestros hallazgos, evaluamos la expresión de CD155 en 4T1 estimulado por IL-22- Line-1 y células E0771 mediante citometría de flujo (Figura 4C). Detectamos un aumento en la expresión de CD155 en todas las líneas celulares durante 72 h (Figuras 4D y 4E), pero este efecto estuvo ausente en las células que carecen de IL-22RA1 (Figura S5C). A continuación, evaluamos el impacto de IL-22 en la expresión de CD155 en células E0771-GFP de pulmones de ratones con tumores (Figura 4F). Aquí, pudimos confirmar que las células implantadas en ratones Il22/tenían una menor expresión de CD155, lo que se correlacionaba con una fracción más pequeña de células E0771-GFP detectadas mediante citometría de flujo (Figuras 4G y 4H). Para verificar el papel de CD155 en la metástasis, establecimos las líneas celulares Pvr Line-1 y 4T1 (Figuras 4I, S5D y S5G). Si bien esto tuvo poco efecto sobre su capacidad de crecer subcutáneamente (Figuras S5E y S5F), eliminó la capacidad de formar metástasis en el pulmón (Figuras 4J y S5H). Podríamos revertir este proceso mediante la expresión constitutiva de CD155 en células Pvr independientemente de la regulación inducida por IL-22-(Pvr+).
Figura 4. La señalización de IL-22 aumenta la expresión de CD155 en la superficie de las células tumorales y confiere resistencia al control de las metástasis.
En este contexto, podríamos inducir metástasis en los pulmones de ratones Il22/, destacando el vínculo entre estas dos moléculas y su papel como mediadores del proceso metastásico (Figuras 4K y S5I).
CD155 en células tumorales se asocia con una expresión disminuida de CD226 en células NK y una producción reducida de IFNg
CD155 juega un papel intrínseco en la proliferación y adhesión de células cancerosas,54–57 entre otros. No detectamos deficiencias en la proliferación de células Line-1 Pvr in vitro (datos no mostrados). Es importante destacar que CD155 tiene una función pro-metastásica celular extrínseca al unirse a los receptores inmunomoduladores CD96, CD226 o TIGIT en la superficie de las células NK y T.54–56,58,59 Para identificar los socios de unión de CD155, analizamos respuestas antitumorales en los pulmones de ratones que contienen células 4T1-luciferasa+ (4T1-Luc) (Figura 5A). Confirmamos utilizando un sistema de imágenes in vivo (IVIS) que los ratones de tipo salvaje e Il22/tenían una siembra similar de células tumorales el día 5 después de la inyección, y las diferencias en la carga tumoral aumentaron en el transcurso de dos semanas (Figuras 5B y 5C). . De hecho, el defecto en la producción de IFNg por las células NK, pero no por otros tipos de células, mostró la pérdida de mecanismos efectores humorales (Figuras 5D, 5E y S6A) y se correlacionó con una mayor carga tumoral (Figura S6B). Este efecto se encontró consistentemente en el modelo Line-1 sc (Figuras S6C a S6E). Examinadas mediante citometría de chip, 60 muestras de ratones con metástasis pulmonar 4T1- demostraron una mayor expresión de CD155 en los focos metastásicos en WT pero no en animales Il22/(Figuras 5F y S6F). Encontramos una mayor infiltración de células NK en los focos metastásicos de Il22/pero no en animales WT, lo que sugiere una mayor activación y confirma la dependencia de las células NK como células efectoras antitumorales (Figura 5F). CD226, pero no TIGIT o CD96, se expresó diferencialmente por células NK y, en menor medida, por células T CD8+ en los pulmones de animales de tipo salvaje e Il22 (Figuras 5G y S6G-S6H). CD226 es un correceptor esencial para la activación de las funciones efectoras de las células T NK y CD8. Por lo tanto, nos propusimos explorar su relevancia fisiopatológica en nuestro modelo.61–64
cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico
El bloqueo de CD226 anula el fenotipo antimetastásico de los animales con deficiencia de IL-22-
