Estudio de los efectos antienvejecimiento del calcitriol en células asesinas naturales humanas in vitro Ⅱ

3. Resultados

Este estudio se centró en los efectos antienvejecimiento del calcitriol en las células NK. Los resultados mostraron que el calcitrioldisminuyó la expresión de biomarcadores relacionados con el envejecimiento, incluido CD16, TIM3, PD-1, KIR yaumentó la expresión de NKG2A de las células NK. tambiéninhibió la proliferación de células NKyarrestarlos en la fase G1. calcitrioldisminución de la liberación de factores inflamatorioscomo IL-5, IL-13, IFN- y TNF- y tenían ciertosefectos antioxidantes, que podría contribuir a suefectos antienvejecimiento.

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3.1 El calcitriol revirtió la expresión de los marcadores de envejecimiento superficial, ralentizó la amplificación de las células NK y mantuvo las células NK en la fase G1.

Las células NK senescentes mostraron una alta expresión de biomarcadores relacionados con el envejecimiento, como CD16, PD-1, TIM3 y KIR, y una baja expresión de NKG2A. Encontramos que los niveles de expresión de los biomarcadores relacionados con el envejecimiento NKG2A (Figura 1a) (*P < 0.05) aumentaron, mientras que la expresión de CD16 (Figura 1b), TIM3 (Figura 1c ), PD-1 (Figura 1d) y KIR (Figura 1e) (*P < 0,05) disminuyeron después del tratamiento con calcitriol durante 72 h. Los efectos de reversión se correlacionaron positivamente con la concentración de calcitriol (Figura 1 complementaria).

Expandimos las células de las muestras de sangre periférica humana in vitro. Luego, aislamos las células NK (CD{{0}}CD56 plus) mediante clasificación de perlas magnéticas (figura 1f). A continuación, las células NK clasificadas se cultivaron con diferentes concentraciones de calcitriol o rapamicina durante 72 h. Los resultados de la tinción con CCK8 mostraron que la tasa de crecimiento de las células NK de alta concentración tratadas con calcitriol (10− [7] M) fue más lenta que la del grupo de control negativo (NC) (*P < {{17 }}.05) (Figura 1g). Además, el calcitriol reguló el ciclo de las células NK. Después del tratamiento con calcitriol durante 48 h, las células NK mostraron un alto cambio dependiente de la concentración de calcitriol hacia la fase G1 (*P < 0,05), mientras que la proporción de células en la fase G2 (#P < 0,05) disminuyó. La proporción de células NK tratadas con calcitriol en la fase S no mostró cambios, independientemente de la concentración de calcitriol (Figura 1h, Figura complementaria 2). Luego probamos si esta detención de la fase G1 derivada del calcitriol indujo la apoptosis de las células NK y descubrimos que el biomarcador apoptótico de las células NK, la inmunoglobulina de las células T y el dominio del motivo inhibidor basado en tirosina (ITIM) del inmunorreceptor (TIGIT), no mostraron cambios significativos (P> 0.05 , NS) (Figura 1i). Estos resultados implicaron que la adición de calcitriol redujo la tasa de crecimiento de las células NK, disminuyó su proliferación e indujo la detención de la fase G1 de las células NK en lugar de causar apoptosis.

3.2 El calcitriol disminuyó la liberación de citoquinas inflamatorias en las células NK e inhibió la citotoxicidad de las células NK

La inflamación es una inflamación crónica de bajo grado. Acelera el envejecimiento de las células NK, ya que las células NK participan en esta inflamación crónica. La Figura 2a demuestra que los niveles de IL-5, IL-13, IFN- y TNF- disminuyeron significativamente en todos los grupos que en el control negativo (*P < 0.05). IFN- y TNF- son citocinas proinflamatorias bien conocidas, pero algunos estudios también han demostrado las propiedades proinflamatorias de la IL-5. Se ha informado que la IL-13 contribuye a diferentes tipos de inflamación de la mucosa, como el asma alérgica, la colitis ulcerosa, la esofagitis eosinofílica y varias enfermedades relacionadas con la fibrosis.

