Extracto metanólico de espinaca atenúa la degeneración retinal en ratas diabéticas

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Resumen:Se ha sugerido que el extracto metanólico de espinaca (SME) inhibe la formación de productos finales de glicación avanzada (AGE), que aumentan durante la progresión de la diabetes, por lo que es importante saber si los SME tienen efectos beneficiosos sobre la retina diabética. En este estudio, los ensayos in vitro mostraron que SME inhibe la glicación, la formación de grupos carbonilo y el agotamiento del grupo tiol reducido en la albúmina sérica bovina incubada con azúcares reductores o metilglioxal. También se estudió el efecto SME en retinas de ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina (STZ2) (n=10) en el grupo normoglucémico, STZ, ratas STZ tratadas con SME y ratas STZ tratadas con aminoguanidina (referencia anti-AGEs). grupo) durante 12 semanas. La retina fue seccionada e inmunoteñida para Ne-carboximetil lisina (CML), receptor RAGE, NADPH-Nox4, óxido nítrico sintasa inducible (iNOS),3-nitrotirosina (NT), NF-kB nuclear, factor de crecimiento endotelial vascular ( VEGF), proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína S100B y ensayo TUNEL. La peroxidación lipídica se determinó en toda la retina por los niveles de malondialdehído (MDA). Los resultados mostraron que en la retina diabética, SME redujo la colocalización de CML-RAGE, el estrés oxidativo (NOX4, iNOS, NT, MDA), la inflamación (NF-B, VEGF, S10B, GFAP) y la apoptosis (p<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">

Palabras clave:espinaca; retinopatía diabética; productos finales de glicación avanzada; estrés oxidativo; inflamación; RABIA; carboximetil L-lisina

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1. Introducción

Las dietas basadas en plantas se han asociado con un menor riesgo de desarrollar enfermedades crónicas como la obesidad, la diabetes tipo 2 y la enfermedad coronaria. La espinaca (Spinacia oleracea L.) es una verdura de hoja comestible consumida en todo el mundo debido a que proporciona una cantidad apreciable de fibras, vitaminas y minerales [1,2]. Se han identificado varios de sus fitoquímicos, incluidas las clorofilas, los carotenoides (luteína y zeaxantina) [3] y los compuestos fenólicos (flavonas, flavonoides, cumarinas) [4-8] (consulte el suplemento 1). Se ha informado que la espinaca, cuando se ingiere como alimento, extracto soluble en agua o en forma liofilizada, y sus tilacoides tienen propiedades anticancerígenas, antiobesidad e hipoglucemiantes [9]. El efecto antiinflamatorio de las espinacas se ha demostrado en modelos animales de endotoxemia, animales obesos y humanos sanos [9]. Su efecto antioxidante se estudió en células de carcinoma de próstata humano, modelos animales con obesidad, ratones irradiados con UV y adenocarcinoma de próstata de ratón transgénico [9,10]. Los efectos antiglicación y antiinflamatorios del extracto metanólico de espinaca (SME) se han estudiado en el modelo de diabetes inducida por glucosa en pez cebra y necrosis miocárdica inducida por isoproterenol en ratas, respectivamente [11,12]. SME disminuyó los niveles de hemoglobina glicosilada y fructosamina, incluidos los niveles de proteína glicosilada, al reducir la actividad de la aldosa reductasa en el cristalino [11]. Los hallazgos anteriores sugieren que las PYME podrían tener un efecto preventivo sobre la progresión de las complicaciones de la diabetes mellitus, como la retinopatía diabética (RD).

La DR conduce progresivamente a la pérdida de agudeza visual o ceguera que se ha relacionado con la inflamación, el estrés oxidativo y la acumulación de productos finales de glicación avanzada (AGE) [13,14]. Los AGE inducen el entrecruzamiento de proteínas, alterando la estructura/función y su recambio/aclaramiento. Los AGE se pueden producir mediante una reacción no enzimática entre la glucosa con un grupo amino libre de proteínas, formando intermediarios reversibles como las bases de Schiff y los productos de Amadori (fructosamina)[15]. Otros mecanismos para la formación de AGE incluyen la vía del "estrés de carbonilo", donde la oxidación de azúcares y lípidos crea compuestos intermedios de dicarbonilo como el glioxal y el metilglioxal (MGO), que conducen a la formación de AGE como N:-carboximetil lisina (CML) [ dieciséis]. El aumento de los niveles de LMC en suero y vítreo puede ser un marcador bioquímico tanto de la aparición como de la progresión de la RD [17,18]. En la retina, la activación del receptor RAGE por AGEs (AGEs-RAGE) induce la sobreexpresión de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y factores proinflamatorios, regulados por el factor nu-clear kappa-light-chain-enhancer de B activado células (NF-kB) [19]. NF-kB regula positivamente la expresión de RAGE al actuar como un mecanismo de retroalimentación positiva [20].que es la cistanchePor otro lado, altas concentraciones de S100B, una proteína de unión al calcio, también pueden activar NF-kB, induciendo neuroinflamación y activación de células gliales [21]. La sobreexpresión de S100B en astrocitos provoca efectos neurotóxicos manifestados por astrogliosis retiniana [22].