La señalización excesiva mediada por CD155- presente en el microambiente tumoral puede inducir la internalización y degradación de CD226 en las células efectoras.61,63 Para delinear el papel de la expresión excesiva de CD155 en CD226 y la posterior respuesta antitumoral, inyectamos control 4T1 y Células Pvr+ iv en ratones Il22/, y dos grupos también recibieron anticuerpo bloqueador anti-CD226 (480.1) (Figura 6A). Tanto las células Pvr+ como el bloqueo de CD226 podrían promover de manera similar la metástasis pulmonar en ratones Il22/, y estos efectos no tuvieron sinergia (Figura 6B). De manera similar a nuestras observaciones anteriores en animales de tipo salvaje, esto fue suficiente para inhibir la producción de IFNg por parte de las células NK (Figura 6C). Finalmente, detectamos una disminución en la expresión de CD226 en células NK en ratones inyectados con Pvr+-en comparación con las células de control. Esto se correlacionó con la disminución de la capacidad de estas células NK para producir IFNg (Figura 6D). Además, interrogamos el potencial del anticuerpo agonista TIGIT (IG9) para inhibir la activación de las células NK en Il22/animales y del bloqueo de CD96 (3.3) para prevenir la inhibición de la función de las células NK (Figura 6E). Ni el agonista de TIGIT ni el antagonista de CD96 alteraron el número de metástasis en comparación con Il22/animales que recibieron células control o Pvr+ 4T1, respectivamente (Figura 6F). Cuando se activa, TIGIT podría inhibir la producción de IFNg de CD8+ T pero no de las células NK (Figura 6G). Por lo tanto, un eje IL-22-CD155 desencadena una disminución de la expresión de CD226 en las células NK y las vuelve inertes en el microambiente tumoral.
La expresión de CD155 complementa la firma del gen IL-22 en pacientes con cáncer de mama y pulmón
Finalmente, evaluamos la relevancia clínica de CD155 en el contexto del eje IL-22-IL-22RA1. La expresión de CD155 por sí sola se asocia con un pronóstico desfavorable en una variedad de entidades cancerosas.54 Analizamos datos de secuenciación de ARN del adenocarcinoma de pulmón del atlas del genoma del cáncer (TCGA: LUAD, n=504) y HER2- muestras de pacientes positivas de conjuntos de datos de carcinoma de mama invasivo (TCGA: BRCA, n=110). Nos centramos en genes clave relacionados con IL-22-: IL22RA1, IL22RA2, IL10RB y PVR. Para estratificar las cohortes de pacientes, utilizamos agrupamiento aglomerativo, un método de agrupamiento no supervisado, que resultó en tres grupos principales (Figuras 7A y 7B). Esto reveló patrones distintivos de expresión genética: grupo 0 (IL22RA1hi, IL22RA2lo, IL10RBmed, PVRhi), grupo 1 (IL22RA1lo, IL22RA2hi, IL10RBhi, PVRlo) y grupo 2. (IL22RA1lo, IL22RA2lo, IL10RBlo, PVRmed) (Figura 7C). Estos grupos se distribuyeron uniformemente en estas dos cohortes (Figura 7D). Los pacientes del grupo 0 y del grupo 2 del conjunto de datos LUAD tuvieron peor supervivencia que los pacientes del grupo 1 (Figura 7E). La supervivencia de los grupos 1 y 2 no difirió en ambas cohortes (Figura 7E). Además, calculamos tiempos de supervivencia medios restringidos (RMST) para los grupos 0 y 1 para cuantificar la diferencia en el tiempo de supervivencia esperado hasta cinco años de seguimiento, lo que resultó en 361,18 días para LUAD y 93,23 días para BRCA (Figura 7F). Los grupos 0 y 1 tuvieron diferencias en la frecuencia de las etapas patológicas de la enfermedad dentro de ellos en el LUAD pero no en la cohorte BRCA (Figura 7G). Es importante destacar que estas diferencias de supervivencia entre los grupos (IL22RA1hiPVRhi) y 1 (IL22RA1loPVRlo) se deben principalmente a pacientes diagnosticados en las etapas tempranas (I y II), pero no en las avanzadas, de la enfermedad (III y IV) (Figura S7A). Para evaluar el impacto de cada gen en la supervivencia, utilizamos el modelo de riesgos proporcionales de Cox. Tanto IL22RA1 (índice de riesgo [HR]=1.23) como PVR (HR=1.28) impactan la supervivencia, mientras que IL22RA2 e IL10RB no cambiaron el riesgo en la cohorte LUAD (Figura S7B). Además, solo CD226 (p=0.06), pero no TIGIT o CD96, tendieron a influir en la supervivencia, de acuerdo con nuestros hallazgos en modelos preclínicos (Figura S7B). Utilizamos el algoritmo de deconvolución CIBERSORTx en la cohorte LUAD para evaluar si los patrones de expresión genética de nuestros grupos tienen un impacto en la infiltración de células inmunes en los pacientes.65 Curiosamente, hay un aumento en las unidades CIBERSORTx para células NK activadas en el grupo 1 en comparación con los grupos 0 y 2 en pacientes con LUAD, mientras que no hubo diferencias en las células NK en reposo o en las células T de memoria CD4+ activadas (Figura S7C) con una tendencia similar en la cohorte BRCA (Figura S7D). En conjunto, estos resultados de cohortes clínicas demuestran la relevancia de un vínculo regulador entre la IL-22 derivada de células T y CD155.