Sin embargo, la citotoxicidad de las células NK implica principalmente la liberación de citocinas inflamatorias y la desgranulación de las células. Marcamos las células K562 con DIO y cocultivamos las células DIO-K562 con células NK tratadas con calcitriol durante 4 h. El porcentaje de DIO más PI más células fue menor en todos los grupos de relación efector (E)/objetivo (T) que en el control negativo (*P < 0.05) (Figura 2b, C). La expresión deducida del grupo de diferenciación 107 (CD107) indicó una desgranulación más baja (* P <0.05) (Figura 2d). Estos resultados muestran la inhibición de la función de eliminación de NK por parte del calcitriol.

3.3 El calcitriol activó la expresión de SIRT1- ∆Exon8 y la vía SIRT1/pERK relacionada con el antienvejecimiento

Para investigar los efectos antienvejecimiento del calcitriol en las células NK, detectamos las vías de señalización relacionadas con el envejecimiento mediante inmunotransferencia. Se realizó un análisis de transferencia Western para evaluar los niveles de expresión de VDR, SIRT1-∆Exon8, SIRT1 y PERK en las células NK tratadas con calcitriol. El análisis estadístico mostró que el calcitriol activaba el eje VDR/SIRT1/pERK a altas concentraciones. Por su parte, el calcitriol activó la expresión de SIRT1-∆Exon8 (*P < 0.05). (Figura 3a).

Figura 1. Fenotipo relacionado con el envejecimiento, expansión celular y análisis del ciclo celular de las células NK. (ae) Las células NK humanas tratadas con calcitriol o rapamicina durante 72 h mostraron los siguientes biomarcadores celulares: miembro A del grupo 2 natural killer (NKG2A), grupo de diferenciación 16 (CD16), inmunoglobulina de células T y proteína 3 que contiene el dominio de mucina ( TIM3) muerte celular programada-1 (PD-1), y receptor tipo inmunoglobulina asesina (KIR), que estaban relacionados con el envejecimiento. Se usó rapamicina 50 nM (RAPA) como control positivo. n=3 para cada grupo. *P < 0.05 y **P < 0.01 se compararon con el grupo de control negativo (NC). (f) Células NK (derecha) aisladas de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC, izquierda) mediante clasificación de perlas magnéticas. ( g ) Análisis de proliferación celular medido por el kit de recuento de células 8 (CCK8). (h) Efecto de calcitriol o rapamicina en el ciclo celular en células nk clasificadas después del tratamiento durante 72 h, wp 0.0, 0.05, y fp < 0.05 indicaron el significativo diferencias en las fases G1, S y G2, respectivamente. Todos los grupos se compararon con NC, respectivamente. norte=3. ) El porcentaje de células NK positivas para el dominio del motivo inhibidor (M) basado en tirosina (TGI) y inmunoglobulina de células T después del tratamiento con calcitriol o rapamicina durante 72 h. *p < 0,05 y **p < 0,01 se compararon con NC. norte=3.

3.4 El calcitriol resistió el envejecimiento de las células NK inducido por el estrés oxidativo in vitro

Está ampliamente aceptado que el envejecimiento es causado por la acumulación de daño oxidativo debido a la gran cantidad de evidencia encontrada a lo largo de los años [31]. Cultivamos las células NK con diferentes concentraciones de H2O2 durante 24 h y encontramos que 1{{1{{20}}}}0 μM era la concentración más cercana a la dosis letal media (LD50) (Figura 3b) . La expresión de TIM3 en la población de células NK aumentó con la adición de H2O2, mientras que la expresión disminuyó después del tratamiento con calcitriol (*P < 0,05) (Figura 3c). Además, las células NK envejecidas se tiñeron de azul en presencia de -galactosidasa. Este color azul de las células es un sello específico de las células senescentes. El análisis estadístico demostró que las células NK no tratadas tienen menos actividad de galactosidasa celular, mientras que las células NK expuestas a H2O2 mostraron una actividad de galactosidasa elevada. El calcitriol redujo la población positiva para -galactosidasa, lo que indica la presencia de menos células envejecidas (*P < 0,05) (Figura 3d). También se ha observado una disminución del potencial de la membrana mitocondrial en una variedad de células envejecidas de varias especies de mamíferos. Evaluamos el potencial de membrana mitocondrial de las células NK en este estudio. Los resultados estadísticos mostraron que el H2O2 disminuyó significativamente la actividad celular de las células NK en comparación con la de las células no tratadas, mientras que el calcitriol aumentó el daño causado por el H2O2 (*P < 0,05) (Figura 3e).

