Sidt2 es una proteína clave en la vía de degradación lisosomal de la autofagia y es esencial para el mantenimiento de la estructura renal y la función de filtración
Nov 07, 2023
La regulación y la homeostasis de la autofagia son esenciales para mantener la morfología y función de los órganos. Como proteína de membrana lisosomal, el efecto deSidt2enestructura del riñónyautofagia renalaún se desconoce. En este estudio, encontramos que los riñones deSidt2-/-Los ratones mostraron cambios en el engrosamiento de la membrana basal, la fusión de las apófisis del pie y la inflamación mitocondrial, lo que sugiere que lala estructura del riñón fue dañada. El aumento de proteína en orina a las 24 h indicó que laFunción del riñóntambién resultó dañado. Al mismo tiempo, la ausencia deSidt2causó una disminución en el número de lisosomas ácidos, una disminución en la actividad y expresión de la hidrolasa ácida en el lisosoma y un aumento del pH en el lisosoma, lo que sugiere que la función lisosomal se vio afectada despuésSidt2supresión. La acumulación de autofagolisosomas, el aumento de los niveles de proteína LC3-II y P62 y la disminución de los niveles de ARNm de P62 indicaron que la ausencia delSidt2El gen causó una vía de autofagia anormal.FloridaAy. Experimento de cloroquina, inmuno.FloridaEl autofagosoma de fluorescencia, el ensayo de fusión de lisosomas y Ad-mcherry-GFP-LC3B indicaron además que, después deSidt2Con la deleción, la producción de autofagosomas no aumentó, pero la fusión de autofagosomas y lisosomas y la degradación de los autofagolisosomas se vieron afectadas. Al incubarSidt2-/-células con el activador de la autofagia rapamicina, encontramos que podía activar la autofagia, que se manifestaba como un aumento en los autofagosomas, pero no podía mejorar la degradación de los autofagolisosomas. Mientras tanto, ilustró además que elSidt2El gen juega un papel importante en el buen progreso de los procesos de autofagolisosoma. En resumen, la ausencia delSidt2El gen causó un deterioro de la función de los lisosomas y una disminución del número de lisosomas ácidos, lo que llevó a la formación y trastornos de degradación de los autofagolisosomas, que eventualmente se manifestaron comoestructura y función anormal del riñón. Sidt2Es esencial para mantener la función normal de los lisosomas y la estabilidad fisiológica de los riñones.
INTRODUCCIÓN
La visión tradicional es que los lisosomas son los dispositivos de eliminación de basura de las células para eliminar los desechos producidos por las células [1–3]. Sin embargo, muchos estudios han demostrado que el papel de los lisosomas es mucho más complejo y puede implicar la transducción de señales celulares, la tumorigénesis, el desarrollo y otros aspectos que afectan las actividades vitales del cuerpo [4-10]. Los lisosomas suelen estar enriquecidos en tejidos como el hígado y el riñón [11]. Por lo tanto, la disfunción lisosomal también está estrechamente relacionada con enfermedades de los tejidos del hígado y el riñón, como la enfermedad de Gaucher [12], mucopolisacaridosis [13], enfermedad de Niemann-Pick [14], glomeruloesclerosis retardada [15], nefropatía membranosa idiopática [16] , etc. Las proteínas de membrana lisosomal (LMP) son los componentes de la membrana cuya función no es solo mantener la integridad del lisosoma sino que también participan en diversos aspectos como la transducción y regulación de señales intracelulares que son esenciales para mantener la función del lisosoma. y actividades de la vida celular [17-19].
Hasta la fecha, se han descubierto más de 100 LMP, pero aún se desconocen las funciones de la mayoría de ellas [20]. El miembro 1 de la superfamilia transmembrana 7 (TM7SF1) es esencial para el mantenimiento de la función de los podocitos renales [21] y desempeña un papel importante en el proceso de desarrollo del riñón [22]. El canal 5 dependiente de voltaje de cloruro (ClC-5) es un canal de ion cloruro (Cl(-)) expresado en los túbulos renales, que es esencial para la función tubular renal normal [23]; cuando muta, puede causar la enfermedad de Dent [24]. La sobreexpresión del canal 7 dependiente de voltaje de cloruro (ClC-7) previene la apoptosis de las células epiteliales tubulares renales causada por un estado redox alterado [25]. Estos estudios demuestran que, como componentes del tejido renal enriquecido con lisosomas, las LMP son esenciales para mantener la función normal, pero el mecanismo específico de su patogenicidad relacionada aún no está claro.