Cistanche puede antienvejecimiento

Se han desarrollado estrategias experimentalmente para prevenir el daño en la retina. Algunos fitoquímicos de las espinacas aisladas de otras plantas se han asociado con la inhibición de los AGE y el estrés oxidativo [8,23-26]. La luteína, la astaxantina y el kaempferol han protegido las células del epitelio pigmentario de la retina derivadas de humanos (ARPE-19) del daño a través de sus propiedades anti-AGE, antioxidantes y antiapoptosis [26-28]. Estos resultados sugieren que los fitoquímicos de la espinaca tienen un papel relevante en la prevención de la degeneración retiniana como la RD. Otra estrategia ha sido el uso de aminoguanidina (AG) como un potente inhibidor de la glicación y la actividad de iNOS, atenuando la acumulación de LMC y la formación de precursores dicarbonílicos reactivos en ratas [29]. Sin embargo, en un ensayo clínico multicéntrico y aleatorizado con 690 pacientes diabéticos, no se estableció claramente el efecto beneficioso [30].

Los cambios en la degeneración retiniana en condiciones de hiperglucemia han sido escasamente estudiados. Por lo tanto, es interesante saber si SME protege las capas de la retina del daño relacionado con sus propiedades anti-AGE, antioxidantes y antiinflamatorias en la retina de ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina.

2. Materiales y métodos

2.1.Elaboración del Extracto Metanólico de Espinaca (SME)

Las hojas frescas de espinaca (S.oleracea L.) fueron cosechadas en la temporada otoño-invierno en un campo agrícola de la provincia de Puebla, México, e identificadas por un botánico en el herbario del Instituto Politécnico Nacional (IPN, Ciudad de México, DF). México). El ejemplar comprobante número 4532 fue depositado en el herbario de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN.

Las hojas fueron deshidratadas y finamente molidas. Las hojas secas se maceraron con metanol a temperatura ambiente, se filtraron a través de filtros de celulosa (Whatman, Maidstone, Reino Unido) y se secaron usando un evaporador de vacío rotatorio (BUCHI Rotavapor R{{0}}, Suiza) a 45 grados a producir una goma verde (95,0 g/kg de hojas secas).Cistanche antiedadEl SME se almacenó en la oscuridad a 4 grados hasta su uso. Para todos los ensayos, el extracto se reconstituyó en agua destilada[11].

2.2.Ensayos in vitro de la actividad antiglicación de SME

2.2.1. Formación de productos finales de glicación avanzada derivados de albúmina de suero bovino (BSA-AGE)

El ensayo BSA-AGEs se llevó a cabo, como se describió anteriormente [31]. Brevemente, se agregó 10 mg/mL de BSA (fracción V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) en D-glucosa 0.5 M, D-fructosa {{12 }},5 M, o metilglioxal 2,5 mM, y se prepararon en una solución de 0,1 M PBS (pH 7,4) y azida sódica al 0,02 por ciento. Se agregaron concentraciones de SME (5, 10, 25, 50, 100 y 200 mg/mL) a cada mezcla y luego se incubaron a 37 grados durante 4 semanas. Posteriormente, los azúcares sin reaccionar se eliminaron por diálisis contra agua destilada durante dos días a 4 grados. Los niveles de BSA-AGE se determinaron mediante espectrofotometría de fluorescencia (Ex370/Em 440 nm; modelo LS 30, PerkinElmer LAS Ltd., Buckinghamshire, Reino Unido) [32]. La glicación de la proteína BSA mediante azúcares reductores y MGO fue un control positivo (BSA glicada), mientras que la incubación de BSA glicada con aminoguanidina (1 mg/mL) se utilizó como control negativo (BSA glicada-AG). Los ensayos se realizaron por triplicado.

2.2.2. Ensayo de fructosamina

El nivel de fructosamina se determinó mediante el ensayo de nitro azul tetrazolio (NBT) [33], que se basa en la capacidad de la fructosamina para reducir la NBT, formando formazán, un producto final coloreado en condiciones alcalinas. Diez microlitros de cualquiera de los controles o concentraciones de SME incubadas con BSA glicosilada (BSA-SME) se agregaron a 90 μL de NBT a 2,5 mM, preparado en un tampón de carbonato (0,1 M; pH 10,3); todos fueron incubados a 37 grados C durante 30 min. Se midió la absorbancia a 530 nm. Las concentraciones de fructosamina (nmol/mg) se calcularon según una curva estándar de formazán.

