La glicoproteína E truncada del virus varicela-zoster es un inmunógeno ideal para el diseño de vacunas basadas en Escherichia coli

El virus varicela-zoster (VZV) es un agente altamente infeccioso responsable tanto de la varicela como de la enfermedad por herpes zóster. A pesar de la alta eficacia, persisten preocupaciones sobre la seguridad y la accesibilidad de las vacunas autorizadas. En este caso, intentamos producir un inmunógeno gE de VZV utilizando un sistema de expresión de E. coli. Descubrimos que la expresión soluble y el rendimiento de la proteína gE podrían mejorarse mediante truncamientos C-terminales de la proteína, facilitando así un proceso de purificación sólido y escalable para la fabricación de vacunas. El gE truncado principal (aa 31-358), en lo sucesivo denominado tgE, era un monómero homogéneo en solución y mostró una antigenicidad excelente. Finalmente, evaluamos y comparamos la inmunogenicidad de tgE con la vacuna comercial LAV de vodka y Shingrix. Descubrimos que la tgE con adyuvante de aluminio era inmunogénica en comparación con el vodka LAV. Cuando se adyuvó con AS01B, una inmunización de dos dosis de tgE mostró una potencia comparable o mejor en respuestas de anticuerpos e inmunidad mediada por células que las de la vacuna Shingrix en la misma dosis, especialmente en términos de la proporción de IFN- -que expresa Células T CD4+. En conclusión, este método de expresión de tgE mediada por E. coli ofrece una estrategia rentable y escalable para generar un inmunógeno de gE de VZV ideal para el desarrollo de vacunas contra la varicela y el zóster.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

virus varicela-zóster, glicoproteína E, Escherichia coli, vacuna

INTRODUCCIÓN

El virus varicela-zóster (VZV) es un herpesvirus alfa humano patógeno que induce dos categorías principales de enfermedad: infección primaria por varicela, una enfermedad altamente contagiosa caracterizada por una erupción en la piel similar a una ampolla y síntomas sistémicos leves como fiebre y malestar. predominantemente en niños; y herpes zóster (HZ), la reactivación latente del virus en respuesta a un sistema inmunológico celular debilitado causado por el envejecimiento que causa una erupción vesicular (HZ) dolorosa y localizada con o sin varias otras complicaciones (Cohen, 2013; Heininger y Seward, 2006; Zerboni et al., 2014). Tanto la varicela como el HZ se pueden prevenir con vacunas de virus vivos atenuados (LAV). El primer LAV para la prevención de la varicela fue desarrollado por Takahashi et al. (1974) basado en la cepa del virus vOka y posteriormente obtuvo la licencia como Varivax para uso rutinario en los Estados Unidos. A esto le siguió el desarrollo y la concesión de la licencia de Zostavax para la prevención del HZ (Tseng et al., 2011). Desafortunadamente, en los 10 años transcurridos desde que comenzaron las inoculaciones con Varivax, se ha confirmado que casi 1/3 de los casos de HZ están asociados con la cepa vOka (Galea et al., 2008), lo que sugiere que vOka puede infectar y establecer una latencia, como un virus salvaje. -tipo virus y luego se reactiva para causar HZ. Además, la eficacia de Zostavax es inversamente proporcional a la edad del paciente en el momento de la administración, y una mayor edad se asocia con una menor eficacia (Oxman et al., 2005). Estudios anteriores han demostrado que la glicoproteína E (gE) del VZV es la glicoproteína viral más abundante en la envoltura del virión y en la superficie celular infectada. GE es también uno de los antígenos protectores del VZV más importantes, capaz de inducir inmunidad celular y humoral durante la infección natural por varicela, así como después de la vacunación con vOka (Arvin, 1992; Oliver et al., 2016). Recientemente, se aprobó una vacuna recombinante de la subunidad de HZ, Shingrix (HZ/su), para la prevención de HZ y la neuralgia posherpética (NPH) asociada en adultos mayores o iguales a 50 años (Shah et al., 2019; Syed, 2018). En ensayos clínicos, Shingrix indujo una inmunidad mediada por células (CMI) eficiente, específica del VZV, con una eficacia general de la vacuna del 97,2% entre participantes mayores o iguales a 50 años y una tasa de protección del 91,3% en participantes mayores o iguales a 70 años. Estos hallazgos en conjunto indican una reducción significativa del riesgo de HZ en personas vacunadas independientemente de la edad y, por lo tanto, una opción de vacuna más potente en comparación con ZOSTAVAX (Lal et al., 2015; Shah et al., 2019).

