Estudio sobre los efectos de mejora del extracto de glucósidos feniletanoides de Rouchongrong (Cistanche Deserticola) sobre el metabolismo de los lípidos en hígados de ratones ApoE - / - con una dieta rica en grasas basada en la regulación de las expresiones ACOX1 - CPT2

RESUMEN Objetivo:para explorar elefectos del extracto de glucósidos feniletanoidesdeCistanche deserticola(PGCD) sobre el metabolismo de los lípidos en el hígado de ratones ApoE-/- inducido por una dieta rica en grasas. Métodos: 70 ratones macho ApoE-/- alimentados con una dieta alta en grasas se dividieron en 5 grupos, grupo modelo (MOD), grupo de control positivo, a los ratones se les administró Atorvastatina [20 mg/(kg·d)] + Ezetimiba [20 mg/(kg). ·d)](A + E), se administraron grupos de dosis baja, media y alta de PGCDPGCD[250, 500, 1000 mg/(kg·d)]; otros 14 ratones macho C57BL/6J con dieta achow se establecieron como grupo de control normal (CON). El duodécimo fin de semana, se detectaron el contenido de TG y las actividades de ALT y AST en suero y tejido hepático de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento. Se homogeneizó tejido hepático fresco y se determinaron los contenidos de ácido graso sintasa (FAS), acil de cadena larga - CoA deshidrogenasa (LCAD) y glutatión peroxidasa (GSH - Px),superóxido dismutasa (SOD)Las actividades se probaron mediante el método ELISA, mientras que los contenidos de malondialdehído (MDA) y peróxido lipídico (LPO) se detectaron con métodos infantiles. Las expresiones de ARNm de acil-coenzima A oxidasa 1 (ACOX1) y carnitina palmitoiltransferasa 2 (CPT2) se detectaron mediante experimentos de RT-PCR.

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Resultados:A diferencia del grupo modelo,tres dosis de PGCD redujeron los niveles de TGen el hígado y el suero de manera dosis dependiente, y redujo las actividades de ALT y AST en el suero. Las tres dosis de PGCD redujeron el contenido de FAS de forma dosis dependiente y aumentaron significativamente el contenido de LCAD en el hígado.PGCD promovidolas actividades de GSH - Px y SOD y redujeron significativamente el contenido de MDA y LPO en el hígado. Los experimentos de RT-PCR mostraron que PGCD elevaba los niveles de ARNm de ACOX1 y CPT2 en el tejido hepático.

Conclusión:PGCD puede mejorar el metabolismo de los lípidos y la respuesta al estrés oxidativo, y reducir la deposición de lípidos en el tejido hepático mediante la regulación de las expresiones de ARNm de ACOX1 y CPT2.

Palabras clave:Extracto de glucósidos feniletanoides de Cistanche deserticola; ACOX1; CPT2;metabolismo de los lípidos;estrés oxidativo; ratones ApoE-/-

Enfermedad del hígado graso no alcohólico(NAFLD) es una de las enfermedades hepáticas más extendidas en el mundo, con una prevalencia de casi el 30% en la población general. La enfermedad del hígado graso en China está creciendo a una tasa anual del 0,594% [1]. La aparición y el desarrollo de NAFLD están estrechamente relacionados con la ingesta calórica excesiva del cuerpo. Una dieta rica en grasas conduce a una acumulación excesiva de grasa en el hígado e induce NAFLD [2], y el paso inicial en su patogénesis es el depósito de triacilglicerol (TG) en las células del hígado [2] 3. Hasta la fecha, no existen fármacos terapéuticos específicos dirigidos a la patogénesis de la NAFLD. Encontrar fármacos seguros y eficaces con mecanismos claros para la prevención y el tratamiento de la NAFLD se ha convertido en una tarea importante para los investigadores. Cistanche deserticola YC Ma es una planta parásita del género Cistanche de la familia Orobanchaceae. Su componente principal, los glucósidos feniletanoides, tiene las funciones de mejorar la función inmune del cuerpo, efectos antienvejecimiento, antirradiación, antioxidantes y hepatoprotectores, entre otros[4-5]. Este estudio pretende realizar un estudio preliminar sobre el mecanismo deGlucósidos feniletanoides de Cistanche deserticola(PGCD) para mejorar el metabolismo de los lípidos.

1 materiales experimentales

1.1 Medicamentos experimentales

Los tallos carnosos de Cistanche deserticola (contenido de humedad 8,5%) se adquirieron de Hotan Dichen Pharmaceutical Co., Ltd.; las sustancias de referencia de los glucósidos de feniletanoides (componentes principales verbascósido y equinácea) (ambas con una pureza > 98 %) se adquirieron en Manster, Chengdu, Sichuan Biotechnology Co., Ltd.; Atorvastatina: Pfizer Shanghai; Ezetimiba: Merck Pharmaceuticals Co., Ltd.