Figura 5. La expresión de CD226 es mayor en células NK en ratones Il22–/–
DISCUSIÓN
En este estudio, descubrimos un mecanismo por el cual las células T producen IL-22 para promover la metástasis pulmonar en modelos murinos de cáncer de pulmón y de mama. Mecánicamente, las células T en los focos metastásicos en el pulmón, predominantemente CD4+, producen IL-22 que envía señales directamente a través de su receptor expresado en células cancerosas, promoviendo la expresión de la molécula prometastásica CD155.{{ 5}},58,59 A pesar de la bien estudiada expresión pancancerosa de CD155 y sus funciones intrínsecas y extrínsecas en la progresión del cáncer,54 la vía responsable de la regulación de CD155 en células malignas sigue siendo difícil de alcanzar.66–68 Demostramos que la IL{{ 15}} aumentó la expresión de CD155 en líneas celulares de cáncer de pulmón y mama in vitro e in vivo, mientras que su expresión constitutiva permitió metástasis en ratones Il22/, en comparación con células control y deficientes. El aumento de la expresión de CD155 en el microambiente del pulmón tumoral condujo a una reducción de la molécula coestimuladora CD226 en las células NK, lo que disminuyó su localización en metástasis y la producción de IFNg, lo que se correlacionó con una mayor carga tumoral. En nuestros estudios anteriores, detectamos una acumulación de células T productoras de IL-22-en muestras tumorales de pacientes con carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).12,48 Hemos demostrado que las células cancerosas desencadenan NLRP3- secreción dependiente de IL-1b que induce dicha producción de IL-22 principalmente a partir de células Th.18 Vale la pena señalar que, en humanos, debido a las diferencias en los perfiles de citoquinas de las células Th, IL{{ 31}} también se induce en las células Th1. Es posible que esto pueda perjudicar la respuesta inmune antitumoral. Es importante destacar que tales variantes Th1 podrían explicar parcialmente la hiperprogresión del cáncer tras la activación de las células T después del bloqueo del punto de control.69 De acuerdo con nuestras observaciones anteriores, confirmamos la acumulación de CD-22-productoras de IL4+ y CD{{38} } células T, pero también células NK1.1+, en el nicho metastásico en el pulmón de animales inyectados con tumores. Es importante señalar que observamos diferencias específicas de cepa en la acumulación de células T CD8+ productoras de IL-22-en todos nuestros modelos. Sin embargo, la abolición de la producción de IL-22 en células T maduras totales fue suficiente para recapitular el efecto que observamos en animales con deficiencia de IL-22-70. Además, la transferencia adoptiva de células T CD4+ a Los ratones Rag/II22/fue suficiente para inducir metástasis pulmonares, señalando el papel primordial de las células Th como fuente de IL-22. Por el contrario, nuestros hallazgos anteriores sugieren que a pesar de una acumulación de células T CD8+ en muestras tumorales, su contribución al conjunto de IL-22 es menor.48 En cualquier caso, la caracterización de dichas CD{{53 }} Las células T productoras de IL-22- son esenciales para evaluar cuidadosamente sus propiedades pro o antitumorales a medida que surgen nuevos datos sobre esta subpoblación.71,72 Además, el papel principal de las células NK y NKT en el control de tumores supera su contribución potencial a la formación de metástasis a través de IL-22, que se detecta en un experimento de transferencia adoptiva de Rag/II22/utilizando animales desprovistos de células T maduras pero que tienen células NK funcionales.37 Esta hipótesis está respaldada aún más por nuestros hallazgos en el estudio metastásico focos donde las células NK se encontraron más abundantemente que las células T citotóxicas, lo que destaca a las células NK como actores esenciales en el control de tumores en ausencia de IL-22. Es importante señalar que nos centramos en los productores de IL-22 en focos metastásicos en el pulmón, pero no consideramos su origen, clonalidad o su distribución en la sangre o en los órganos