Figura 2. Efectos del calcitriol sobre las funciones de las células NK. ( a ) Análisis de la citocina liberada por las células NK tratadas con calcitriol en 48 h. b) Los resultados de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) mostraron células K562 muertas marcadas con 3,3 -octadecil-oxacarbocianinaDlO) y yoduro de propidio (P). Las células K562 se cocultivaron con diferentes proporciones de células Nk tratadas con calcitriol. durante 4 h. (C) Análisis FACS de células K562 muertas en ensayos de destrucción. ( d ) Los efectos de desgranulación de las células Nk tratadas en ensayos de destrucción. n=3 para cada grupo. *p < 0.05 y **p < 0,01 se compararon con NC

3.5 El calcitriol resistió la apoptosis de las células NK inducida por estrés oxidativo in vitro

A continuación, medimos el número de células apoptóticas. Los resultados de la citometría de flujo mostraron que el tratamiento con 100 μM de H2O2 durante 24 h condujo a una apoptosis significativa de las células NK. Sin embargo, el tratamiento con calcitriol disminuyó la tasa de apoptosis (*P < 0,05) (Figura 4a). Todos los resultados anteriores demostraron la resistencia del calcitriol frente al estrés oxidativo provocado por el H2O2. Sin embargo, detectamos proteínas apoptóticas en células NK bajo estrés oxidativo. Antes del tratamiento con H2O2, se añadió calcitriol 10-[7] M a las células NK durante 24 h. Los niveles de proteínas relacionadas con la apoptosis, caspasa-3 p17 y caspasa-3 p20, aumentaron significativamente después del tratamiento con H2O2. El calcitriol disminuyó la apoptosis derivada de H2O2-y reguló a la baja la expresión de caspasa-3, p17 y caspasa-3p20 (*P < 0,05) (Figura 4b). Estos resultados indicaron que el calcitriol resistió la apoptosis inducida por H2O2.

Figura 3. Elefectos antienvejecimientode calcitriol en células NK. (a) La expresión del receptor de vitamina D (VDR), la sirtuina 1 (SIRT1), SIRT1- ∆Exon8 y la quinasa del retículo endoplásmico tipo R (pERK) de la proteína quinasa en células NK se detectó mediante análisis de transferencia Western tras tratamiento con calcitriol durante 48 h. Se usó gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control de carga. Diagrama de barras que ilustra los resultados del Western Blot (n=3). *P < 0.{{10}}5 y **P < 0.01 se compararon con NC (n=3). (b) Curva de mortalidad por dosis de células NK después del tratamiento con peróxido de hidrógeno (H2O2) durante 24 h. ( c ) Porcentaje de células TIM3 que exhiben alta expresión después del tratamiento con H2O2 100 μM durante 24 h. ( d ) Los resultados del análisis y la tinción con galactosidasa asociada a la senescencia. Las células senescentes se tiñeron de azul y se indicaron con flechas rojas. Barra de escala, 50 μm. ( e ) Las células NK se tiñeron con Hoechst y clorometil-X-rosamina (CMXRos) para determinar la ubicación de la célula y el potencial de la membrana mitocondrial. Las células envejecidas y apoptóticas fueron Hoechst más CMXRos− y se indicaron con flechas blancas. Barra de escala, 50 μm. El análisis estadístico mostró una intensidad de fluorescencia relativa. *P < 0,05 y **P < 0,01 se compararon con el grupo H2O2 en las figuras C, D y E (n=3).