La familia transmembrana SID1, miembro 2 (Sidt2) es una LMP recientemente descubierta que se expresa altamente en los tejidos del hígado y el riñón [26]. Estudios anteriores han demostrado que la eliminación de Sidt2 puede causar enfermedades relacionadas con el hígado, que se manifiestan como esteatosis hepática y trastornos del metabolismo de los lípidos hepáticos [11, 18]. En un estudio reciente, descubrimos que los riñones de los ratones Sidt2-/- también sufrieron daños, pero el mecanismo específico no está claro. Los lisosomas son importantes orgánulos ejecutivos para la autofagia [10]. ¿Está involucrada la regulación de la autofagia? En este estudio, examinamos la correlación entre la función lisosomal (autofagia) y la enfermedad y exploramos el mecanismo subyacente que involucra a Sidt2 y causa daño renal, lo que será de gran ayuda para el estudio de la correlación entre la FUM y la enfermedad.
RESULTADOS
El modelo Sidt2−/− muestra queDaño en el riñónSe asocia con acumulación de autofagolisosoma.
El método de construcción de ratones Sidt2-/- se muestra en la Fig. 1A. Se secuenció el ADN de la cola de ratón homocigótico obtenido y el resultado de la secuenciación fue unimodal (Fig. 1B), y se produjo una pérdida de fragmento de 199 pb en el segundo exón. Mediante la identificación del genotipo por PCR, encontramos que los ratones Sidt2+/+ (tipo salvaje, WT) tenían segmentos de ADN de 685 pb, mientras que los ratones Sidt2-/- tenían 486 pb (Fig. 1C). Como se muestra en la Fig. 1D, la proteína Sidt2 difícilmente pudo detectarse en ratones Sidt2-/- que en WT, lo que sugirió que el modelo se construyó con éxito. Mediante una prueba de orina, se encontró que la proteína en orina de 24 h aumentó significativamente en ratones Sidt2 -/- en comparación con WT (Fig. 1E), lo que sugiere que la barrera de filtración renal se vio afectada después de que se eliminó Sidt2. Las observaciones de microscopía electrónica de transmisión (Fig. 1F) mostraron que, en comparación con los ratones WT (a – f), los riñones de los ratones Sidt2 -/- exhibieron fusión difusa de las apófisis de las patas, engrosamiento de la membrana basal glomerular (g, h), epitelio tubular renal. edema celular, daño de microvellosidades (i, j), edema mitocondrial, cambios tipo vacuola y desaparición de espinas (k, l). Curiosamente, los ratones Sidt2-/- también mostraron una gran cantidad de acumulaciones de autofagolisosomas (mostradas por flechas rojas, m, n), y el número fue significativamente mayor que el del control (Fig. 1G). A nivel celular, descubrimos que Sidt2 también era esencial para la supervivencia de las células renales. La eliminación del gen Sidt2 provoca una disminución de la proliferación y un aumento de la apoptosis de las células MPC5 y SV40 MES 13 (Figura complementaria 1).