linfoides. Además, diversas fuentes de IL-22 promueven la progresión tumoral de una manera dependiente del contexto mediada por la acción pleiotrópica de esta citocina. En este sentido, células productoras de IL-22- similares en varios compartimentos (pulmón, bazo, ganglio linfático) podrían afectar de manera diferencial los fenotipos protumorales o no tener ninguna función según el contexto, lo que deberá investigarse más a fondo. Los estudios sobre el cáncer informan repetidamente que la IL-22 afecta el desarrollo y el crecimiento de los tumores primarios y, eventualmente, la progresión neoplásica.26,73–76 Esta noción se justifica principalmente por la capacidad de promover la migración, la invasión y la formación de células cancerosas. in vitro y así promover la formación de metástasis.76,77 Es importante destacar que la ablación de IL-22 puede aliviar el microambiente inmunosupresor en un modelo de carcinoma de pulmón con mutación Kras.14 En el estudio actual, demostramos que el aumento de la carga metastásica era un efecto directo de IL-22 sobre las células tumorales IL-22RA1+ diseminadas, lo que resultó en un mayor crecimiento de colonias. Es importante destacar que nuestros datos no descartan formalmente un impacto en las células no tumorales. Como tal, Giannou et al.78 destacan ampliamente la influencia del IL-22 en la diseminación de células tumorales a través de la acción intrínseca del IL-22R expresado endógenamente.
Figura 6. La señalización de CD226 es indispensable para la producción de IFNg a partir de células NK
Demostramos que Pvr es uno de los genes con mayor expresión en las células cancerosas tras el tratamiento con IL-22. En este contexto, las células deficientes en CD155- formaron pocas metástasis, tanto en ratones de tipo salvaje como en Il22/y, lo que es más importante, la reintroducción de CD155 nos permitió reconstituir el fenotipo metastásico. El papel intrínseco de CD155 en las células cancerosas ha sido bien estudiado y se sabe que afecta la siembra, la proliferación y la migración de las células tumorales.56,57 Sin embargo, las células Pvr no mostraron proliferación o migración inhibidas en nuestras manos, y la siembra de células tumorales no se vio afectado en ratones Il22/. Inicialmente identificado en las células presentadoras de antígenos, CD155 actúa como un promotor extrínseco de la progresión tumoral que suprime la función de las células NK y T al unirse a CD96 y TIGIT en su superficie e induce la internalización y regulación negativa de CD226.56,61–64,79–85Debido Además de su función inmunosupresora, CD155 en células cancerosas y huésped ejerce propiedades prometastásicas y se propone como objetivo para el bloqueo de la inhibición de puntos de control.61,86 Las células NK reciben una señal coestimuladora de las células presentadoras de antígenos a través de CD226. 87 Sin embargo, la estimulación excesiva de CD226 en el microambiente tumoral conduce a la internalización y degradación.63 Esto generalmente es contrarrestado por CD96 y TIGIT, que se unen a CD155 con mayor afinidad.58 Curiosamente, se sabe que las células 4T1 inducen una regulación negativa de CD226 en células infiltrantes de tumores. linfocitos y suprime la producción de IFNg.88 Aquí, demostramos que la deficiencia de IL-22 preservaba la expresión de CD226 en las células T NK y CD8+. Sin embargo, sólo las células NK tenían capacidades de producción de IFNg dramáticamente mayores y se correlacionaban inversamente con la carga metastásica. Curiosamente, la activación de la señalización TIGIT en nuestro estudio inhibió la producción de IFNg de las células CD8+ T, pero no de las NK, y no fue suficiente para aumentar la carga metastásica. De manera similar, otro receptor para CD155, CD96, no estaba regulado diferencialmente en ratones Il22/ni su inhibición previno la metástasis, lo que indica que CD155 no suprime las células NK a través de CD96 en nuestro modelo. Esto destaca la regulación específica del tipo celular de las respuestas antitumorales por parte de CD155 y sus diversos socios de unión.
