SLC37A2, una molécula relacionada con el fósforo aumenta en las células del músculo liso en el aorma calcificado

calcificación vasculares una fuente importante deenfermedad cardiovascularen pacientes con enfermedad renal crónica.hiperfosfatemiaconduce a un aumento de la entrada de fósforo intracelular, lo que conduce a un aumento de células similares a los osteoblastos en las células del músculo liso vascular. PiT-1 transita el fosfato en las células del músculo liso vascular. Sin embargo, el mecanismo de la calcificación vascular no se comprende completamente. Este estudio investigó moléculas candidatas relacionadas con el fósforo distintas de PiT-1. Nuestra hipótesis es que las moléculas relacionadas con el fósforo que pertenecen a laportador de soluto(SLC) estaría implicada en la calcificación vascular. Como resultado del análisis de microarrays de ADN, nos centramos en SLC37A2 y demostramos que la expresión de ARNm de estas células aumentó en las células del músculo liso aórtico calcificadas (AoSMC). Se ha informado que SLC37A2 transporta intercambios de glucosa-6-fosfato/fosfato y fosfato/fosfato. El análisis in vitro mostró que la expresión de SLC37A2 no se vio afectada por la inflamación en AoSMC. La expresión de ARNm y proteína de SLC37A2 aumentó en AoSMC calcificada. In vivo, el análisis mostró que la expresión del ARNm de SLC37A2 en la aorta deenfermedad renal crónicaratas se correlacionó con genes marcadores osteogénicos. Además, SLC37A2 se expresó en el área de calcificación vascular enratas con enfermedad renal crónica. Como resultado, demostramos que SLC37A2 es una de las moléculas que aumentan concalcificación vascularin vitro e in vivo.

Palabras clave: SLC37A2,calcificación vascular, células del músculo liso aórtico,enfermedad renal crónica, hiperfosfatemia

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Como el número de pacientes conenfermedad renal crónica(ERC) aumenta, el número de pacientesrequiriendo diálisisaumentará también. La mayoría de las muertes en pacientes sometidos adiálisisse deben aenfermedades cardiovascularescomofalla cardiaca, trastornos cerebrovasculares, o infarto de miocardio. (,2) Una fuente importante deenfermedad cardiovasculares la calcificación ectópica,() una anomalía causada por la formación y depósito de cristales de fosfato de calcio en los tejidos blandos. (4 6) Varios factores como la inflamación. el estrés oxidativo y el aumento de los niveles plasmáticos de calcio (Ca) y fósforo (P) están implicados en la progresión de la calcificación vascular. Entre estos factores, la hiperfosfatemia se asocia más fuertemente con la calcificación vascular. (7.8) La hiperfosfatemia es causada por una ingesta excesiva de P en presencia de una función renal disminuida. Por lo tanto, los pacientes sometidos a diálisis deben limitar la ingesta de P. (79-12) Sin embargo, se ha informado quecalcificación vascularya está progresando cuando se inicia la diálisis; también se ha observado en pacientes con ERC en estadio temprano cuando la hiperfosfatemia no es evidente. (3) En consecuencia, es importante prevenir la calcificación vascular en pacientes con ERC en etapa temprana para mejorar el pronóstico de vida.

lo que conduce a un aumento del influjo de P en las células del músculo liso vascular (VSMC). La entrada de P se realiza a través de PiT-1, un transportador en la superficie de la membrana celular de las VSMC. PiT- es un miembro de la superfamilia de transportadores de solutos (SLC), que incluye un transportador de fosfato de sodio codificado por SLC20A1.04 PiT- transporta fosfato a través de membranas celulares dependientes de Na y posteriormente la mineralización de la matriz debido a niveles elevados de p.s) Como intracelular Los niveles de P aumentan, las VSMC comienzan a expresar factores de transcripción osteogénicos, como el factor de transcripción 2 relacionado con Runt (Runx2) (16). Este efecto es seguido por una mayor expresión de genes específicos de los osteoblastos, como la osteopontina y la osteocalcina. Además, redujo la expresión de proteínas específicas del músculo liso. como la proteína del músculo liso 22-0 (SM22-0), se produce. Como resultado, las VSMC se transforman en células similares a los osteoblastos. (1718) Estudios clínicos recientes han demostrado que los niveles de calcio en sangre. Las partículas de proteína (CPP), que representan partículas coloidales de fosfato de calcio, aumentan al disminuir la función renal. (19-21)Además, se han informado correlaciones con los niveles de CPP y P en sangre.2o2i) Es posible que el CpP pueda desencadenar la progresión de la calcificación vascular.22-24)