2.2.3. Determinación de la formación de grupos carbonilo y agotamiento de grupos tiol en BSA-AGE

La concentración de grupos carbonilo se midió en BSA-SME y muestras de control, según Levine et al. [34]. Se añadió una solución de 2,4-dinitrofenilhidracina (DNPH; 10 mM) en 400 μL de HCl 2,5 M a 100 μL de cada muestra y se incubó en la oscuridad durante 60 min a temperatura ambiente.beneficios de la cistancheLuego, se agregaron 500 μL de ácido tricloroacético (20 por ciento p/v) y se mantuvo en hielo durante 5 min. Las muestras se centrifugaron a 4000 rpm durante 15 min y el sedimento de proteína se lavó tres veces con acetato de etilo/etanol (1:1 v/v). Posteriormente, las muestras se suspendieron en 250 μL de clorhidrato de guanidina a 6 M. La concentración de grupos carbonilo (nmol/mg de proteína) se calculó por espectrofotometría a 370 nm de absorbancia (EON, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, EE. UU.) usando el coeficiente de absorción de DNPH (22.000 M-1 cm-1).

De acuerdo con el método de Ellman, se realizó la determinación del agotamiento del grupo tiol en BSA-SME y muestras de control. Brevemente, 10 μL de 5,5'-Disulfanediylbis (2-ácido nitrobenzoico) (DNTB; 10 mM, preparado en PBS) con 50 μL de muestras glicosiladas se incubó durante 15 min a temperatura ambiente, luego se midió la absorbancia a 410 nm. El nivel de grupos tiol libres se calculó mediante una curva estándar de L-cisteína (0,4-11 μM) y se expresó en nmol/mg de proteína [34].

2.3. Efecto de SME en la retina de ratas diabéticas 2.3.1. Inducción de diabetes en ratas

Se utilizaron ratas Wistar macho con un peso de 250± 10 gr(N=40) en ayunas de 8 h. Se administró una dosis intraperitoneal de estreptozotocina (60 mg/kg) en tampón citrato (10 mM, pH 4,5) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, EE. UU.) [35]. Tres días después, se midió el nivel de glucosa (glucómetro; ACCU-CHEK active; Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Alemania) mediante la recolección de una gota de una muestra de sangre de la cola. Para el estudio se reclutaron animales con niveles de glucemia superiores a 350 mg/dl. La glucosa en sangre se midió semanalmente durante 12 semanas.

2.3.2. Diseño experimental

Las ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina (STZ) se dividieron aleatoriamente en los siguientes grupos (n =10): STZ tratadas por vía intragástrica con 2 ml de agua potable (STZ); STZ tratado con SME a 400 mg/kg (STZ-SME); ratas normoglucémicas (NG); y STZ tratado con 50 mg/kg de aminoguanidina (AG; Sigma-Aldrich, Inc.) (STZ-AG). Se utilizó STZ-AG como grupo de referencia anti-AGE. Las dosis asignadas se administraron cada 24 h (9:00 am) durante 12 semanas. El nivel glucémico en todos los grupos se controló semanalmente. El régimen de dosificación de SME a 400 mg/kg se basó en lo siguiente: se obtienen 7 g de SME a partir de 100 g de espinacas frescas (datos no mostrados). Esta cantidad equivale al consumo diario de una persona promedio de 70 kg en la dieta americana [36], lo que corresponde a 100 mg de extracto/kg de peso corporal.Extracto de Cistanche Anti RadiaciónPor otro lado, debido a la diferencia en el metabolismo acelerado de las ratas, se recomienda aumentar el consumo de cualquier extracto natural hasta 6,4 veces para estudios comparativos con humanos [37]. La dosis de 400 mg/kg que utilizamos se basó principalmente en los resultados obtenidos en un modelo de necrosis miocárdica inducida en ratas Wistar, que mostró que el efecto antiinflamatorio de SME es más significativo a 300 mg/kg [12].

