Estudio del mecanismo de tipo estrogénico de los glucósidos de Cistanche mediante metabolómica

Introducción

Los estrógenos desempeñan un papel importante en muchos procesos de desarrollo, fisiológicos y relacionados, incluido el desarrollo del útero.1–3 Sin embargo, el uso prolongado de estrógenos puede tener muchos efectos secundarios, como aumentar el riesgo de cáncer de mama, cáncer de endometrio y otros tumores ginecológicos.4,5 Por lo tanto, los investigadores se han comprometido a buscar sustitutos de los estrógenos que puedan evitar estos efectos secundarios, conocidos como moduladores selectivos de los receptores de estrógenos, de los cuales los fitoestrógenos constituyen una categoría importante.6 Los compuestos de fitoestrógenos se encuentran naturalmente en las plantas con potencia estrogénica y pueden unirse a los receptores de estrógeno para ejercer su actividad. Por lo tanto, los fitoestrógenos podrían estimular el crecimiento del útero al combinarse con los abundantes receptores de estrógeno en el útero, lo que significa que el ensayo uterotrófico podría usarse para la detección preliminar y la evaluación de fitoestrógenos.

cistanchedeserticola (CD), conocida como Rou Cong-Rong en China, es supuestamente eficaz para las funciones de reproducción, desarrollo y fertilidad, y se ha utilizado como tónico durante más de 1800 años.8,9 Recientemente, estudios farmacológicos han demostrado que esta El tónico tiene amplias funciones medicinales, comoRegulación hormonal, actividades aperitivas, inmunomoduladoras, antioxidantes, antiapoptóticas, neuroprotectoras, antinociceptivas, antiinflamatorias, antifatiga y estrogénicas..10 Los glucósidos de cistanche (GC) extraídos de la EC se encuentran entre los principales componentes activos y exhiben diversas actividades biológicas.11 Aunque los componentes activos de la EC se han dilucidado previamente,12 el mecanismo de tipo estrogénico de los GC nunca se ha investigado.

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En este estudio continuo, nuestro objetivo era confirmar el posible uso de GC como fitoestrógenos y llevar a cabo un análisis metabolómico para explorar el mecanismo de tipo estrogénico de los GC. Primero, se utilizaron un ensayo uterotrófico y un análisis histológico para confirmar la actividad estrogénica de los GC. Lo más importante es que nos centramos en los cambios metabólicos en el suero y la orina de rata mediante análisis metabolómicos basados ​​en UPLC-MS/MS. Debido a las deficiencias de la metabolómica no dirigida, como la repetibilidad y la complicada influencia de la matriz, se utilizó un pseudométodo basado en el modo MRM para monitorear específicamente los metabolitos y los índices (incluido el metabolismo energético, el estrés oxidativo, el metabolismo de los lípidos y el metabolismo de los aminoácidos). relacionado con los efectos estrogénicos, el crecimiento y el desarrollo se seleccionó como biomarcadores para la detección. Nuestros resultados arrojan luz sobre el mecanismo de tipo estrogénico de los GC, que ayudará al desarrollo y utilización de los GC.

Experimental

reactivos

L-leucina, L-quinurenina, L-triptófano, 5-HTP, ácido cólico, Nfenilacetilglicina, 5-HT, glutatión (GSH) y 2,4-dinitrofenilhidrazina ($99.{{ 8}}%, HPLC) se adquirieron de Dalian Melone Biology Technology Co. (Dalian, China). N-etilmaleimida ($98 %, HPLC), L-glutatión oxidado (GSSG, $98 %, HPLC) y 1,1,3,3-tetraetoxipropano (TEP) se adquirieron de Sigma (Madrid, España). La L-fenilalanina (Ring-D5, 98 %, DLM-1258-5) se adquirió en los laboratorios de isótopos de Cambridge (MA, EE. UU.). El metanol y el acetonitrilo de grado MS se adquirieron de ACS (Houston, EE. UU.). El dietilestilbestrol (pureza, $99,0%), el ácido fórmico, el ácido acético glacial y la hematoxilina y eosina (H&E) se adquirieron de Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co., St. Louis, EE. UU.). La naringenina (pureza, 98 % (HPLC)) se adquirió de Shanghai Jingchun Aladdin Reagent Co. (Shanghai, China). Los GC se prepararon en nuestro laboratorio y se determinó que su pureza era del 60% mediante espectrofotometría ultravioleta utilizando actósido como marcador para la determinación.