planta cistanche que aumenta el sistema inmunológico

Shingrix está diseñado a partir de un antígeno gE recombinante expresado en células de ovario de hámster chino (CHO) y un sistema adyuvante basado en liposomas (AS01B) que contiene 3-Odesacyl-4′-monofosforil lípido A (MPL) y Quillaja saponaria. Molina, fracción 21 (QS21) (Dendouga et al., 2012). Sin embargo, las células CHO recombinantes requieren un ciclo de producción largo y están asociadas a un proceso de purificación complejo que resulta en un alto costo de fabricación y un suministro limitado. Como tal, Shingrix no es una solución de vacunación ideal para un uso generalizado, particularmente en los países en desarrollo (Kim et al., 2012). Los sistemas de expresión microbiana ofrecen varias ventajas sobre los sistemas de expresión de mamíferos, incluido un crecimiento rápido, facilidad de cultivo y costos de producción más bajos (Overton, 2014) y, por lo tanto, se usan ampliamente en la expresión y producción de numerosos productos biofarmacéuticos (Adkins y Wagstaff, 1998; Monie et al., 2008; Wu et al., 2012). Sin embargo, es necesario superar varias dificultades durante la producción para la expresión exitosa de proteínas eucariotas recombinantes en sistemas procarióticos, como el plegamiento incorrecto y la falta de modificación postraduccional (Singh y Panda, 2005). A pesar de estas dificultades, los sistemas de expresión microbiana podrían ofrecer un sistema ideal para la fabricación generalizada y rentable de vacunas y, por lo tanto, justifica la investigación de antígenos de un sistema de expresión de E. coli para el diseño de vacunas contra el VZV. En trabajos anteriores, mostramos la expresión exitosa de una proteína gE recombinante (rgE) en células de insectos y obtuvimos proteínas purificadas para la inmunización de ratones y la producción de mAb (Liu et al., 2015). Sobre la base de este trabajo, aquí investigamos si la proteína gE puede expresarse en E. coli. Exploramos la expresión soluble sin fusión de antígenos candidatos de gE con un truncamiento C-terminal (en lo sucesivo denominado gE truncado (tgE) o tgE) en E. coli y caracterizamos las proteínas tgE purificadas. Mostramos que la tgE purificada es antigénica similar a la gE nativa y capaz de inducir títulos elevados de anticuerpos con actividad neutralizante de vOka en ratones. Al comparar la inmunogenicidad del antígeno tgE generado en nuestro estudio con LAV y Shingrix, encontramos que nuestro antígeno no solo exhibe una respuesta humoral eficiente sino que también induce una CMI específica del antígeno. En general, nuestra estrategia de E. coli para la producción de proteína tgE puede allanar el camino para un inmunógeno alternativo producido industrialmente para la vacunación contra la varicela y el HZ.

Beneficios de cistanche para hombres: fortalece el sistema inmunológico.

Haga clic aquí para ver los productos Cistanche Enhance Immunity

【Pregunte por más】 Correo electrónico:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

RESULTADOS

Expresión y purificación de tgE recombinante en E. coli.

Se prepararon secuencias de ADN que codifican el dominio extracelular gE de VZV como construcciones con varios truncamientos N o C terminales y se clonaron en el vector pTO-T7 para la expresión de proteínas en E. coli. El dominio extracelular completo de gE tendía a formar cuerpos de inclusión en E. coli durante la expresión, y esto podría mejorarse con un truncamiento C-terminal. De las diversas proteínas truncadas, la mejor solubilidad se logró con la construcción gE (aa 31–358) (Figura 1A), en adelante denominada gE o tgE truncada. La tgE candidata se expresó con éxito como una proteína recombinante soluble y se purificó a partir del sobrenadante de lisados ​​de bacterias mediante cromatografía de tres pasos a escala de laboratorio para su posterior evaluación y desarrollo como posible vacuna. Se utilizó cromatografía de intercambio aniónico fuerte para la captura seguida de pasos de cromatografía hidrófoba y hidroxiapatita cerámica (Figura 1B). Las etapas sucesivas del proceso de purificación vieron un aumento en la pureza de tgE en SDS-PAGE (Figura 1C). tgE migró como una banda de aproximadamente 40 kD y mostró buena reactividad con el anticuerpo específico 1B11 (Figura 1D). El rendimiento global fue de aproximadamente 500 ug de tgE purificada por gramo de bacteria.

Caracterización del gE truncado.