La eliminación del gen Sidt2 provoca cambios en el número y función de los lisosomas ácidos en las células de riñón de ratón
Se utilizó la tecnología Crispr-Cas9 para desactivar el gen Sidt2 en células MPC5 y SV40 MES 13 para obtener los modelos celulares. Las verificaciones del nivel de ARNm y proteína (Fig. 2A-C) se realizaron mediante qRT PCR y transferencia Western respectivamente, lo que muestra que los modelos se construyeron con éxito. El sistema de degradación mediado por lisosomas es un paso clave en la degradación de la autofagia. Como LMP indispensable, ¿la eliminación de Sidt2 afectará las expresiones de proteínas relacionadas con los lisosomas? Medimos la principal proteína de membrana 1 asociada a lisosomas de LMP (LAMP1). Los resultados mostraron que la expresión de LAMP1 disminuyó después de la eliminación de Sidt2 en células MPC5 y SV40 MES 13 (Fig. 2D, E). Además, utilizamos LysoTracker para etiquetar los lisosomas ácidos y descubrimos que la cantidad de lisosomas ácidos disminuyó después de la eliminación de Sidt2 en ambos tipos de células (Fig. 2F, G). Posteriormente, medimos la catepsina B lisosomal (CTSB) y encontramos que en el tejido de riñón de ratón (Fig. 2H, I), células MPC5 (Fig. 2J, K) y células SV40 MES 13 (Fig. 2L, M), las expresiones de CTSB en los modelos Sidt2-/- se redujeron, lo que indica que la actividad de la enzima proteolítica en los lisosomas disminuyó cuando se eliminó el gen Sidt2. De manera similar, la expresión del precursor CTSB en los dos tipos de células del grupo Sidt2-/- se redujo significativamente, lo que indica que el CTSB también se vio afectado después de la eliminación de Sidt2. Además, utilizamos LysoSensor para detectar el ambiente ácido de los lisosomas. Cuanto menor sea la relación de intensidad de fluorescencia, mayor será el valor del pH en el lisosoma. Los resultados mostraron que después de la eliminación de Sidt2, el valor del pH aumentó (Fig. 2N, O) y la acidificación fue anormal. Para explorar más a fondo si las anomalías lisosomales anteriores se debieron a un número anormal de lisosomas o funciones lisosomales anormales, investigamos las células mediante microscopía electrónica (Fig. 2P). Descubrimos que no hay cambios obvios en la cantidad de lisosomas primarios y en la cantidad total de lisosomas (incluidos los lisosomas primarios y secundarios) después de la eliminación de Sidt2 (Fig. 2Q).
La vía de la autofagia renal es anormal después de la eliminación de Sidt2
Como se mencionó anteriormente, se observó una gran cantidad de acumulaciones de autofagolisosomas en las células renales de ratones Sidt2-/-, lo que sugiere que la vía de la autofagia era anormal. Mediante análisis de transferencia Western, se demostró que había un aumento significativo en el nivel de proteína del conjugado LC3-fosfatidiletanolamina (LC3-II) y el Sequestosoma 1(P62) en el riñón de Sidt2-/- ratones y un aumento en las expresiones de proteínas relacionadas con la autofagia de 5 relacionado con la autofagia (Atg5), 7 relacionado con la autofagia (Atg7) y 12 relacionado con la autofagia (Atg12) (Fig. 3A, B). Sin embargo, el nivel de ARNm de P62 disminuyó significativamente (Fig. 3C), lo que sugiere que la vía de autofagia fue anormal después de la eliminación de Sidt2 in vivo. Luego encontramos que las expresiones de las proteínas de autofagia LC3-II, P62, Atg5, Atg7 y Atg12 también aumentaron (Fig. 3D-G) en los dos tipos de células renales después de la eliminación de Sidt2, lo cual fue consistente con el in vivo. El aumento de LC3-II indicó un aumento de autofagosomas en las células renales después de la eliminación de Sidt2, que puede ser causado por la activación de la autofagia o la degradación bloqueada de los autofagosomas. La inmunofluorescencia de P62 (Fig. 3H) mostró claramente un aumento en el contenido de P62 en las células Sidt2 -/- (Fig. 3I). A diferencia del nivel de proteína, qRT-PCR mostró que P62 disminuyó significativamente a nivel de ARNm (Fig. 3J), lo que indica que el aumento de P62 estaba relacionado con una degradación insuficiente. Los aumentos en Atg5, Atg7 y Atg12 indicaron que la autofagia comenzó y se formó normalmente, pero la acumulación de P62 también sugirió obstáculos en el proceso de autofagia, y esta contradicción nos obligó a explorar más a fondo la verdadera situación del flujo de autofagia.
In vitro, la aplicación de cloroquina indica una reducción del flujo de autofagia después de la pérdida de Sidt2. El experimento de la cloroquina es uno de los experimentos clásicos para observar el flujo de autofagia. Para comprender las razones de los aumentos en LC3-II y P62 después de la eliminación de Sidt2, utilizamos cloroquina (CQ), un inhibidor posterior de la autofagia, para actuar sobre las células y observar el flujo de la autofagia. Primero, utilizamos diferentes gradientes de concentración para confirmar que la concentración de saturación inhibida por CQ era de 50 μM (Fig. 4A-F) en las células MPC5 y SV40 MES 13. Además de esta concentración, cuando la concentración de CQ continuó aumentando, LC3-II y P62 no aumentaron más para alcanzar la saturación. Por lo tanto, utilizamos estimulación CQ 50 μM durante 16 h para inhibir completamente el flujo de autofagia y, en este momento, las diferencias de LC3-II entre el grupo Sidt2+/+ y el grupo Sidt2-/- desaparecieron en las células MPC5 y SV40 MES 13. De manera similar, después del procesamiento de CQ 50 μM, las diferencias de P62 causadas por la eliminación de Sidt2 también desaparecieron (Fig. 4G, H, J, K). Las estadísticas sobre el flujo de autofagia mostraron que disminuía cuando faltaba Sidt2 (Fig. 4I, L), lo que confirmó además que los aumentos en la expresión de LC3-II y P62 después de la eliminación de Sidt2 se debieron a la falla en la eliminación de la autofagia. en lugar del aumento del nivel de autofagia (la activación de la autofagia).