Figura 4. Los efectos antiapoptóticos del calcitriol sobre las células NK. (a) Efectos antiapoptóticos del calcitriol en lesiones inducidas por H2O2-. El análisis FACS mostró el porcentaje de células NK apoptóticas después del tratamiento con H2O2 100 μM durante 24 h. (b) Los niveles de expresión de caspasa-3 p20 y caspasa-3 p17 en células NK se detectaron mediante análisis de transferencia Western después del tratamiento con H2O2 100 μM durante 24 h. Se usó GAPDH como control de carga. Diagrama de barras que ilustra los resultados del Western Blotting (n=3). *P < 0,05 se comparó con el grupo H2O2.

4. Discusión

La interacción a largo plazo entre la inflamación y el estrés oxidativo es un factor importante en el envejecimiento. Además, la inflamación y el estrés oxidativo son sinérgicos [32]. El exceso de ROS generado por el estrés oxidativo ataca las células del cuerpo. Durante este proceso, el sistema inmunitario activado libera factores inflamatorios para matar las células anormales, lo que conduce a una mayor generación de ROS. La falta de calcitriol puede causar enfermedades autoinmunes, enfermedades metabólicas crónicas y tumores. Sin embargo, se sabe poco sobre los efectos antienvejecimiento del calcitriol en el sistema inmunitario, especialmente en las células NK.

En este estudio, investigamos los efectos antienvejecimiento del calcitriol en las células NK. Encontramos que el calcitriol aumentó la expresión de NKG2A, mientras que disminuyó la expresión de KIR in vitro. La subpoblación de células NK CD56− CD16 plus, que se sabe que está relacionada con la inflamación crónica, aumenta significativamente en los ancianos [33]. Por lo tanto, la reducción en la expresión de CD16 inducida por calcitriol podría atribuirse a su efecto antiinflamatorio. Se ha informado que TIM-3 y PD-1 son los receptores inhibidores y de agotamiento de las células NK. Nuestro estudio mostró que cal citriol regulaba a la baja los niveles de expresión de TIM-3 y PD-1 y prevenía la apoptosis de las células NK.

Además, el calcitriol inhibió la expansión de las células NK y mantuvo la población de células NK en fase G1 in vitro. Sin embargo, las células en la fase S no se vieron afectadas. TIGIT, que se conoce como factor de control de las células NK, permaneció sin cambios. Estos resultados indicaron que Figura 4. Los efectos antiapoptóticos del calcitriol en las células NK. (a) Efectos antiapoptóticos del calcitriol en lesiones inducidas por H2O2-. El análisis FACS mostró el porcentaje de células NK apoptóticas después del tratamiento con H2O2 100 μM durante 24 h. (b) Los niveles de expresión de caspasa-3 p20 y caspasa-3 p17 en células NK se detectaron mediante análisis de transferencia Western después del tratamiento con H2O2 100 μM durante 24 h. Se usó GAPDH como control de carga. Diagrama de barras que ilustra los resultados del Western Blot (n=3). *P < 0,05 se comparó con el grupo H2O2. El calcitriol BIOENGINEERED 6851 no condujo a la muerte de las células NK, pero solo redujo la tasa de expansión de las células NK.

Es bien sabido que la inflamación conduce a la inmunosenescencia [34,35]. Además, encontramos que el calcitriol redujo los niveles de IL-5, IL-13, IFN- y TNF- en las células NK. La citotoxicidad de las células NK está mediada en parte por la liberación de factores inflamatorios [36]. Además, hubo una disminución en la mortalidad de las células tumorales K562 y la desgranulación de las células NK. Estos resultados estuvieron en línea con nuestras expectativas. La rapamicina es un fármaco bien conocido que reduce la tasa metabólica para prevenir el envejecimiento[37] y se utiliza como control positivo en este estudio. Produce inmunosupresión y aumenta el riesgo potencial de tumor y la carga tumoral. Esta carga se ha confirmado en modelos de cáncer de mama en ratones [38]. Se desconoce si el calcitriol exhibe efectos similares a los de la rapamicina. Se deben realizar más estudios clínicos y en animales para verificar sus efectos en el cuerpo humano.