Sin embargo, se ha observado calcificación vascular en pacientes con ERC en etapa temprana con niveles normales de P en plasma. (13) Además, el ARNm de PiT-1 se expresa de forma ubicua en todos los tejidos. Por tanto, otra molécula puede actuar principalmente en el área de calcificación vascular. Hay informes queinflamaciónPromueve la calcificación vascular. Factores inflamatorios como la interleucina (IL)-1B, IL-6 y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) inducen la diferenciación de VSMC en células similares a los osteoblastos (2s26). El TNF-a induce la calcificación vascular. a través de la vía del AMPc, que desempeña un papel en la diferenciación de los osteoblastos.2728) La IL-6 regula varias vías que conducen a la calcificación vascular de las CMLV2-31) Además. IllB, IL-6 y TNF-a también son factores asociados con una mayor calcificación vascular inducida por niveles elevados de p.3233) Sin embargo. Los datos actuales no explican completamente el mecanismo de la vascularización.

calcificación inducida por estos factores. Presumimos que podría haber otras moléculas relacionadas con P, como las de la superfamilia SLC, involucradas en la calcificación vascular. Nos centramos en las proteínas de membrana de la superfamilia SLC e investigamos posibles moléculas candidatas relacionadas con P distintas de PiT-1 para su participación en la calcificación vascular. Además, examinamos la relación entre las moléculas candidatas y la calcificación vascular en video e in vivo.

Materiales y métodos

Cultivo de células. Las células del músculo liso humano órtico (AoSMC) se obtuvieron de Lonza (Basilea, Suiza). AoSMC se cultivó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las AoSMC se mantuvieron en un medio de crecimiento (medio basal de células de músculo liso suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 5%, factor de crecimiento epidérmico, insulina, factor de crecimiento de fibroblastos B y gentamicina/anfotericina B). Los medios se cambiaron cada dos días. Los AoSMC se cultivaron en una incubadora humidificada con 5% de CO2 a 37 grados y se mantuvieron hasta que se alcanzó la confluencia y luego se usaron en experimentos.

AoSMC calcificada. La calcificación de AoSMC se indujo como se describió anteriormente. 435) AOSMC se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 15 % de FBS y penicilina-estreptomicina y se cultivaron con P 2,6 mM durante 3, 6, 9, 12 y 14 días. La concentración de P se ajustó mediante el tampón P NaH, PO/Na y HPO. pH 7,2). Otras AoSMC no se cultivaron con P 2,6 mM.

Microarrays de ADN. Se utilizó ARN total de muestras de AoSMC cultivadas y no cultivadas con P 2,6 mM. Se analizó 5.0 ug de ARN total utilizando una micromatriz de ADN (Agilent Technologies, Tokio, Japón). SurePrint G3 Humano GE 8 x 60k ver. 2 Se utilizó un microarray para examinar alrededor de 26,000 genes. La relación se calculó dividiendo el nivel de expresión de AoSMC cultivado con 2,6 mM durante 12 días por el nivel de expresión de AoSMC no cultivado con P 2,6 mM.

microarrays de ADN

Se utilizó ARN total de muestras de AoSMC cultivadas y no cultivadas con P 2,6 mM. Se analizó 5.0 ug de ARN total utilizando una micromatriz de ADN (Agilent Technologies, Tokio, Japón). SurePrint G3 Humano GE 8 x 60k ver. 2 Se utilizó un microarray para examinar alrededor de 26,000 genes. La relación se calculó dividiendo el nivel de expresión en AoSMC cultivado con 2,6 mM durante 12 días por el nivel de expresión en AoSMC no cultivado con P.Expresión 2,6 mM de SLC37A2 en inflamación vascular. Para inducir una respuesta inflamatoria en AoSMC, las células se cultivaron con medio de crecimiento hasta que alcanzaron confluencia y luego se trataron con 1 ugml de lipopolisacáridos (LPS) (LPS de Escherichia coli O111:B4; Sigma, St. Louis, MO) durante 24 y 72 sin P 2,6 mM. No se cultivaron otras AoSMC con análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. El ARN total se extrajo de AoSMC tratados con LPS durante 24 y 72 h y de células no tratadas con LPS. La PCR cuantitativa en tiempo real basada en SYBR green se realizó utilizando ADNc sintetizado y un conjunto de cebadores apropiado para cada gen diana con un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: IL humana-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' y 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' y 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3' humano; Los niveles de expresión de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- y 5-CTTCTGGGIGGCAGGTGATGGC-3.IL-6 y SLC37A2 se calcularon después de la normalización con GAPDH. La expresión de SLC37A2 en calcificado AoSMC. El total se extrajo de AoSMC no cultivadas con P 2,6 mM y células AoSMC cultivadas con P 2,6 mM durante 3, 6, 9, 12 y 14 días. La PCR en tiempo real se realizó utilizando el ADNc sintetizado. Las secuencias de cebadores fueron las siguientes: siguiente: Runx2 humano, 5-TGAGAGCCGCTTTCCAACCC-3' y 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. Los niveles de expresión de ARNm de Runx2 y SLC37A2 se calcularon después de la normalización con APPH.

Análisis de transferencia Western.