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El impacto de CD155 en el pronóstico y su papel en la patogénesis del cáncer de pulmón, mama, colon y otros tipos está establecido.79–85 Existe una amplia evidencia sobre la relevancia pronóstica de la IL-22 y sus genes relacionados. en diversas entidades cancerosas.10,21,27,75,89–91 Sin embargo, algunos estudios no informan que la expresión de IL-22 influye en la supervivencia.12 Si bien estas discrepancias podrían deberse a la heterogeneidad en poblaciones de pacientes, muestreo y cuestiones de presentación de informes, muchos de estos estudios se centran en un solo gen relacionado con la señalización de IL-22. Aquí, utilizamos agrupación aglomerativa para discernir patrones de expresión de IL22RA1, IL22RA2, IL10RB y PVR en cohortes LUAD y BRCA en TCGA y afiliarlos con los datos clínicos. Aquí, identificamos tres patrones de expresión de estos genes: patrón 0 (IL22RA1hi, IL22RA2lo, PVRhi), patrón 1 (IL22RA1lo, IL22RA2hi, PVRlo) y patrón 2 (IL22RA1lo, IL22RA2lo, PVRmed). Identificamos que la alta expresión de IL22RA1 coincidió con una alta expresión de PVR, lo que también se tradujo en malos resultados de supervivencia general, particularmente en pacientes diagnosticados con estadios patológicos tempranos (I y II), pero no avanzados (III y IV), destacando el papel específico de cada etapa de este mecanismo. Por el contrario, la alta expresión de IL22RA2, también conocida como IL-22BP, se correlacionó con una menor expresión de PVR y una mejor supervivencia.18,34 El tercer patrón correspondió a una expresión totalmente baja y representó tumores inmunológicamente fríos.92 En esta línea , la deconvolución de CIBERSORTx indicó que el grupo 1 caracterizado por una alta expresión de IL22RA2 presenta una firma genética para las células NK activadas, pero no en reposo, en comparación con otros grupos. Se ha demostrado que la expresión de CD226 estratifica a los pacientes para el resultado en varios ensayos clínicos de NSCLC.93 Sin embargo, debido a la forma dual de regulación pre y postraduccional de CD226, la expresión no siempre se refleja en los datos de secuenciación de ARNm.94 Por lo tanto, los estudios que se centran sobre la regulación postraduccional de CD226 se evalúa su expresión en muestras clínicas mediante tinción de anticuerpos.63 Sin embargo, al interrogar el conjunto de datos TCGA sobre la relación de las parejas de unión de CD155 con la supervivencia, solo CD226 tendió a mejorar el pronóstico (log (HR) {{57 }}.24, p=0.06), mientras que TIGIT y CD96 no demostraron correlación con la supervivencia. Es importante destacar que las células tumorales diseñadas para secretar IL-22BP formaron menos metástasis, lo que destaca el potencial de la vía IL-22 para una intervención terapéutica dirigida. Esto podría contrarrestar la sobreexpresión de CD155 en el tumor, cuyo objetivo directo sigue siendo un desafío debido a una red compleja de correceptores. Es de destacar que se desconocen los efectos a largo plazo de la neutralización de IL-22 sobre la metástasis, pero podrían tener un impacto directo en la consideración terapéutica de las células T o proporcionar la justificación para la neutralización de IL-22 usando anticuerpos con una perfil de seguridad beneficioso, como Fezakinumab (ensayo NCT01941537) o IL-22 diseñado con diseño basado en estructura.39,95 En resumen, identificamos la sobreexpresión de CD155 inducida por IL-22-en las células tumorales como un mecanismo que beneficia el crecimiento metastásico. Este papel esencial en el pronóstico destacó el potencial de la IL-22 como diana terapéutica en el cáncer. Hasta el momento, la neutralización de IL-22 se propone principalmente como una estrategia para tratar enfermedades autoinmunes.31,49 Nuestros datos sobre IL-22BP como neutralizador de IL-22, que fenocopiaron la La deficiencia global de IL-22 apuntaló el potencial terapéutico para apuntar al eje IL-22-IL-22R1 y debe explorarse más a fondo en estudios preclínicos y clínicos.
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