Abstracto
Antecedentes La IRA es una secuela común de la infección por SARS-CoV-2 y contribuye a la gravedad y mortalidad de la COVID-19. Aquí probamos la hipótesis de quealteraciones renalesLa IRA inducida por la COVID-19 podría detectarse en células extraídas de la orina. Métodos Realizamos secuenciación de ARN unicelular (scRNAseq) en células recuperadas de la orina de ocho pacientes hospitalizados con COVID-19 con (n55) o sin IRA (n53), así como de cuatro pacientes con IRA no COVID-19. (n54) para evaluar las diferencias en la composición celular y la expresión genética durante la IRA. Resultados El análisis de 30.076 células reveló una amplia gama de tipos de células, la mayoría de las cuales eranriñón, uroteliales e inmunitarias. El análisis de las vías de las células tubulares de pacientes con IRA mostró un enriquecimiento de las transcripciones asociadas con vías relacionadas con el daño en comparación con aquellos sin IRA. La expresión de ACE2 y TMPRSS2 fue mayor en las células uroteliales entre los tipos de células recuperadas. En particular, en un paciente detectamos ARN viral del SARS-CoV-2 en células uroteliales. Estas mismas células se enriquecieron con transcripciones asociadas con vías antivirales y antiinflamatorias. Conclusiones Realizamos con éxito scRNAseq en sedimento urinario de pacientes hospitalizados con COVID-19 para estudiar de forma no invasiva las alteraciones celulares asociadas con la IRA y establecimos un conjunto de datos que incluye células renales lesionadas y no lesionadas. Además, proporcionamos evidencia preliminar de infección directa de las células de la vejiga urinaria por el SARS-CoV-2. El sedimento urinario contiene gran cantidad de información y es un recurso útil para estudiar la fisiopatología y las alteraciones celulares que se producen enenfermedades renales.
ALIMENTOS ORGÁNICOS PARA LA SALUD RENAL
Introducción
La infección por coronavirus 2 (SARS-CoV-2) del síndrome respiratorio agudo severo desencadena patología en múltiples sistemas, incluido el riñón, y la IRA se asocia con una morbilidad y mortalidad significativas en la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) (1 –5). Múltiples estudios han demostrado altas tasas de IRA entre pacientes hospitalizados con COVID-19 (6), y algunos informaron que hasta el 50 % de las personas infectadas desarrollaron IRA (7–9). El receptor primario ACE2 del SARS-CoV-2 se expresa en las células epiteliales de todo el sistema urinario, incluidas las células del túbulo proximal y las células uroteliales (10-13), aunque no está claro si la IRA en pacientes con COVID-19 se debe a una infección viral directa de los túbulos proximales o es el resultado de la respuesta sistémica al SARS-CoV-2 (14-22). De manera similar, no está claro si el SARS-CoV-2 puede causar cistitis viral mediante infección directa de las células uroteliales, aunque se ha propuesto esta posibilidad (23-26). A pesar de la alta prevalencia de IRA asociada a COVID-19, las alteraciones celulares subyacentes que ocurren en el contexto de IRA siguen siendo poco conocidas.
La IRA asociada a la COVID-19 sigue siendo en gran medida poco estudiada, ya que el acceso al tejido renal requiere una biopsia o un análisis post mortem (27). Estudios recientes han detectado una amplia gama de células inmunes, de riñón y de vejiga en la orina (28-30). Por lo tanto, la orina puede ofrecer información valiosa para el estudio no invasivo de los cambios renales durante la IRA asociada a la COVID-19. Aquí, realizamos una secuenciación de ARN unicelular (RNA-Seq) para caracterizar la diversidad celular en la orina de pacientes hospitalizados con COVID-19 con y sin IRA. Probamos la hipótesis de que las alteraciones renales en la IRA asociada a COVID-19 podrían detectarse en células extraídas de la orina. También recolectamos muestras de pacientes sin COVID-19 y con IRA (IRA no COVID-19). Encontramos varias poblaciones de células inmunitarias inflamatorias y vías activadas diferencialmente en la IRA asociada a COVID-19, así como evidencia preliminarpara la infección directa de células uroteliales por SARS-CoV-2.
Materiales y métodos
Participantes y variables Se examinaron adultos de 18 años o más durante el ingreso o el traslado al hospital de la Universidad de Alabama en Birmingham (UAB) entre marzo y mayo de 2021. Los casos de IRA se identificaron mediante laNefropatíaMejorar la definición de resultados globales como un aumento de la creatinina sérica (sCr) .0.3 mg/dl en 48 horas o .1,53 creatinina inicial. Los controles sin cambios en la creatinina se seleccionaron basándose en la coincidencia de edad y sexo cuando fue posible y se procesaron con cada muestra de IRA respectiva. La Crs inicial se determinó utilizando el valor de Crs más reciente entre 7 y 365 días antes de la hospitalización. Se extrajeron datos clínicos adicionales sobre demografía, historial médico, características clínicas y valores de laboratorio de las historias clínicas de los pacientes a través del equipo i2b2 del Centro de Ciencias Clínicas y Traslacionales de la UAB. Se incluyeron ocho pacientes hospitalizados con COVID-19, cinco con IRA y tres sin IRA. Este estudio y la colección de muestras fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la UAB. El Equipo de Consulta de Nefrología Aguda de la UAB también recolectó muestras de pacientes con IRA no relacionada con COVID-19 (n54) para comparar los cambios celulares con la IRA asociada con COVID-19. Estos se recolectaron bajo un protocolo diferente de la junta de revisión institucional que permite la recolección de muestras de orina remanentes y, por lo tanto, es anónimo.