Se utilizaron cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento (HPSEC) y ultracentrifugación analítica (AUC) para analizar la homogeneidad y los coeficientes de sedimentación de las proteínas purificadas. Como control se utilizó la proteína rgE purificada del sistema de células de insecto (Liu et al., 2015). En HPSEC, la tgE apareció como un pico agudo en el tiempo de retención predominante de 16,1 min (Figura 2A), lo que refleja una alta homogeneidad para las proteínas tgE purificadas. En los experimentos de AUC, se observó un pico de sedimentación predominante a ~2,3 S (Figura 2B), lo que equivale a ~39,4 kD, lo que indica que la tgE se presenta como un monómero en solución. Se utilizó calorimetría diferencial de barrido (DSC) para probar la estabilidad térmica de la proteína tgE mediante el seguimiento de la capacidad calorífica durante el proceso de despliegue térmico. Los perfiles de DSC mostraron solo una transición térmica durante el desarrollo de la proteína a un valor de temperatura de transición (Tm) de 63,80 grados para tgE, comparable al de rgE (63,64 grados) (Figura 2C). Para investigar la integridad conformacional de las proteínas tgE purificadas, analizamos la antigenicidad de tgE utilizando un ensayo ELISA, con proteínas rgE purificadas expresadas en células de insecto que sirven como controles. En la prueba ELISA se utilizaron nueve mAb que podían reconocer epítopos conformacionales (mAb 1B11, 4G4, 14G1) o epítopos lineales (4A2, 11B11, 11B12, 6H6, 10H6, 11E3) (Figura 3). Encontramos valores de concentración efectiva media (EC50, ng mL-1) similares para las proteínas tgE y rgE para la mayoría de los anticuerpos, excepto para 1B11, que tenía una reactividad casi 10-veces menor, lo que sugiere su antigenicidad similar. Estos resultados sugieren que los epítopos clave de la rgE están bien conservados en la proteína tgE.

Figura 1 (Color online) Expresión y purificación de las proteínas. Una representación esquemática del diseño de construcción tgE. Las células de E. coli se transformaron con plásmidos recombinantes que portaban el gen truncado gE (aa 31–358). B, representación esquemática del proceso de purificación de tgE. La tgE se purificó a partir del sobrenadante lisado mediante cromatografía de tres pasos. C, perfil SDS-PAGE de tgE durante el proceso de purificación. El peso molecular de tgE es de aproximadamente 40 kD. M: marcador de peso molecular. Carril 1: sobrenadante separado del lisado celular; carril 2: fracción que contiene tgE del cromatógrafo Q-FF; carril 3: fracción que contiene tgE del cromatógrafo CHT; carril 4: fracción procedente del cromatógrafo de Butilo, que contiene la proteína tgE con alta pureza. D, Inmunotransferencia de la tgE purificada.

Análisis de respuestas inmunes inducidas por tgE en ratones.

Para comparar la inmunogenicidad de tgE con rgE, formulamos las proteínas con dos adyuvantes comúnmente utilizados en trabajos de investigación: adyuvante a base de aluminio Al-001 y adyuvante de Freund. Los ratones fueron inmunizados tres veces en las semanas 0, 2 y 4 con una dosis de 1 ug tanto para tgE como para rgE con adyuvante. Se utilizaron títulos de anticuerpos específicos de gE y respuestas de células T en la semana 5 después de la primera inmunización para determinar la inmunogenicidad de diferentes formulaciones de adyuvantes. Los ratones inmunizados con la vacuna tgE formulada con Al-001 mostraron perfiles de anticuerpos similares a los ratones del grupo rgE, y el adyuvante de Freund mostró un mejor efecto de estimulación cuando se formuló con tgE que con rgE (Figura 4A). Los títulos de neutralización no mostraron diferencias en los ratones inmunizados con la vacuna tgE o rgE, con títulos de neutralización de ~103 para la tgE formulada con los diferentes adyuvantes (Figura 4B). Sin embargo, en el análisis de células T CD4+ de esplenocitos mediante tinción con citoquinas intracelulares (ICS), tanto las vacunas tgE como rgE provocaron niveles similares de IFN-específico de gE en comparación con el grupo de solución salina (Figura 4C, ~{ {22}}.1% para los grupos de vacunas o el grupo de solución salina), y solo una simulación moderada de IL específica de gE{{20}} (Figura 4D, ~0,2% para los grupos de vacunas frente a ~0,1 % para el grupo salino). En conjunto, estos resultados muestran que tgE/Al-001 y el adyuvante de tgE/Freund provocan respuestas inmunitarias específicas de gE comparables a las provocadas por rgE, con una respuesta humoral particularmente fuerte.