Interrupción de la fusión autofagosoma-lisosoma in vitro después de la eliminación de Sidt2 La eliminación y la degradación son las etapas media y tardía del proceso de autofagia, que implican la fusión del autofagosoma con una disminución después de la eliminación de Sidt2 (Fig. 5D), lo que indica que la fusión de Los autofagosomas y lisosomas estaban afectados.
Figura 1Daño en el riñóny acumulación de autofagolisosoma en ratones Sidt2 -/-. Un esquema de direccionamiento del gen del sistema Cre-LoxP; B arriba es el diagrama de secuencia exportado del ADN de la cola de ratón con desactivación del gen Sidt2; A continuación se muestra el mapa de secuenciación, la flecha indica la ubicación del gen faltante. En comparación con los ratones WT, se produce una pérdida de gen de 199 pb en el exón 2; Verificación del nivel de ADN C de Sidt2 (extraído del tejido de la cola). El producto amplificado del cebador contiene la región desactivada de bases, que se muestra como Sidt2+ /+(WT), Sidt2+/− o Sidt2−/−; Verificación del nivel de proteína D para detectar los niveles de expresión de la proteína Sidt2 mediante transferencia Western; Proteína de orina de 24 h de riñón E en ratones WT y Sidt2-/-; F estructura ultramicromorfológica de los riñones de ratones WT (a, f) y ratones Sidt2 -/- (g – n). En comparación con el ratón WT, el riñón del ratón Sidt2-/- muestra fusión de las apófisis del pie, engrosamiento de la membrana basal (g, h), edema de células epiteliales tubulares renales, daño de las microvellosidades (i, j), destrucción mitocondrial (k, l) y acumulación de autofagolisosoma (m, n); G número total de autofagolisosomas renales en ratones WT y Sidt2-/-. *P < 0.05, **P < 0,01.
Fig. 3 La eliminación de Sidt2 interrumpe la vía de autofagia. A Detección de niveles de expresión de proteínas relacionadas con la autofagia de células WT y Sidt2-/- mediante transferencia Western; B gráficos estadísticos de los resultados de la prueba de transferencia Western; Nivel de expresión de ARNm de C P62 en tejidos renales de ratones WT y Sidt2-/-; D niveles de expresión de las proteínas de la vía de autofagia de las células MPC5 antes y después de la eliminación de Sidt2; E gráfico estadístico del gráfico (D); Niveles de expresión F de proteínas de la vía de autofagia en células SV40 MES 13 antes y después de la eliminación de Sidt2; G gráfico estadístico del gráfico (F); Inmunofluorescencia de H P62 en células MPC5 y SV40 MES 13 antes y después de la desactivación de Sidt2; I cuadros estadísticos de los resultados de la inmunofluorescencia; Niveles de expresión de ARNm de J P62 en células MPC5 y SV40 MES 13 antes y después de la eliminación de Sidt2. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.