Preparación de GC

Briey,polvo de cistancha(100 g) se empaparon en etanol al 75 % (1000 ml) durante 1 h, luego se extrajeron con reux durante 2,5 h tres veces. El sobrenadante se concentró al vacío para obtenerextracto de cistanche(23,3 gramos). El extracto se diluyó con agua hasta una concentración de 0.5 g ml- 1 (la solubilidad se determinó con el fármaco crudo). Después de la adsorción con resina macroporosa AB-8 durante 8 h, la columna se eluyó secuencialmente con agua y etanol al 85%. El eluyente de etanol al 85% se concentró para obtener extracto de etanol (8,4 g). El extracto en etanol (0.02 g) se pesó con precisión y se disolvió en metanol al 50% (10 ml). Se diluyó una alícuota de 1 ml de la solución a 100 ml con metanol en un recipiente volumétrico. Finalmente, la solución diluida se midió a 330 nm mediante espectrofotometría ultravioleta. La absorción ultravioleta fue 0,341 y la relación lineal para el actósido por UV fue y=24,905X + 0.0426 (R2=0,9982). Cuando contenía 5,04 g de GC, la tasa de purificación fue del 60 % (se usó actósido como marcador para la determinación de GC). La evaluación de huellas dactilares de los GC se muestra en la figura S1 de ESI.

Experimentos con animales y recogida de muestras.

El Centro de Animales de la Universidad Médica de Harbin proporcionó ratas SD hembra de inmadurez sexual (45 a 60 g) y madurez sexual (320 a 380 g), licencia para animales de laboratorio, SCXK- (Ejército): 2013-001. Los animales se alojaron en condiciones de laboratorio SPF y se les proporcionó agua del grifo modificada con una dieta de laboratorio estándar ad libitum. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por las Pautas de cuidado y bienestar animal de la provincia de Heilongjiang y se realizaron de acuerdo con las pautas del Instituto Nacional de Salud con respecto a los principios de cuidado de animales (2004). Todas las ratas utilizadas en este experimento se aclimataron al entorno anterior durante una semana.

Las ratas SD sexualmente inmaduras se dividieron aleatoriamente en tres grupos de ratas 10: grupo blanco, grupo dietilestilbestrol y grupo GC. Mientras tanto, se seleccionaron 10 ratas SD en madurez sexual como grupo de control. Al grupo de dietilestilbestrol se le administró ig con dietilestilbestrol (0,35 mg kg- 1, 1 ml/ 100 g), al grupo GC se le administró ig con la solución de GC (30 g kg- 1, 1 ml/100 g ), y el grupo blanco y el grupo control recibieron agua destilada del mismo volumen dos veces al día (mañana y tarde) durante 3 días. Al tercer día, las ratas se alojaron en jaulas metabólicas después de la administración y se recogieron muestras de orina de forma continua durante 24 horas. Las ratas se anestesiaron con pentobarbital y se obtuvieron muestras de sangre de la aorta abdominal y se centrifugaron a 3000 × g (15 min, 4 °C) para obtener suero. Todas las muestras se almacenaron en - 20. C. Además, se separó, pesó y examinó el útero utilizando formalina al 10%.

análisis histológico

Se cortaron del útero una serie de tejidos de 5 mm de espesor. Luego, las secciones de tejido se incluyeron en parafina, se tiñeron con H&E utilizando métodos de rutina y se observaron con un microscopio óptico (BZ-9000; Keyence, Osaka, Japón). La altura de las células epiteliales uterinas se midió con un micrómetro bajo el microscopio.

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Metabolómica

Preparación de suero despojado de carbón activado.