Evaluación de la vacuna candidata tgE contra la varicela en comparación con LAV

A continuación, evaluamos la producción de anticuerpos y la persistencia de proteínas tgE adyuvadas con aluminio en ratones BALB/c. Se inmunizaron dos grupos de ratones (n=5 por grupo) tres veces en las semanas 0, 2 y 4 con diferentes dosis de 0.5 ug y 5 ug de tgE/Al{{ 8}} (Figura 5A y B). Los perfiles de respuesta de anticuerpos mostraron que la inoculación primaria de la proteína tgE provocó títulos elevados de anticuerpos, con un aumento sostenido después de las dos inmunizaciones de refuerzo en las semanas 2 y 4, y alcanzando un nivel máximo en la semana 6 antes de caer lentamente a más de 1{{ 20}}4 durante el período de seguimiento. Los diferentes grupos de dosificación compartieron perfiles de títulos de anticuerpos similares durante el período de seguimiento, con títulos neutralizantes altos similares en la semana 6. La inmunogenicidad de la tgE se evaluó y se comparó con la del vodka. La dosis medio efectiva (DE50) en ratones se utilizó como medida de seroconversión, siendo una ED50 más baja indicativa de una mejor inmunogenicidad. Los ratones Balb/c se separaron en grupos y se inmunizaron por vía intraperitoneal con tgE con adyuvante de aluminio (1, 0.5, 0.25, {{50}}.125, {{ 54}}.0625, o 0.03125 ug; n{{30}}) o vacuna vOka (1,000, 500, 250, 125 o 62,5 ufp; n=6) en diluciones en serie. Los sueros se recogieron después de 4 semanas y se analizaron mediante ELISA. La seroconversión se analizó según el método de Reed y Muench (Figura 5C). En los grupos de edad, los ratones tuvieron tasas de seroconversión del 83%, 100%, 100%, 100%, 50% y 17% para dosis de 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 y 0,03125 ug, respectivamente. En los grupos de vodka, los ratones tuvieron tasas de seroconversión más bajas del 67 %, 50 %, 33 %, 17 % y 0 % para dosis de 1, 000, 500, 250, 125 o 62,5 pfu, respectivamente. Los valores de DE50 fueron 0,063 ug para tgE y 449,425 ufp para vOka, lo que indica que la inmunogenicidad de tgE en una dosis más baja de 0,3 ug fue equivalente a la lograda con una dosis única de vacuna contra la varicela que contiene vOka (generalmente más de 2,{{78} } ufp por dosis).

Figura 2 Caracterización de las proteínas tgE y rgE. A, perfiles HPSEC de la tgE purificada. Se indica el tiempo de retención de gE. B, Análisis de la velocidad de sedimentación de la proteína tgE purificada. El coeficiente de sedimentación y el peso molecular de tgE se determinaron mediante los métodos c(s) y c(M) de forma independiente. En (A) y (B), tgE se muestra en negro y rojo en azul. C, perfiles de calorimetría de barrido diferencial de las proteínas tgE y rgE purificadas.

Figura 3 Reactividades de tgE y rgE con mAbs. Los mAb se diluyeron en serie y se hicieron reaccionar con proteínas tgE o rgE recubiertas en un ensayo ELISA. Las reacciones se detectaron utilizando anticuerpos anti-ratón marcados con HRP. Se midieron pocillos duplicados en la misma placa para cada dilución. Los valores de EC50 se calcularon mediante ajuste de tendencia sigmoidea utilizando el software GraphPad Prism.

Figura 4 Inmunogenicidad de tgE y rgE probada en ratones BALB/c 1 semana después de la inmunización con tres dosis. A, Producción de anticuerpos en ratones para tgE y rgE formulados con diferentes adyuvantes. B, Títulos de anticuerpos neutralizantes en ratones para tgE y rgE formulados con diferentes adyuvantes. C y D, Evaluaciones de respuestas de IFN- e IL-2 específicas de gE inducidas por vacunas tgE o rgE.

Figura 5 Pruebas de inmunogenicidad de la vacuna tgE formulada con aluminio en ratones BALB/c. A y B, persistencia de anticuerpos y respuesta de anticuerpos neutralizantes de tgE/Al-001. Los títulos se controlaron durante hasta 16 semanas. C, DE50 en ratones para tgE y vodka formulados con aluminio.