2.3.3. Evaluaciones Histológicas e Inmunohistoquímicas

Los ojos enucleados se fijaron en formalina neutra y luego se deshidrataron en alcoholes graduados y se incluyeron en parafina. Las secciones histológicas de 2 μm se montaron en portaobjetos electrocargados, se desparafinaron y se rehidrataron hasta solución de recuperación de antígeno (K035; tampón de citrato 10x, pH 6; Diagnostic BioSystems, Pleasanton, CA, EE. UU.). Se utilizó un sistema de inmunodetección basado en polímeros (sistema de detección PolyVuemouse/rabbit DAB, Diagnostic BioSystems). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: proteína ácida fibrilar glial (anti-GFAP;MAB360; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, EE. UU.); factor de crecimiento endotelial vascular (anti-VEGF;sc-7269; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, EE. UU.), proteína B fijadora de calcio S100 (anti-S100B; ab52642; Abcam PLC, Cambridge, Reino Unido) y potenciador de la cadena ligera kappa del factor nuclear de las células B activadas (anti-NF-kB p65; sc-8008). Todas las diluciones fueron a 1:200 y se incubaron durante la noche a 4 grados. Se añadió un anticuerpo secundario (Ratón/Conejo PolyVueTM) según las instrucciones del proveedor.hierba de cistancheLas secciones se tiñeron con DAB plus/sustrato cromógeno y hematoxilina. Las observaciones histológicas y la captura de imágenes se realizaron en un microscopio Carl Zeiss (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemania).

Para la tinción de inmunofluorescencia, los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 grados C con los siguientes anticuerpos primarios: carboximetil lisina (anti-CML; ab124145; Abcam PLC, Cambridge, Reino Unido), receptor AGE (anti-RAGE; sc-365154), NADPH oxidasa 4 (anti-Nox4;ab133303), 3-nitrotirosina (anti-NT; ab110282) y óxido nítrico sintasa (inducible)(anti-iNOS; A00368-1);Boster Bio, Pleasanton, CA , EE.UU). Luego, se usaron los siguientes anticuerpos secundarios: para anti-RAGE, cabra anti-ratón IgG(FITC)-conjugado (1:200; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.); para anti-CML y anti-NT, IgG-PE de ratón anti-conejo (SC-3753); y para anti-iNOS y anti-Nox4, m-IgGkBP-PE (Sc-516141). Todos fueron incubados a temperatura ambiente durante 60 min. Posteriormente, las secciones se montaron en un medio que contenía diclorhidrato de 4',6-diamidina-2'-fenilindol (DAPI). Los anticuerpos anti-CML y anti-RAGE se cohibridaron en el mismo portaobjetos. Se utilizó FLoidTM Cell Imaging Station (Life technologies Carlsbad, San Diego, CA, EE. UU.) para las imágenes de fluorescencia.

2.3.4.Evaluación de la apoptosis

La apoptosis de las células de la retina se detectó de acuerdo con el manual descrito por la desoxiuridina trifosfato (dUTP) mediada por desoxiuridina trifosfato (dUTP) terminal (TUNEL) utilizando el kit de detección de muerte celular in situ, TMR (tetrametil rodamina){{ 3}}dUTP) rojo, versión 12 (12156792910; Roche Diagnostics). Brevemente, los portaobjetos desparafinados se rehidrataron y se enjuagaron dos veces con PBS. Luego, se incubaron con la mezcla de reacción TUNEL en atmósfera húmeda durante 60 min a 37 C. Posteriormente, las secciones se montaron con DAPI y se observaron en microscopía de fluorescencia (FLoidTM Cell Imaging Station). El IOD para TUNEL se calculó para las capas de la retina.

2.3.5. Ensayo de peroxidación lipídica

Para la evaluación de los niveles de malondialdehído (MDA) en el tejido de la retina, se homogeneizaron y procesaron aproximadamente 3 mg de tejido fresco (n=3) como se informó anteriormente [38]. Los niveles de MDA se cuantificaron siguiendo las instrucciones del proveedor del kit (kit de ensayo OXItek-TBARS, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, EE. UU.).

2.4.Análisis estadístico

Para el análisis estadístico, todas las micrografías retinales se capturaron con una magnitud de 200× a 100 μm más allá de la región del nervio óptico. Se analizaron aproximadamente 40 imágenes por grupo de animales (n=7). El análisis de imágenes se realizó con el software Image-Pro Premier Versión 9.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, EE. UU.). Utilizamos el software GraphPad Prism (La Jolla, CA, EE. UU.; versión 8.0). Las figuras muestran valores graficados en diagramas de caja y patillas (mediana, primer-tercer cuartil, valor mínimo-máximo) para la capa de células ganglionares (GCL), la capa nuclear interna (INL) y la capa nuclear externa (ONL). La media y la desviación estándar (media ± SD) se muestran en el Apéndice A (Tablas A1-A3). En todos los casos se realizó una prueba de ANOVA de una vía seguida de la prueba de Tukey. pags<0.05 was="" considered="" statistically="">