Anuncio-mCherry-GFP-
El doble etiquetado de fluorescencia de LC3B sugiere que la formación de autofagolisosomas y su vía de degradación se bloquearon después de la eliminación de Sidt2. El experimento de transfección Ad-mCherry-GFP-LC3B se puede utilizar para detectar cambios en el flujo dinámico de autofagia dentro de las células. Durante el proceso de autofagia, mCherry-GFP-LC3B se acumula en la membrana del autofagosoma y se manifiesta en forma de manchas amarillas bajo un microscopio de fluorescencia. Cuando los autofagosomas y los lisosomas se fusionan para formar autofagolisosomas, el ambiente ácido dentro del lisosoma apagará la fluorescencia de la GFP para que se manifieste en forma de manchas rojas. Por lo tanto, la GFP unida a LC3 solo se puede utilizar para detectar autofagosomas, mientras que mCherry puede detectar autofagosomas y autofagolisosomas al mismo tiempo. Cuando los puntos de fluorescencia verde y rojo se combinan y se muestran como puntos de fluorescencia amarillos, esto corresponde a autofagosomas. En este momento, la fluorescencia roja puede indicar autofagolisosomas y también puede indicar la suavidad de la formación de autofagolisosomas [27]. Las células MPC5 y las células SV40 MES 13 en los grupos Sidt2+/+ y Sidt2-/- se transfectaron con adenovirus Ad-mCherry GFP-LC3B y se fotografiaron con un microscopio láser confocal (Fig. 6A). Se encontró que la cantidad de puntos fluorescentes amarillos aumentó y la cantidad de puntos fluorescentes rojos disminuyó (Fig. 6B, C) después de la eliminación de Sidt2, lo que demostró que la cantidad de autofagosomas aumentó y los autofagolisosomas disminuyeron en el grupo Sidt2-/-. Esto se debe a que hubo obstáculos para la formación de autofagolisosomas y las vías de degradación de los autofagolisosomas se bloquearon, lo que condujo a obstáculos en la degradación de los autofagosomas.
La rapamicina no mejoró la acumulación de P62 causada por la deleción de Sidt2, sino que la exacerbó. La rapamicina (RAPA) es un inhibidor de mTOR y activa la autofagia. Cuando RAPA actuó sobre las células MPC5 y SV40 MES 13 de los grupos Sidt2+/+ y Sidt2-/-, aumentó las cantidades de LC3-II en ambos grupos. Esto significó que RAPA podría activar la vía ascendente de la autofagia. De manera similar, encontramos que el aumento en el nivel de LC3-II en el grupo Sidt2-/- con RAPA fue más obvio que en el control (grupo Sidt2+/+), lo que demuestra que cuando RAPA actuó en el grupo Sidt2-/-, la degradación de los autofagosomas aún no mejoró. Mientras tanto, también observamos los cambios en P62 y descubrimos que cuando RAPA actuó sobre el grupo Sidt2+/+ de células MPC5 y SV40 MES 13, P62 no cambió significativamente, lo que indica que el flujo de autofagia era normal. Cuando RAPA actuó en el grupo Sidt2-/-, el nivel de expresión de P62 aumentó aún más en comparación con el anterior a la administración y también fue más obvio que en el control después del tratamiento con RAPA (Fig. 7A, B, D, E). Posteriormente, para explorar las razones de la expresión inconsistente de la proteína P62 después de que el grupo Sidt2+/+ y Sidt2-/- fueron tratados con RAPA, medimos los niveles de ARNm de P62 y encontramos que el nivel aumentó. después del tratamiento con RAPA en los grupos Sidt2+/+ y Sidt2-/-, y el grupo Sidt2+/+ tuvo un nivel más alto que el del grupo Sidt2-/- (Fig. 7C , F), lo que podría demostrar aún más que el flujo de autofagia fue fluido en el grupo Sidt2+/+, mientras que el trastorno del flujo de autofagia ocurrió al final de la autofagia en el grupo Sidt2-/-, es decir, la degradación de los autofagolisosomas. enlace. También estudiamos el efecto de Sidt2 sobre la proliferación y apoptosis de las células renales bajo la condición de autofagia activada y descubrimos que después de la activación celular de la autofagia inducida por medio libre de suero, en comparación con el grupo de control, la proliferación de Sidt2-/- El grupo se inhibió aún más y la apoptosis fue más obvia (Figura complementaria 2).
Fig. 5 Se evita la fusión de autofagosoma y lisosoma después de la eliminación de Sidt2. Una colocalización de inmunofluorescencia de LC3B y LAMP1 en células MPC5 y SV40 MES 13 antes y después de la eliminación de Sidt2, análisis con el coeficiente de correlación de Pearson; B comparación de los puntos de fluorescencia de LC3B antes y después de la desactivación de Sidt2 en células MPC5 y SV40 MES 13; C comparación del coeficiente de correlación de Pearson antes y después de la eliminación de Sidt2 en células MPC5 y SV40 MES 13; D comparación de la tasa de fusión antes y después de la eliminación de Sidt2 en células MPC5 y SV40 MES 13 (la relación entre el número de puntos fluorescentes co-localizados de LAMP1 y LC3B y el número de puntos fluorescentes de LAMP1); *P < 0,05, **P < 0,01.
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