Evaluación de la vacuna candidata tgE Zoster en comparación con Shingrix

Para comparar la inmunogenicidad de nuestra vacuna tgE con Shingrix, se formuló proteína tgE liofilizada con el adyuvante Shingrix, AS01B. Se inmunizaron ratones C57BL/6 con dos dosis de tgE/AS01B o Shingrix por vía intramuscular en el músculo tibial en las semanas 0 y 4. Los niveles de anticuerpos después de la primera inmunización sugirieron que la inmunización con Shingrix fue suficiente para inducir altos niveles de anticuerpos anti-gE. significativamente superiores a los producidos por tgE/AS01B; Sin embargo, después de la segunda inmunización, no hubo diferencias significativas en la producción de anticuerpos entre los dos grupos (Figura 6A). En cuanto a los niveles de anticuerpos neutralizantes, una inmunización de dosis única de tgE/AS01B condujo a la producción de cantidades insignificantes de anticuerpos neutralizantes, significativamente menores que las producidas por Shingrix. Sin embargo, nuevamente, después de la inmunización de refuerzo, no pudimos ver ninguna diferencia significativa en términos de producción de anticuerpos neutralizantes entre los dos grupos (Figura 6B). Para verificar cómo la inmunización afecta el CMI, se detectaron niveles de IFN- e IL-2 específicos de gE después de la primera y la segunda inmunizaciones mediante el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISPOT) y la tinción con citoquinas intracelulares. La inmunización con tgE/AS01B indujo una respuesta inmunitaria humoral deficiente en comparación con una dosis única de Shingrix, pero mostró una potencia comparable en términos de inducir esplenocitos productores de IFN- - e IL-2- (Figura 6C). De hecho, después de la segunda inmunización, se detectó un número significativo de células productoras de citoquinas específicas de gE en el grupo tgE/AS01B en comparación con el grupo de control de solución salina, que también fueron comparables o mejores que las del grupo Shingrix (Figura 6D ). Se observaron resultados similares en el análisis de citometría de flujo, con observaciones de proporciones similares de células T CD4+ que expresan IFN- -(Figura 6E), CD-2-que expresan IL4+ (Figura 6F) y células T IFN- -CD8+ (Figura 6G) entre los ratones inmunizados con tgE/AS01B y Shingrixi, independientemente de una inmunización con dosis única o de refuerzo. Estos resultados demuestran que la proteína tgE derivada del sistema de expresión bacteriano puede inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares cuando se formula con adyuvantes apropiados y, por lo tanto, puede considerarse como un antígeno candidato para la generación de una vacuna contra el VZV.

Figura 6 Inmunogenicidad de tgE en ratones C57BL/6. Se administraron dosis de 5 ug de tgE formuladas con 50 μL de adyuvante AS01B. Esta fue 1/10 de la dosis de la vacuna Shingrix. La inmunización se realizó en las semanas 0 y 4. A, Comparación de la producción de anticuerpos inducida por la vacuna tgE/AS01B en comparación con Shingrix. Los títulos séricos se determinaron mediante ensayo ELISA utilizando placas recubiertas con rgE. B, Comparación de la respuesta de anticuerpos neutralizantes a vOka después de la vacunación con la vacuna tgE/AS01B o Shingrix. Los títulos de neutralización del antisuero en la semana 2 (panel izquierdo) y en la semana 6 (panel derecho) se expresan como el recíproco de la dilución del suero que da como resultado una inhibición del 50%. C, Evaluación de las respuestas de IFN e IL-2 específicas de gE inducidas por la vacuna tgE/AS01B o Shingrix en la semana 2. El número de esplenocitos productores de IFN- - e IL-2- se calculó a partir de la Ensayo ELISPOT después de la reestimulación con un conjunto de péptidos gE. D, Evaluación de las respuestas de IFN e IL-2 específicas de gE inducidas por la vacuna tgE/AS01B o Shingrix en la semana 8. El número de esplenocitos productores de IFN- - e IL-2- se calculó a partir de la Ensayo ELISPOT después de la reestimulación con un conjunto de péptidos gE. E – G, ensayos de citometría de flujo para células CD4+ y CD8+ que expresan citoquinas específicas de gE. La proporción de células T CD4+ productoras de IFN- -, células T CD-2-que producen IL4+ y CD8+ T productoras de IFN- - Se determinaron las células entre los esplenocitos.

DISCUSIÓN

El VZV gE es un objetivo importante de la respuesta inmune humoral y mediada por células durante la infección natural por varicela y después de la vacunación con VZV Oka. Shingrix (GSK) es una vacuna de subunidad recombinante que comprende una gE de VZV expresada en células CHO y el adyuvante AS01B basado en liposomas. Otro trabajo ha buscado investigar vacunas subunitarias contra HZ utilizando proteínas gE generadas a partir de CHO o células de insecto formuladas con nuevos adyuvantes (Cao et al., 2021; Lee et al., 2020; Luan et al., 2022a, Luan et al., 2022b; Wang et al., 2021; Wui et al., 2019; Wui et al., 2021). Aquí, investigamos y demostramos que la proteína gE podría expresarse y purificarse de manera soluble a partir de E. coli, y luego formularse como una vacuna candidata de subunidad con un adyuvante apropiado para provocar no solo un título neutralizante sólido sino también una fuerte respuesta CMI.