Se preparó un suero blanco especial a partir de suero de rata al que se le habían despojado de materiales endógenos utilizando polvo de carbón activado. Se añadió polvo de carbón activado (6 g) al suero de rata (100 ml) se agitó durante 2 h a temperatura ambiente y se centrifugó a 4ºC. C y 13 500 rpm durante 20 min. El sobrenadante se alteró utilizando membranas de PES Millipore express (Merck Millipore, Ltd.) unidas a una jeringa de 20 ml en la siguiente secuencia: 5 mm, 1,2 mm y 0,45 mm. Se confirmó que el suero "despojado" estaba libre de biomarcadores mediante LC-MS/MS.

Preparación de soluciones estándar.

L-triptófano (Try), L-quinurenina (Kyn), GSSG, N-fenilacetilglicina (N-Phe), 5- HTP, L-leucina (Leu), 5-HT y ácido cólico ( CA) se prepararon soluciones madre (1 mg mL- 1) ​​usando metanol al 100%. Se preparó GSH a 0,5 mg ml- 1 en tampón NEM PBS 10 mM y se almacenó en - 40. C en botellas marrones. Los calibradores se generaron utilizando L-triptófano, L-quinurenina, GSSG, N-fenilacetilglicina, 5-HTP, L-leucina, 5-HT, ácido cólico y GSH-NEM combinados que se diluyeron en serie con agua destilada. agua. La solución madre IS de L-fenilalanina-d5 (d5-Phe) se preparó en metanol al 100 % y se preparó la solución de trabajo de d5-Phe (10 ng ml- 1). en 100% metanol y almacenado en - 40. C.

Durante el análisis, fue necesaria una etapa de derivatización para evitar la degradación del GSH, lo que mejoró la estabilidad para la detección y cuantificación del GSH. El GSH se determinó después de la reacción con NEM.15,16 Según el informe anterior, se seleccionó NEM 50 mM para el GSH.

preparación de la muestra

Para las muestras de suero, se añadió NEM 10 mM (200 ml) a la muestra (200 ml), seguido de metanol (1000 ml que contenían IS Phe-d5 a 10 ng ml- 1) y se incubó durante 20 minutos a { {9}}. C. Después de la centrifugación a 4ºC y 12 000 rpm durante 10 min, los sobrenadantes (1000 ml) se transfirieron a centrítubos de 2 ml y se evaporaron hasta sequedad. El residuo seco se reconstituyó en agua destilada (100 ml) después de centrifugación durante 15 minutos a 4ºC. C y 13 500 rpm, y se inyectó una alícuota de 10 ml del sobrenadante para su análisis.

Para las muestras de orina, se colocaron 100 ml de muestra en un tubo de 2 ml y se añadió 1 volumen de PBS (m/v) que contenía NEM 50 mM a cada muestra de orina. Luego, se añadió metanol (1000 ml que contenían IS a 10 ng ml- 1) y la muestra se incubó a - 20. C durante 20 min y luego se centrifuga a 12 000 rpm durante 10 min a 4 . C. El sobrenadante (1000 ml) se evaporó hasta sequedad bajo una suave corriente de nitrógeno a temperatura ambiente, y luego el residuo se disolvió en 60 ml de fase móvil y se agitó durante 1 min antes de la centrifugación a 13 500 rpm y 4 . C durante 15 min. Se inyectó una alícuota de 10 ml de sobrenadante para su análisis.

Validación de metodología

La validación del ensayo se realizó de acuerdo con la "Guía para la industria: Validación de métodos bioanalíticos" (Administración de Alimentos y Medicamentos, septiembre de 2013). Los calibradores se generaron utilizando una matriz sustituta para Trp, Kyn, GSH, GSSG, 5-HT, 5-HTP, N-Phe y CA a partir de soluciones de trabajo estándar en el suero "despojado". Cada calibrador de concentración se duplicó. La curva estándar se calculó mediante regresión lineal de mínimos cuadrados ponderada 1/X de las concentraciones del calibrador de la curva estándar y las relaciones de área de pico para el analito a IS.

Ensayo de precisión y exactitud.