Finalmente, estudiamos los efectos del calcitriol sobre la senescencia antioxidante. El resveratrol, un conocido fármaco antienvejecimiento, puede regular a la baja la vía NF-κB activando el eje SIRT1/PERK. También se ha demostrado que esta regulación a la baja es beneficiosa en los trastornos neurodegenerativos y las enfermedades cardiovasculares [39]. La desacetilación de SIRT1 está asociada con el control metabólico y la biogénesis mitocondrial. En este tipo de regulación, los niveles elevados de SIRT1 pueden promover la acumulación del coactivador gamma del receptor activado por el proliferador de peroxisomas-1 alfa (PGC-1 ) en el núcleo, lo que resulta en la transcripción de genes que son necesarios para función mitocondrial [40]. Además, SIRT1 suprime el objetivo de los mamíferos de la vía de señalización de la rapamicina (mTOR), que puede proteger los nervios y resistir el envejecimiento cerebral en ratones [41]. En este estudio, identificamos una vía reguladora similar para el calcitriol. El calcitriol activó SIRT1 a través de VDR y elevó el eje SIRT1/pERK.

Además, encontramos que el calcitriol regulaba al alza la expresión de SIRT1-∆Exon8. Las tensiones se conocen como un factor de regulación positiva de SIRT1-∆Exon8. Aunque SIRT1-∆Exon8 en sí muestra una actividad de desacetilación de p53 reducida, ejerce un efecto de desacetilación aditivo en p53 cuando se expresa junto con SIRT1 de longitud completa [42]. Este efecto indicó la función antiapoptótica del calcitriol en las células NK. Sin embargo, queda por comprender mejor el papel de SIRT1-∆Exon8 en las vías relacionadas con la edad. Dado que la disminución de SIRT1 podría deberse al daño oxidativo [43], establecimos un modelo de células NK de envejecimiento agudo in vitro utilizando H2O2. El envejecimiento oxidativo inducido por H2O2 aumentó la expresión de TIM3 así como la actividad de -galactosidasa en células NK. Encontramos que el calcitriol resistió el daño oxidativo y mantuvo la actividad mitocondrial y la viabilidad celular de las células NK mientras prevenía la apoptosis celular. Sin embargo, el calcitriol aún no se ha identificado como un fármaco antienvejecimiento en la medicina clínica, ya que se necesitan más pruebas sobre los efectos antienvejecimiento de este fármaco in vivo. En resumen, proporcionamos evidencia preliminar para implicar los efectos antienvejecimiento del calcitriol en las células NK in vitro. Creemos que los efectos de este fármaco deben explorarse más a fondo en futuros estudios clínicos y con animales.

5. Conclusión

En este estudio demostramos laefectos antienvejecimientode calcitriol en células NK. El calcitriol invirtió la expresión debiomarcadores de envejecimientosobre células NK. Ralentizó la amplificación de NK y los mantuvo en fase G1. Además, el calcitriol inhibía la liberación de citocinas inflamatorias y reducía la desgranulación de las células NK. La activación del eje SIRT1-∆Exon8 y VDR/SIRT1/pERK por parte del calcitriol podría ser el mecanismo principal del efecto antienvejecimiento del calcitriol basado en todo lo anterior. Finalmente, el calcitriol resistió la senescencia oxidativa de las células NK in vitro. Los estudios adicionales deben centrarse en la investigación clínica y con animales.

Reflejos

(1) El calcitriol disminuyó la expresión de biomarcadores relacionados con el envejecimiento, incluidos CD16, TIM3, PD-1, KIR, y aumentó la expresión de NKG2A de las células NK. (2) El calcitriol pudo inhibir la proliferación de células NK y detenerlas en la fase G1. (3) El calcitriol disminuyó la liberación de los principales factores inflamatorios como IL-5, IL-13, IFN- y TNF- de las células NK.(4) El efecto antienvejecimiento del calcitriol en las células NK puede lograrse a través de la vía de señal Sirt1- pERK.