planta cistanche que aumenta el sistema inmunológico

E. coli como sistema de expresión ofrece varias ventajas: una rápida tasa de crecimiento celular, condiciones de cultivo económicas y una herramienta eficiente y versátil para producir proteínas recombinantes. La investigación de antígenos asociados al virus del herpes ha tenido varios éxitos utilizando el sistema de expresión basado en E. coli. Se fusionó un epítopo lineal neutralizante gE (aa 121-135) con 149 aa de la proteína central del virus de la hepatitis B (HBc) para producir VLP quiméricas que podrían inducir anticuerpos neutralizantes específicos del VZV en ratones (Zhu et al., 2016). En otro estudio, se expresó una proteína gE homóloga del virus de la varicela de simio (SVV) en E. coli utilizando una etiqueta de fusión GST para generar antisuero gE (Gray et al., 2001). Hasta el momento, no ha habido informes de una proteína gE del VZV sin una etiqueta de fusión purificada de E. coli como candidata a vacuna.

gE consta de tres regiones: un 544-aa ectodominio hidrófilo con un péptido señal (aa 1–30), una 17-aa región transmembrana hidrófoba y una 62-aa región de cola citoplásmica. Investigamos varias moléculas candidatas con diferentes truncamientos en las regiones N o C-terminales del ectodominio gE y descubrimos que la expresión exógena de estas proteínas en E. coli fue mejor usando la porción truncada (datos no mostrados). Un ectodominio gE intacto sin una etiqueta de fusión tiende a formar cuerpos de inclusión cuando lo expresa E. coli y es difícil de purificar. Entre los candidatos de truncamiento probados, la proteína gE (aa 31–358) mostró una alta expresión soluble con dificultades mínimas en su purificación, así como una alta pureza y alta homogeneidad (Figura 1). Por lo tanto, esta construcción de truncamiento se consideró como una vacuna candidata ideal. antígeno. Esta estrategia de truncamiento podría haber tenido un efecto potencial sobre las propiedades de la proteína, particularmente su antigenicidad. Anteriormente habíamos expresado gE recombinante en células de insecto y purificamos esta construcción para inmunizar ratones BALB/c, obteniendo anticuerpos monoclonales de 70 gE para el análisis de epítopos (Liu et al., 2015). A través de nuestro análisis, identificamos aa 1-194 como la región inmunodominante (datos no mostrados). Se obtuvieron resultados similares en otros lugares, con mAb específicos de gE que apuntan a las regiones 109-123 y 160-316 que son las regiones responsables de la unión estable de los anticuerpos entre los aislados variantes (Vafai, 1994). En otro estudio, utilizando VLP-fragmento de gE híbridas recombinantes, los autores identificaron los residuos 1 a 134 como la región más antigénica de la proteína gE y demostraron que el extremo C de gE (residuos 303 a 623) que contenía varios residuos de cisteína no logró producir partículas. en levadura (Fowler et al., 1995), lo que sugiere que la expresión heteróloga de gE debería considerar no sólo la antigenicidad sino también la facilidad de expresión. Aquí, optimizamos la longitud de la proteína gE para su expresión soluble eficiente con reducciones mínimas en la antigenicidad. La tgE mostró una reactividad similar a la mayoría de los anticuerpos en la Figura 3 al igual que la rgE producida en células de insectos, lo que sugiere que los epítopos clave están bien conservados en la proteína tgE purificada de E. coli. Sin embargo, un estudio demostró que los epítopos de células T CD4+ inmunodominantes reconocidos por los donantes de la vacuna Shingrix estaban dispersos por toda la proteína gE (Voic et al., 2020). La inmunogenicidad de la tgE en nuestro estudio fue idéntica a la encontrada para la gE derivada de células CHO en Shingrix cuando el antígeno se combinó con el adyuvante AS01B, con respuestas humorales y respuestas CMI igualmente eficientes, como se muestra en la Figura 5. Estos resultados indicaron que la gE truncada derivado del sistema procariótico era tan bueno como el ectodominio gE intacto del sistema eucariota en términos de antigenicidad.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

Existen diferencias considerables entre las proteínas gE derivadas de diferentes sistemas de expresión. Las diferencias más destacadas se observan en las modificaciones postraduccionales, en particular la glicosilación. Los glicanos unidos a O de las glicoproteínas de membrana tienen relevancia en términos de reconocimiento de células T y anticuerpos de epítopos de glicopéptidos virales, y este reconocimiento tiene el potencial de una gran importancia biomédica en nuestros intentos de mediar en la protección inmune contra virus utilizando vacunas de subunidades. La eliminación de los glicanos en gE producidos en células CHO-K1 dio como resultado una reducción del 17 % en la reactividad con sueros positivos para VZV. Por el contrario, la O-glicosilación puede interferir con la inmunorreactividad de los epítopos de las células B: algunos epítopos importantes están bloqueados por glicanos O-ligados adicionales (Nordén et al., 2019). En nuestro estudio, la tgE generada a partir de E. coli parece comportarse tan bien como la rgE derivada de células de insecto en términos de su inmunorreactividad e inmunogenicidad, lo que sugiere que la proteína tgE "desnuda" es prometedora como candidata a vacuna. Es probable que las vacunas con tgE como antígeno induzcan no sólo títulos elevados de IgG, lo que indica su potencial como vacuna subunitaria contra la varicela sin un riesgo potencial de latencia del virus, sino también un IMC alto, lo que sugiere su potencial también como vacuna contra el zóster. En general, el antígeno gE derivado del sistema de expresión bacteriano de este estudio ofrece una estrategia mucho más económica para el desarrollo de vacunas contra el VZV.