Las precisiones de los ensayos de muestras de control de calidad agrupadas y de muestras de control de calidad de suero/orina de rata no tratadas se evaluaron mediante una ejecución analítica intradiaria y tres interdiarias. Las muestras de control de calidad con tres concentraciones diferentes se generaron agregando L-triptófano, L-quinurenina, GSSG, N-fenilacetilglicina, 5-HTP, L-leucina, 5-HT, ácido cólico y GSH-NEM. soluciones estándar en suero/PBS "despojado", que luego se procesaron de la misma manera que las muestras in vivo. Se prepararon soluciones madre estándar de Try, Kyn, GSSG, N-Phe, 5-HTP, 5-HT, Leu y CA (1 mg ml- 1) en 10 0% de metanol, excepto el de GSH, que se preparó a 0,5 mg mL- 1 en tampón NEM PBS 10 mM. Se generaron curvas estándar a ocho concentraciones diferentes de la misma manera que las muestras de control de calidad y se analizaron mediante regresión lineal de mínimos cuadrados ponderada 1/X. Para el estudio de validación del método, se realizó otro método de control de calidad simultáneamente utilizando suero/orina combinados (50 ml) de cada muestra de los grupos de control o modelo para obtener una muestra de control de calidad y luego se procesó como muestras in vivo. Se analizaron una serie de muestras de control de calidad y curvas estándar por cada 50 muestras de animales.

Efectos de matriz

La variación de la matriz, definida como la variación en la precisión del ensayo para diferentes lotes de matriz, se evaluó utilizando seis parcelas diferentes de suero/orina de rata enriquecidas para el análisis y la evaluación de la recuperación enriquecida.17 La evaluación del efecto completo de la matriz para un ensayo de compuesto endógeno es un desafío . Una forma de probar si un ensayo tiene algún efecto de matriz (general) es evaluar la recuperación potenciada. La prueba de recuperación enriquecida implica agregar el analito a muestras previas a la extracción, lo cual es diferente de la prueba de factores de matriz (MF), que implica agregar el analito a muestras posteriores a la extracción.18 El MF se calculó como el área del pico del analito en la presencia de una matriz biológica en comparación con la ausencia de una matriz biológica. Se utilizó el MF normalizado por IS: MF=relación área de pico/IS en presencia de matriz versus relación área de pico/IS en ausencia de matriz.

Análisis UPLC-MS/MS

Para LC-MS se utilizó un equipo de MS equipado con una columna analítica XP Waters X BridgeTM BEH C18 (2,5 mm, 3,0 × 100 mm; Waters, Torrance, CA). /Análisis MS. Se utilizó una fase móvil de gradiente lineal Q compuesta de 0.1% de agua con ácido fórmico (disolvente A) y metanol (disolvente B) de acuerdo con el siguiente programa de gradiente: 0–3.0 mín. (0–1 % B); 3.0–10.0 min (1–3% B); 10.0–14,0 min (3–50% B); 14.0–18,0 min (50–95 % B); 18,0–22,0 min (95–0 % B), el tiempo de parada es de 25 min. El volumen de inyección fue de 10 ml y la velocidad fue de 0,6 ml min- 1. El método final utilizó los siguientes parámetros: tipo de escaneo, MRM; modo ionizado, ionización por electropulverización (ESI) en modos de iones positivos y negativos; voltaje de pulverización de iones, ± 4500 V; gas de cortina, 20; temperatura, 450°C; gas fuente de iones 1, 40; gas de fuente de iones 2, 40. Todos los datos de UPLC-MS se obtuvieron utilizando el software AB Analyst (versión 1.6.2) y el m/z 171,1–125,2 para el estándar interno d5-Phe (DP, 63 V; CE , 8 V; CXP, 21 V; EP, 24 V) y las condiciones detalladas de MS se muestran en la Tabla S1.

análisis estadístico

Todos los valores se expresaron como media ± DE. La importancia de las diferencias entre grupos se comparó mediante una prueba ANOVA unidireccional seguida de la prueba de Dunnett utilizando el programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS 20.0, Chicago, IL, EE. UU.). El umbral de significancia se fijó en p <0,05 en esta prueba.

Resultados y discusión

Efecto de los GC en el útero.