Agradecimientos Nos gustaría agradecer a todos los miembros del personal de nuestro grupo por su apoyo y al Comité de Innovación Científica y Tecnológica de Shenzhen por su apoyo financiero para este estudio.

Financiamiento Este trabajo fue apoyado financieramente por el Comité de Innovación de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (JCYJ20170412155231633), el Fondo de Construcción de Disciplina Médica Clave de Shenzhen (No. SZXK062), Chengdu Wecistanche Biotech y el Proyecto de Medicina Sanming en Shenzhen (No. SZSM202011010); Comité de Innovación en Ciencia y Tecnología de Shenzhen [JCYJ20170412155231633]; Fondo de Construcción de Disciplina Médica Clave de Shenzhen [No. SZXK062]; Proyecto Sanming de Medicina en Shenzhen [No. SZSM202011010].

Aprobación ética Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Popular de Shenzhen Luohu (ZLNK 12/2019, Shenzhen, China). Se obtuvo el consentimiento informado para la experimentación con muestras humanas.

Declaración de divulgación Todos los autores aprobaron la presentación de este manuscrito. Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia ni relaciones personales conocidas que pudieran haber influido en el trabajo que se presenta en este documento.

Referencias

[1] Ovadya Y, Landsberger T, Leins H, et al. La vigilancia inmunológica deteriorada acelera la acumulación de células senescentes y el envejecimiento. Nat Comun. 2018;9 (1):5435.

[2] López-Otín C, Blasco MA, Partridge L, et al. Las señas de identidad del envejecimiento. Celúla. 2013;153:1194–1217.

[3] Hodgins JJ, Khan ST, Park MM, et al. Killers 2.0: terapias con células NK a la vanguardia del control del cáncer. J Clin Invest. 2019;129(9):3499–3510.

[4] Zhu H, Blum RH, Bjordahl R, et al. Las células NK derivadas de células madre pluripotentes con CD16a no escindible de alta afinidad median una actividad antitumoral mejorada. Sangre. 2020;135(6):399–410.

[5] Mandal A, Viswanathan C. Células asesinas naturales: en la salud y la enfermedad. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 2015;8(2):47–55.

[6] Le Garff-Tavernier M, et al. Las células NK humanas muestran importantes cambios fenotípicos y funcionales a lo largo de la vida. Célula de envejecimiento. 2010;9(4):527–535.

[7] Le Garff-Tavernier M, Béziat V, Decocq J, et al. Los patrones de expresión de NKG2A, KIR y CD57 definen un proceso de diferenciación de células NK CD56dim desacoplado de la educación de células NK. Sangre. 2010;116 (19):3853–3864.

[8] Manser AR, Uhrberg M. Cambios relacionados con la edad en los repertorios de células asesinas naturales: impacto en la función de las células NK y la vigilancia inmunológica. Cancer Immunol Inmunotro. 2016;65(4):417–426. [9] Bi J, Tian Z. NK Agotamiento celular. inmunol frontal. 2017;8:760.

[10] Furman D, Campisi J, Verdin E, et al. La inflamación crónica en la etiología de la enfermedad a lo largo de la vida. Nat Med. 2019;25(12):1822–1832.

[11] Liu Y, et al. Un anticuerpo específico de péptido de citomegalovirus altera la homeostasis de las células asesinas naturales y se comparte en varias enfermedades autoinmunes. Microbio huésped celular. 2016;19(3):400–408.

[12] Campus X, Pera A, Solana R, et al. Las células NK en el envejecimiento saludable y las enfermedades asociadas a la edad. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:195956.

[13] Liu Y, Mu R, Gao YP, et al. Efecto del envejecimiento sobre la población de células nk y su proliferación en condiciones de cultivo ex vivo. Patol de células anales (Amst). 2018;2018:7871814.

[14] Sintov AC, Yarmolinsky L, Dahan A, et al. Efectos farmacológicos de la vitamina D y sus análogos: desarrollos recientes. Descubrimiento de drogas hoy. 2014;19 (11):1769–1774. [15] Halicka HD, Zhao H, Li J, et al. Atenuación de la señalización del daño del ADN constitutivo por

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