Referencias

Adkins, JC y Wagstaff, AJ (1998). Vacuna recombinante contra la hepatitis B: una revisión de su inmunogenicidad y eficacia protectora contra la hepatitis B. Biodrugs 10, 137–158.

Arvin, AM (1992). Inmunidad mediada por células al virus varicela-zoster. J Infect Dis 166, T35-T41.

Cao, H., Wang, Y., Luan, N. y Liu, C. (2021). Inmunogenicidad de la glicoproteína E del virus varicela-zoster formulada con nanopartículas lipídicas e inmunoestimuladores nucleicos en ratones. Vacunas 9, 310.

Chen, L., Liu, J., Wang, W., Ye, J., Wen, L., Zhao, Q., Zhu, H., Cheng, T. y Xia, N. (2014). Desarrollo de un ensayo de neutralización del virus varicela-zoster utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas con anticuerpos contra la glicoproteína K. Métodos J Virol 200, 10-14.

Cohen, JI (2013). Práctica clínica: herpes zoster. N Engl J Med 369, 255– 263. Dendouga, N., Fochesato, M., Lockman, L., Mossman, S. y Giannini, SL (2012). Respuestas inmunitarias mediadas por células a una vacuna de glicoproteína E del virus varicela-zóster utilizando un agonista de TLR y QS21 en ratones. Vacuna 30, 3126–3135.

Fowler, WJ, García-Valcárcel, M., Hill-Perkins, MS, Murphy, G., Harper, DR, Jeffries, DJ, Burns, NR, Adams, SE, Kingsman, AJ y Layton, GT (1995). Identificación de regiones inmunodominantes y epítopos de células B lineales de la proteína de la envoltura gE del virus varicela-zoster. Virología 214, 531–540.

Galea, SA, Sweet, A., Beninger, P., Steinberg, SP, LaRussa, PS, Gershon, AA y Sharrar, RG (2008). El perfil de seguridad de la vacuna contra la varicela: una revisión de 10-año. J Infect Dis 197, T165-S169.

Gray, WL, Mullis, LB y Soike, KF (2001). Expresión de la glicoproteína E del virus de la varicela de los simios. Virus Res 79, 27–37.

Heininger, U. y Seward, JF (2006). Varicela. Lanceta 368, 1365-1376.

Kim, JY, Kim, YG y Lee, GM (2012). Células CHO en biotecnología para la producción de proteínas recombinantes: estado actual y potencial futuro. Appl Microbiol Biotechnol 93, 917–930.

Lal, H., Cunningham, AL, Godeaux, O., Chlibek, R., Diez-Domingo, J., Hwang, SJ, Levin, MJ, McElhaney, JE, Poder, A., Puig-Barberà, J., et al. (2015). Eficacia de una vacuna de subunidad contra el herpes zoster con adyuvante en adultos mayores. N Engl J Med 372, 2087–2096.

Lee, SJ, Park, HJ, Ko, HL, Lee, JE, Lee, HJ, Kim, H. y Nam, JH (2020). Evaluación de vacunas de la subunidad E de la glicoproteína y del virus varicela-zoster vivo atenuado formuladas con un adyuvante a base de ARN monocatenario. Immun Inflamm Dis 8, 216–227.

Liu, J., Zhu, R., Ye, X., Yang, L., Wang, Y., Huang, Y., Wu, J., Wang, W., Ye, J., Li, Y., et al. (2015). Un ensayo cuantitativo de glicoproteína E del VZV basado en anticuerpos monoclonales y su aplicación en la cuantificación de antígenos en la vacuna VZV. Appl Microbiol Biotechnol 99, 4845–4853.

Luan, N., Cao, H., Wang, Y., Lin, K. y Liu, C. (2022a). Las nanopartículas de lípidos ionizables mejoraron el efecto adyuvante sinérgico de CpG ODN y QS21 en una vacuna de la subunidad de glicoproteína E del virus varicela-zoster. Farmacéutica 14, 973.

Luan, N., Cao, H., Wang, Y., Lin, K. y Liu, C. (2022b). La glicoproteína E del virus varicela-zóster adyuvada con LNP-CpG ODN indujo niveles comparables de inmunidad con Shingrix™ en ratones preparados con VZV. Virol pecado 37, 731–739.