Se utilizaron el peso uterino y el análisis histológico para evaluar el efecto de los GC en el útero. El peso uterino aumentó significativamente en los grupos de dietilestilbestrol, GC y control en relación con el grupo en blanco (P < {{0}}.01). En el grupo en blanco, el epitelio endometrial era columnar bajo con glándulas pequeñas, un epitelio glandular de forma cúbica y sin células inflamatorias intersticiales. En el grupo de dietilestilbestrol, el epitelio glandular y el endometrio eran columnares altos y mostraban hiperplasia, con muchas células inflamatorias intersticiales. En el grupo GC, el epitelio glandular y el endometrio eran muy columnares dentados y mostraban hiperplasia con muchas células inflamatorias intersticiales y engrosamiento de la íntima. En el grupo de control, el endometrio era columnar alto y el epitelio glandular era columnar bajo, con pocas células inflamatorias intersticiales. En comparación con el grupo en blanco, la altura de las células epiteliales uterinas aumentó significativamente en los otros grupos (P <0,01) (Fig. 1).

Validación del método del biomarcador detectado por UPLC-MS/MS

Linealidad y rango de calibración

Para cada medición se construyó una curva de calibración lineal con un factor de ponderación de 1/X en la matriz estudiada. Las curvas de calibración para los análisis en suero se analizaron en diferentes días. Los rangos de calibración para los análisis se distribuyeron a lo largo de siete puntos de calibración, como se muestra en la Tabla 1.

Exactitud y precisión. El método demostró ser apropiado, en términos de exactitud y precisión, tanto interdía como intradiaria, para todas las muestras estudiadas. Los valores de estos parámetros fueron inferiores al 5 % en las concentraciones establecidas para GSH, GSSG, Leu, Trp, Kyn, 5-HTP, ácido cólico, 5-HT y N-fenilacetilglicina, con tres réplicas. de cada concentración analizada. Los datos correspondientes a los valores de exactitud y precisión interdiarios e intradiarios se muestran en la Tabla ESI S2.

Efectos de matriz

Como se muestra en la Tabla S3 del ESI,† las recuperaciones aumentadas fueron del 92,5 al 118,1 % cuando se agregaron 1000 ng ml- 1 de GSH, 2000 ng ml- 1 de GSSG, 1000 ng ml- 1 de Leu , 6000 ng mL- 1 de Trp, 50 ng mL- 1 de Kyn, 2 ng mL- 1 de 5-HTP, 400 ng mL- 1 de ácido cólico , 8 ng mL- 1 de 5-HT y 2500 ng mL- 1 de N-fenilacetilglicina en tres parcelas diferentes de suero de rata, y al agregar 100 ng mL- 1 de GSH, 200 ng mL- 1 de GSSG, 1000 ng mL- 1 de Leu, 6000 ng mL- 1 de Trp, 50 ng mL- 1 de Kyn, 2 ng mL{ {37}} de 5-HTP, 400 ng mL- 1 de ácido cólico, 8 ng mL- 1 de 5-HT, 2500 ng mL- 1 de N -fenilacetilglicina en tres parcelas diferentes de orina de rata con distintos niveles iniciales. Los CV de las concentraciones medidas de Trp y Kyn de estos lotes fueron #10% (n=5). Estos resultados indicaron que diferentes matrices no afectaron significativamente el ensayo.

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Análisis del perfil de metabolitos mediante método pseudodirigido.

El método pseudodirigido se aprovechó para investigar el perfil MRM del metabolito en suero y orina de cuatro grupos (blanco, dietilestilbestrol, control y GC).

En primer lugar, el modelo PCA se construyó para exhibir la distinción metabólica de los cuatro grupos. A partir del análisis multivariado, hubo diferencias metabólicas obvias entre los grupos de GC (incluidos los grupos de dietilestilbestrol y control) y el grupo en blanco. Las muestras de control de calidad se agruparon estrechamente en el gráfico de puntuación de PCA, lo que indicó que la estabilidad del sistema fue acomodativa para este estudio de metabolómica (Fig. 2).