Recolección y procesamiento de muestras
Todos los pasos se realizaron sobre hielo. La orina se recogió como muestra evacuada o mediante un catéter urinario. Las muestras fueron inmediatamente trasladadas a un laboratorio de nivel de bioseguridad 21 para su procesamiento. Las muestras de orina se transfirieron a un tubo cónico de 50- ml y se centrifugaron a 10003 g durante 10 minutos a 4 C. Los sedimentos celulares se lavaron con PBS enfriado con hielo, se filtraron a través de un filtro de 40- mm y se centrifugaron nuevamente. Las células vivas se purificaron utilizando el kit de eliminación de desechos MACS (Miltenyi Biotec) seguido del kit de eliminación de células muertas EasySep Anexina V (StemCell). Brevemente, las células se resuspendieron en PBS helado y se mezclaron con una solución de eliminación de desechos. Se cubrió PBS frío sobre la mezcla y se centrifugó a 3003 g durante 10 minutos a 4 C. Se aspiraron las dos fases superiores y luego se lavaron las células restantes con PBS. Las células se resuspendieron y se mezclaron con Dead Cell Removal Cocktail, Biotin Selection Cocktail y luego RapidSpheres antes de la separación en un imán EasySep. Las células se lavaron y se resuspendieron en 52 ml de PBS (sin calcio ni magnesio) BSA al 10,04% (Fisher Scientific) para el procesamiento de scRNAseq.
scRNAseq
Las células purificadas se transfirieron a la citometría de flujo y al núcleo de una sola célula de la UAB y se procesaron inmediatamente utilizando el kit de secuenciación de ARN de una sola célula de cromo 39 (103Genómica) según el fabricante.'s instrucciones.Se contó la suspensión celular, combinada con los 103 Mezcla de reactivo de cromo y cargada en un micro.FloridauídicoDispositivo de partición unicelular en el que se realiza la lisis y la inversión.La transcripción se produce en microgotas. El ADNc resultantefue ampliadofied por PCR y posteriormente procesado para producir
bibliotecas de secuenciación con códigos de barras. La secuenciación de extremos emparejados se llevó a cabo en la plataforma de secuenciación Illumina NovaSeq6000 o NextSeq500 (Illumina). Las lecturas fueron procesadasusando el 103 Software unicelular Genomics Cell RangerSuite versión 6.0 en la UAB Cheaha High-PerformanceClúster de Computación. BCLfiLos archivos fueron convertidos a FASTQ.fiarchivos utilizando la función rápida CellRanger. celularRangerrápido se utilizó para alinear FASTQfiarchivos a un genoma personalizadoque consiste en el genoma humano hg38 (GRCh38.p13) con
el genoma del SARS-CoV-2 (NC_045512.2) insertado como exón (31). Para el análisis se crearon la tabla de genes, la tabla de códigos de barras y las matrices de expresión transcripcional.indicado a continuación.
Análisis de datos
Los análisis se realizaron utilizando paquetes creados para el entorno de análisis estadístico R (versión 4.06). Los datos se analizaron principalmente en Seurat versión 3.2.3 (32,33) y sudependencias asociadas. Datos de cada pacientefueron importados usando Read103 función y luego estructuraconvertido en un objeto Seurat usando CreateSeuratObject. Paracontrol de calidad, celdas con características únicas que cuentan con más de 2500o menos de 200 y células con proporciones mitocondriales de.15% fueronfifiltrado. Los datos se normalizaron utilizando LogNormalizar y escalar para prepararse para dimensiones lineales.reducción. Los objetos de pacientes individuales fueron etiquetadoscon identificación de grupo únicaficationes y luego se fusionaron en unobjeto único utilizando la función de fusión de Seurat. paciente samLos ejemplos se integraron con la función RunHarmony usandoel paquete Harmony R (34). Análisis de componentes principalesse realizó, y luego, las células se agruparon segúnExpresión genética diferencial determinada por Seurat.Función FindAllMarkers configurada con una resolución de uno. dimensiónLa reducción funcional se realizó utilizando un colector uniforme.aproximación y proyección. Los tipos de células fueron identifiedcomparando las transcripciones expresadas diferencialmente paracada grupo con transcripciones conocidas asociadas con especiesfic tipos de células (29,35,36). El paquete Escape R se utilizó para ejecutarAnálisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) (37). WebGestaltRse utilizó para el análisis de ontología genética para identificar víasutilizando el proceso biológico y la enciclopedia de Kyoto deBases de datos de genes y genomas (38).