Monie, A., Hung, CF, Roden, R. y Wu, TC (2008). Cervarix: una vacuna para la prevención del VPH 16, 18-cáncer de cuello uterino asociado. Biológicos 2, 97-105.

Nordén, R., Nilsson, J., Samuelsson, E., Risinger, C., Sihlbom, C., Blixt, O., Larson, G., Olofsson, S. y Bergström, T. (2019). La glicoproteína E recombinante del virus varicela-zoster contiene motivos péptido-glicano que modulan los epítopos de las células B en firmas inmunológicas discretas. Int J Mol Sci 20, 954.

Oliver, SL, Yang, E. y Arvin, AM (2016). Glicoproteínas del virus varicela-zoster: entrada, replicación y patogénesis. Curr Clin Microbiol Rep. 3, 204–215.

Overton, Tennessee (2014). Producción de proteínas recombinantes en huéspedes bacterianos. Drug Discov hoy 19, 590–601.

Oxman, MN, Levin, MJ, Johnson, GR, Schmader, KE, Straus, SE, Gelb, LD, Arbeit, RD, Simberkoff, MS, Gershon, AA, Davis, LE, et al. (2005). Vacuna para prevenir el herpes zoster y la neuralgia posherpética en adultos mayores. N Engl J Med 352, 2271–2284.

Shah, RA, Limmer, AL, Nwannunu, CE, Patel, RR, Mui, UN y Tyring, SK (2019). Shingrix para el herpes zóster: una revisión. Terapia de la piel Lett 24, 5–7. Singh, SM y Panda, AK (2005). Solubilización y replegamiento de proteínas de cuerpos de inclusión bacterianos. J Biosci Bioeng 99, 303–310.

Syed, YY (2018). Vacuna recombinante contra el zóster (Shingrix®): una revisión en el herpes zóster. Drogas a los 35 años, 1031-1040.

Takahashi, M., Otsuka, T., Okuno, Y., Asano, Y., Yazaki, T. e Isomura, S. (1974). La vacuna viva se utiliza para prevenir la propagación de la varicela en niños en los hospitales. Lanceta 304, 1288-1290.

Tseng, HF, Smith, N., Harpaz, R., Bialek, SR, Sy, LS y Jacobsen, SJ (2011). Vacuna contra el herpes zoster en adultos mayores y riesgo de enfermedad por herpes zoster posterior. JAMA 305, 160–166.

Vafai, A. (1994). Sitios de unión de anticuerpos en formas truncadas de la glicoproteína gpI (gE) del virus varicela zoster. Vacuna 12, 1265-1269.

Voic, H., de Vries, RD, Sidney, J., Rubiro, P., Moore, E., Phillips, E., Mallal, S., Schwan, B., Weiskopf, D., Sette, A., et al. (2020). Identificación y caracterización de epítopos de células T CD4+ después de la vacunación con Shingrix. J Virol 94, e01641-20.

Wang, Y., Qi, J., Cao, H. y Liu, C. (2021). Respuestas inmunes a la glicoproteína E del virus varicela-zoster formulada con nanopartículas de poli (ácido láctico-coglicólico) y adyuvantes de ácido nucleico en ratones. Virol pecado 36, 122-132.

Wu, T., Li, SW, Zhang, J., Ng, MH, Xia, NS y Zhao, Q. (2012). Desarrollo de la vacuna contra la hepatitis E: una odisea de 14-año. Hum Vaccin Immunother 8, 823–827.

Wui, SR, Kim, KS, Ryu, JI, Ko, A., Do, HTT, Lee, YJ, Kim, HJ, Lim, SJ, Park, SA, Cho, YJ, et al. (2019). Inducción eficiente de la inmunidad mediada por células a la glicoproteína E del virus varicela-zóster liofilizada con un adyuvante catiónico a base de liposomas en ratones. Vacuna 37, 2131–2141.

Wui, SR, Ko, A., Ryu, JI, Sim, E., Lim, SJ, Park, SA, Kim, KS, Kim, H., Youn, H. y Lee, NG (2021). El efecto de un agonista de TLR4/adyuvante de liposoma catiónico sobre la eficacia de la vacuna contra la glicoproteína E del virus varicela-zoster: presentación, captación y administración del antígeno a los ganglios linfáticos. Farmacéutica 13, 390.

Zerboni, L., Sen, N., Oliver, SL y Arvin, AM (2014). Mecanismos moleculares de la patogénesis del virus varicela zóster. Nat Rev Microbiol 12, 197–210.

Zhu, R., Liu, J., Chen, C., Ye, X., Xu, L., Wang, W., Zhao, Q., Zhu, H., Cheng, T. y Xia, N. (2016). Un candidato a vacuna con epítopo altamente conservado contra el virus varicela-zoster induce anticuerpos neutralizantes en ratones. Vacuna 34, 1589-1596.