Luego, el valor P crítico se estableció en 0.05 para metabolitos significativamente diferenciales en esta investigación. En consecuencia, como se muestra en la Tabla 2, los metabolitos diferenciales en comparación con el grupo en blanco se identificaron tentativamente de la siguiente manera: 17 en muestras de suero y

12 en muestras de orina para el grupo GC, 15 en muestras de suero y 9 en muestras de orina para el grupo dietilestilbestrol, 12 en muestras de suero y 11 en muestras de orina para el grupo control, y 11 en muestras de suero y 7 en muestras de orina que fueron simultáneamente presente en los grupos GC, dietilestilbestrol y control. Para comprender mejor las diferencias metabólicas entre los diferentes grupos, se generó un mapa de calor de agrupamiento para todos los metabolitos diferenciales, lo que demuestra el aumento relativo (rojo) o la disminución (verde) (Fig. 3).

Dieciocho metabolitos diferenciales presentes simultáneamente en los grupos GC, dietilestilbestrol y control se describieron como

sigue: glucosa, ácido cítrico, prolina, betaína, ornitina, N-fenilacetilglicina, ácido fenilpirúvico, inosina, C16:0LPC, creatinina y xantosina en suero, y bencenoacetilglicina, ácido piroglutámico, acetilcarnitina y Se observó que la N6-acetil lisina en la orina disminuyó significativamente (P < 0.05); mientras que la taurina, la ornitina, el ácido a-cetoglutárico y la espermidina en la orina aumentaron significativamente (P < 0.05). Además, la taurina (suero) aumentó significativamente, mientras que el ácido a-cetoglutárico (suero), C18:0LPC (suero) y la betaína (orina) disminuyeron significativamente en los grupos de dietilestilbestrol y GC (P < {{ 19}}.05); La L-quinurenina (suero) estuvo regulada positivamente en el grupo de dietilestilbestrol, pero disminuida en el grupo GC (P <0,05); el ácido piroglutámico (suero) y la prolina (orina) estaban regulados a la baja, y el ácido cítrico (orina) y la nicotinamida (orina) aumentaron notablemente en el grupo control y GC (P <0,05); y la fenilalanina estaba regulada negativamente en el grupo GC (P <0,05).

En este estudio, se investigaron los efectos de los GC en el útero de ratas inmaduras. El útero es el órgano más sensible para analizar los efectos de las sustancias químicas dependientes del RE.Herba CistanchesSe ha informado que induce un aumento en el peso uterino al mejorar la función liberadora de lutropina del ovario hipotalámico-pituitario,20 lo que también se observó para los GC en este estudio. Esto indicó que los GC tienen actividad similar a la estrogénica. Recientemente, los informes se han centrado principalmente en el mecanismo predominante por el cual los efectos estrogénicos se expresan mediante la unión a los RE,21-23, pero el mecanismo metabólico no se ha estudiado en profundidad. En este estudio, se utilizó un método pseudometabólico para explorar el mecanismo de tipo estrogénico de los GC.

Los intermediarios metabólicos de una serie secuencial de reacciones cambiaron de una manera más pronunciada que la cinética enzimática o se individualizan.24 Diecisiete metabolitos en el suero, incluidos glucosa, ácido cítrico, taurina, prolina, betaína, ornitina, ácido piroglutámico, ácido a-cetoglutárico, N- fenilacetilglicina, ácido fenilpiruvato, inosina, C18:0LPC, C16:0LPC,