1.2 animales de experimentación

Ratones macho C57BL/6J de 6 a 8 semanas de edad y ratones ApoE-/-, peso corporal (20 ± 2) g, adquiridos en Changzhou Cavins Experimental Animal Co., Ltd., número de licencia: SCXK (Su) 2016-0010 , ciclo de luz de 12 h/12 ​​h, temperatura (22 ± 1) grados, humedad 50% ~ 60%, ingesta libre de alimentos y agua. Antes del experimento, los ratones fueron alimentados con una dieta estándar durante 1 semana para adaptarse. Todo el cuidado y los experimentos con animales siguen las regulaciones del Comité de Ética Animal Experimental de la Primera Universidad Médica de Shandong (Nº de ética: W202107080303).

1.3 Reexperimentalagentes

Piensos ricos en grasas: Harlan Teklad; Kits de TG, ALT, AST: Beijing Solebao Biotechnology Co., Ltd.; Kits FAS y LCAD: Shanghai Langton Biotechnology Co., Ltd.; Kit GSH-Px: Shanghai Jining Biotechnology Co., Ltd.; Kits de SOD, MDA, LPO, BCA: Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.; Kit de Trizol: Invitrogen, Carlsbad, CA; Cebadores ACOX1 y CPT2: diseñados por Sangon Bioengineering (Shanghai) Co., Ltd.

1. 4 Instrumentos experimentales Hei - Evaporador rotativo VAP Expert: Alemania

Heidolf; Lector de microplacas multifuncional Varioskan LUX: ThermoFisher; Liofilizador al vacío FD8508: Ilshin, Corea del Sur; Homogeneizador F6/10: Shanghai Fluoroco; Cromatógrafo líquido de alto rendimiento Agilent1260, espectrofotómetro UV Cary 3500: Agilent Technologies Ltd.; Quant studio5RT - Instrumento de PCR: Thermo Fisher Biochemicals, Inc.

2.3.1 Masa corporal e índice hepático

Al final de la semana 12, los ratones se mantuvieron en ayunas y se pesaron. Los ratones fueron anestesiados con pentobarbital sódico y sacrificados. Los hígados se recogieron para calcular el índice hepático.

2.3.2 Detección de indicadores séricos

Tome el suero y detecte las actividades séricas de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) en secuencia de acuerdo con el funcionamiento del kit; BCA determina el contenido de proteínas en el suero y detecta el contenido de TG.

2.3.3 Detección de factores relacionados con el metabolismo de los lípidos en el tejido hepático

En condiciones de 4 grados, pesar una cantidad adecuada de hígado fresco y homogeneizarlo en PBS, centrifugar (radio de centrífuga de 7,5 cm, 3 000 r/min) el homogeneizado durante 1 min, tomar el sobrenadante y medir el contenido de proteína de tejido hepático por BCA. Contenido de TG en tejido, método ELISA para detectar contenido de ácido graso sintasa (FAS) y acil-CoA deshidrogenasa de cadena larga (LCAD) en tejido hepático.

2.3.4 Detección de factores oxidativos relacionados con el tejido hepático

En condiciones de 4 grados, pesar una cantidad adecuada de hígado fresco y homogeneizarlo en PBS, centrifugar el homogeneizado (radio centrífugo de 7,5 cm, 3 000 r/min) durante 15 minutos, tomar el sobrenadante y medir el contenido de proteína de tejido hepático con BCA. Siga los reactivos Las instrucciones de la caja detectan las actividades de superóxido dismutasa (SOD) y glutatión peroxidasa (GSH-Px), y detectan simultáneamente los niveles de malondialdehído (MDA) y peróxido de lípidos (LPO).

2. 3. 5 Detección por RT-PCR

Expresión de ARNm de ACOX1/CPT2 en tejido hepático: tome una cantidad adecuada de tejido hepático fresco, use un kit Trizol para extraer el ARNm total del tejido hepático, use la transcriptasa inversa MuLV para sintetizar ADNc y use ADNc como plantilla para realizar fluorescencia cuantitativa en tiempo real. Detección por PCR (Qpcr). , las condiciones de reacción fueron: predesnaturalización a 95 grados durante 2 min; desnaturalización a 95 grados durante 10 s, recocido: 60 grados durante 30 s, extensión a 72 grados durante 35 s, 34 ciclos y finalmente extensión a 72 grados durante 5 min, y cuantificación en tiempo real mediante un analizador automático. Expresión de ARNm de ACOX1 y CPT2. Software Rotor-gene Q. 1.7 (Qiagen) se utilizó para el análisis de datos y se utilizó el método 2-△△Ct para contar los niveles relativos de ARNm y GAPDH. Cada grupo de experimentos se realizó en paralelo > 3 veces. Las secuencias de los cebadores son las siguientes: GAPDH, aguas arriba: 5' - GCCACCC AGAAGACTGTG - 3', aguas abajo: 5' - ATGTAGGCCATGAGGTCCAC - 3'; ACOX1, aguas arriba: 5' -CGCCACCTT CAATCC AGAGT - 3' aguas abajo: 5' -TCTGCGATGCCAAATTCCCT - 3'; CPT2, aguas arriba: 5'- TCCTCCTACTC AGGACGCAA - 3' aguas abajo: TTGGGATCTTCCGCTCACAC.

2.4 Métodos estadísticos

Para analizar los datos se utilizó el software estadístico SPSS 20.0. Los datos de medición se expresaron como (x ± s). Se utilizó un análisis de varianza unidireccional para la comparación entre grupos. P <0,05 se consideró una diferencia estadísticamente significativa.