La proteína total se recogió de muestras de AoSMC cultivadas en las mismas condiciones utilizadas para el análisis de PCR en tiempo real. Estas muestras se lisaron utilizando solución salina tamponada con Tris (pH 75) suplementada con 5 % de NP-40 y un cóctel de inhibidor de proteasa al 1 %. Las muestras de concentración de proteína se midieron utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo FisherScientific.Waltham, MA). y la concentración se ajustó mediante transferencia Western, se separaron 10 ug de proteína en un gel de poliacrilamida al 10% usando electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio. La membrana se trató con anticuerpo SLC37A2 (Novus Biologicals, Centennial, CO) o anticuerpo GAPDH (GeneTex, Irvine, CA) como anticuerpos primarios, se incubó con anticuerpo IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (R&D Systems, Minneapolis, MN) como anticuerpo secundario. y visualizado utilizando Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, Inglaterra) y un analizador de imágenes luminiscentes (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokio, Japón). La banda se cuantificó utilizando lmagel.

Experimental

Todos los protocolos del estudio fueron aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Ciencias Humanas y Medio Ambiente de la Universidad de Hyogo. Se compraron ratas Sprague-Dawley macho de doce semanas de edad de Japan SLC (Shizuoka, Japón). Las ratas se mantuvieron en un ciclo de 12-luz, 12-h de oscuridad (09:00-21:00) y se les permitió libre acceso a comida y agua extrapura.

Las dietas experimentales incluyen una dieta de control P (1,0% P, 0.6Ca, 20% proteína), una dieta con adenina (0.75% adenina , 1,0% P, 0.6%Ca, 2,5% proteína), una dieta baja en P (LP) (0.2% P,0 ,6% Ca, 10% proteína) y una dieta alta en P (HP) (1,0% P, 0,6% Ca, 10% proteína) basada en la dieta AIN93-G (Oriental Levadura, Tokio, Japón) con caseína como fuente de proteína.3637) Se ha informado que una dieta baja en proteínas promueve la calcificación vascular en ratas con insuficiencia renal inducida por adenina, por lo que se realizó una restricción de proteínas.3738)Antes de agrupar, todas las ratas (n=23) fueron alimentados con una dieta MF estándar (levadura oriental) durante una semana para aclimatarse. A las 13 semanas de edad, las ratas se dividieron en 2 grupos: el grupo control (n=5) y el grupo con ERC inducida por adenina (n=18). El grupo control recibió la dieta P control durante 6 semanas. . El grupo de ERC inducida por adenina recibió la dieta de adenina durante aproximadamente 3 semanas y luego se dividió en 2 subgrupos: el grupo CKD-LP (n=8) o el grupo CKDHP (n=10). Las ratas del grupo CKD-LP y del grupo CKD-HP recibieron la dieta LP y la dieta HP durante 3 semanas, respectivamente, durante el período experimental, la ingesta de alimentos se registró diariamente. Durante la dieta con adenina, se recogieron muestras de sangre de la vena de la cola entre las 10:00 a. m. y las 11:00 a. m. una vez por semana hasta la segunda semana y, posteriormente, una vez cada 2 días para controlar los niveles plasmáticos. Durante la dieta LP o la dieta HP, se recogieron muestras de sangre una vez por semana. Se recogieron muestras de orina y se registró el volumen de orina una vez por semana. Las ratas fueron sacrificadas con anestesia utilizando isoflurano (Wako Pure Chemical Industries. Osaka Japón) y laparotomías. Se recogieron muestras de sangre tomadas de la vena cava inferior y de la aorta toracoabdominal para su análisis.

Expresión de SLC37A2 en la aorta.

Aproximadamente un tercio de la aorta toracoabdominal recolectada se utilizó para visualizar la calcificación y realizar inmunotinción. La aorta se incluyó en parafina y se cortaron secciones de 4-um. Las secciones se tiñeron utilizando un kit del método Von Kossa para calcio (Polysciences. Warrington, PA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de inmunotinción se realizó con secciones seriadas. Las secciones se incubaron con anticuerpo SLC37A2 durante la noche a 4 grados y luego se trataron con Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Tokio, Japón) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las secciones se trataron con un kit de sustrato DAB (Nichirei).

El ARN total se extrajo del resto de la aorta toracoabdominal congelada. Se realizó una PCR en tiempo real utilizando el ADNc sintetizado. Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: osteopontina de rata, 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' y 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' y; SLC37A2 de rata,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' y 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. Los niveles de expresión de ARNm de osteopontina y ARNm de SLC37A2 se calcularon después de la normalización con GAPDH.

Análisis estadístico.

Los datos se presentan como media + SE. Las diferencias entre grupos se analizaron mediante la prueba t. En experimentos de AoSMC calcificados inducidos por fosfato, las diferencias se analizaron mediante un análisis de varianza unidireccional seguido del método de Dunnett. En los experimentos del modelo CKD, las diferencias se analizaron mediante la prueba de K ruskal-Wallis seguida del método Steel-Dwass. Los coeficientes de correlación (rs) se determinaron mediante la prueba de rango del coeficiente de correlación de Spearman. Para todas las pruebas. valores p de dos colas<0.05 were considered statistically significant.