creatinina, fenilalanina, L-quinurenina y xantosina, y 12 metabolitos en la orina, incluidos benceno acetil glicina, betaína, taurina, ácido cítrico, ornitina, ácido piroglutámico, acetilcarnitina, N6-acetil lisina, nicotinamida, a-cetoglutárico. Se descubrió que el ácido, la espermidina y la prolina estaban involucrados en el mecanismo similar al estrogénico de los GC. Varios metabolitos alterados fueron de especial interés porque estaban presentes tanto en suero como en orina. Por ejemplo, el ácido cítrico, formado por la condensación de acetil coenzima A y ácido oxaloacético y que desempeña un papel importante en el ciclo del ácido cítrico relacionado con el metabolismo energético,25 estaba regulado negativamente en el suero del grupo GC pero regulado positivamente en la orina. . Además, el ácido a-cetoglutárico con una estructura de carbono de glutamina, que puede mantener el equilibrio total de nitrógeno y promover la síntesis de proteínas, y es el material central del ciclo del ácido cítrico, estaba regulado negativamente en el suero del grupo GC, pero regulado positivamente. en la orina.26 El ciclo del ácido cítrico no es sólo la vía metabólica final de tres nutrientes principales (carbohidratos, lípidos y aminoácidos), sino también el vínculo entre el metabolismo del azúcar, los lípidos y los aminoácidos, y la principal forma de obtener energía. para el cuerpo.27,28 Esto demostró que el mecanismo de tipo estrogénico de los GC estaba relacionado con el metabolismo energético, que es el mismo que el dietilestilbestrol. Por lo tanto, hubo un vínculo claro entre el ciclo del ácido cítrico y el aumento del peso uterino en ratas inmaduras tratadas con GC. Como importante donante de metilo, la betaína juega un papel importante en el crecimiento y desarrollo del feto, lo que indica que la betaína está involucrada en el aumento del peso uterino.29 Curiosamente, la taurina estaba regulada positivamente tanto en el suero como en la orina, lo que podría promover la digestión y absorción de lípidos. y la captación y utilización celular de glucosa al promover el metabolismo de la glucosa. También se ha informado que la deficiencia de taurina conduce a la pérdida de peso en animales jóvenes, lo que sugiere que la taurina desempeña un papel importante en el crecimiento y el desarrollo.30 Además, el efecto de regulación de la betaína y la taurina por los GC siguió la misma tendencia con el uso de dietilestilbestrol, pero con una mayor efecto en comparación con el dietilestilbestrol.

Además, numerosos aminoácidos fueron alterados significativamente. Nuestros resultados sugirieron que los GC causaron anomalías metabólicas en los aminoácidos. El metabolismo de los aminoácidos podría usarse para la síntesis de proteínas específicas, péptidos y otros compuestos nitrogenados, o para la descarboxilación por desaminación, transaminación, combinada con la descomposición del amoníaco, o para la liberación de energía a través del ciclo del ácido cítrico.31,32 Por lo tanto, las alteraciones de estos Los compuestos pueden estar involucrados en los importantes eventos de señalización que desencadenan el aumento del peso uterino.

Además, para un análisis detallado de las vías, los metabolitos diferenciales se clasificaron en varias vías principales, incluido el ciclo del citrato (ciclo TCA), el metabolismo del glutatión,

Metabolismo de arginina y prolina, metabolismo de D-glutamina y D-glutamato, biosíntesis de fenilalanina, tirosina y triptófano, metabolismo de fenilalanina y otras vías utilizando el software Pathway Analysis of MetaboAnalyst (http://www.metaboanalyst.ca), como se muestra. en la Fig. 4. La vía relacionada con el metabolismo energético, incluido el ciclo del TCA y el metabolismo del glutatión (tanto en suero como en orina), fue uno de los principales objetivos de los efectos estrogénicos. El papel crítico de los químicos estrogénicos en el metabolismo energético fue verificado por los RE que regulan los genes necesarios para la función mitocondrial, el ciclo de los TCA y más, según estudios previos.33,34 Se podría concluir que el mecanismo similar a los estrogénicos de los GC era similar al del dietilestilbestrol, ambos relacionados, hasta cierto punto, con el ciclo de los ATC y el metabolismo del glutatión, pero los GC funcionan mejor que el dietilestilbestrol.

Aunque los posibles mecanismos no pudieron aclararse en este estudio, se seleccionaron algunos metabolitos que podrían usarse para explorar otros mecanismos estrogénicos de los GC en el útero en el futuro. Por lo tanto, para explorar mejor el mecanismo, en futuras investigaciones se aplicarán otras tecnologías, como la proteómica.

Conclusiones

En resumen, se estableció un método de metabolómica pseudodirigida en suero y orina basado en UPLC-QTRAP MS para explorar los mecanismos de tipo estrogénico de los GC, que proporcionó resultados sólidos y confiables. Utilizando el enfoque pseudodirigido establecido, se reveló una visión holística de los cambios en la metabolómica sérica y urinaria del mecanismo de tipo estrogénico (GC).

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