Estudio sobre la función protectora de la cistanche en el riñón: diferencias dependientes de andrógenos en las cantidades de ARNm de CYP en el riñón de cerdo
Mar 13, 2022
Diferencias dependientes de andrógenos en las cantidades de ARNm de CYP en el riñón de cerdo
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Anteriormente informamos sobre diferencias de raza y sexo dependientes de andrógenos en las cantidades de ARNm de isoformas de CYP en el hígado de cerdo. Para aclarar si existen tales diferencias de sexo y raza en elriñón, examinamos las cantidades de varios ARNm de CYP en el riñón usando ambos sexos de Landrace, Meishan y/o sus cerdos cruzados F1 (LM y ML) de 5-meses de edad. Se encontraron diferencias sexuales significativas en las cantidades de varios ARNm de CYP: hombre < mujer="" para="" cyp2a19="" y="" cyp3a29;="" y="" macho=""> hembra para CYP4A24/25 en todas las razas. También se observaron diferencias de sexo en la cantidad de ARNm de CYP2B22 (macho < hembra)="" y="" en="" los="" arnm="" de="" cyp2c33="" y="" cyp2c49="" (macho=""> hembra) en todas las razas excepto en los cerdos Landrace. Además, solo se encontró una diferencia de sexo significativa (macho < hembra)="" en="" el="" arnm="" de="" cyp3a46="" en="" cerdos="" lm="" y="" ml.="" no="" se="" encontraron="" diferencias="" de="" sexo="" significativas="" en="" los="" cerdos="" landrace="" o="" meishan="" para="" los="" arnm="" de="" cyp1a1,="" cyp1a2="" y="" cyp4b1.="" las="" cantidades="" de="" arnm="" de="" cyp2c33="" y="" cyp4a24/25="" en="" los="" machos="" fueron="" mayores="" en="" los="" cerdos="" meishan="" que="" en="" los="" cerdos="" landrace.="" experimentos="" adicionales="" con="" cerdos="" tratados="" por="" castración="">testosteronapropionato indicó que las diferencias de sexo y raza en las cantidades de esos ARNm de CYP dependían, al menos en parte, de los niveles de suerotestosterona. Además, los efectos de los andrógenos sobre las cantidades de ARNm de CYP en el riñón no se correlacionaron necesariamente con los del hígado, lo que sugiere que existe un factor selectivo de tejidos responsable de la expresión de los genes CYP relacionados con los andrógenos. La protección deCistanchesobre elriñoneses completo, lo que se atribuye a los elementos como el equinacósido, el verbascósido, los flavonoides y los glucósidos de alcohol fenetílico totales contenidos enCistanche. Cistancheno sólo puede proteger lariñonesde más daño, sino también reparar el daño existente en elriñones. Por lo tanto,Cistanchees la hierba más utilizada en las prescripciones de la medicina tradicional china.Cistanchetiene un valor medicinal extremadamente alto.
Palabras clave:testosterona; CYP;riñón; diferencia de sexo; diferencia de raza; cerdo;riñóncélula;Cistanche
Misaki Kojima y Masakuni Degawab
Unidad de Genoma Animal, Instituto de Ciencias Ganaderas y de Pastizales, Organización Nacional de Investigación Agrícola y Alimentaria (NARO); 2 Ikenodai, Tsukuba, Ibaraki 305–0901, Japón: y bLaboratorio de Toxicología Molecular, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Shizuoka; 52–1 Yada, Suruga-Ku, Shizuoka 422–8526, Japón. Recibido el 16 de abril de 2021; aceptado el 19 de mayo de 2021
INTRODUCCIÓN
Las enzimas metabolizadoras de fármacos (DMEs), como las CYP, las sulfotransferasas (SULT) y las uridina 5′-difosfato (UDP)-glucuronosiltransferasas (UGT), desempeñan un papel importante en el metabolismo de los xenobióticos, incluidos los fármacos y los compuestos endógenos, como las hormonas esteroides. y lípidos.1,2) Los cerdos domésticos (Sus scrofa domesticus), incluidos los minicerdos, son importantes en los estudios farmacológicos y toxicológicos debido a la similitud de la función de EMD entre humanos y cerdos, en particular los CYP.3–7) y diferencias de raza en las cantidades de ARNm de DME hepático, incluidas las isoformas de CYP, entre cerdos Landrace y Meishan, y además demostramos que el nivel de andrógenos en suero es uno de los factores críticos que producen estas diferencias.8)
Cistanchetubulosaprevieneenfermedad del riñon,haga clic aquí para obtener la muestra
losriñónasí como el hígado es el tejido importante responsable del metabolismo y la excreción de xenobióticos, incluidos fármacos y compuestos endógenos, y es uno de los objetivos más frecuentes de la toxicidad inducida por fármacos.9,10) Se ha informado que las isoformas CYP pertenecientes a la Las familias CYP1, CYP2, CYP3 y CYP4 existen en el cerdoriñón.11–15) La mayoría de esas isoformas CYP juegan un papel importante en el metabolismo de xenobióticos y/o lípidos en animales de experimentación y humanos.9,10,16,17) Además, la expresión de las isoformas Cyp4a y Cyp4b en el ratónriñónestá regulada por andrógenos.18–21)
En el presente estudio, primero examinamos las diferencias de sexo y raza en las cantidades de ARNm de CYP (CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29, CYP3A46, CYP4A24/25 y CYP4B1) en elriñónde Meishan, Landrace y sus cerdos cruzados F1. Además, examinamos si el andrógeno es un factor crítico que determina las diferencias de sexo y raza en las cantidades de esos ARNm de CYP en el cerdo.riñón, por experimentos con castración y/o la administración detestosteronapropionato (TP).
MATERIALES Y MÉTODOS
animales
Se utilizaron cerdos Landrace, Meishan y sus mestizos F1 (LM, hembra Landrace × macho Meishan; ML, hembra Meishan × macho Landrace), los mismos que se utilizaron en nuestros estudios previos.22) Brevemente, los cerdos se mantuvieron en el Instituto Nacional de Ganadería y Ciencias de los Pastizales, Tsukuba, Japón. Todos los cerdos fueron alimentados con una dieta comercial de granos y se les proporcionó agua ad libitum. Los cerdos se sacrificaron mediante aturdimiento eléctrico seguido de desangrado entre las 10:00 y las 11:00 am. Algunos cerdos Landrace y Meishan machos fueron castrados a la edad de 1 mes y sacrificados a la edad de 5 meses. Se extrajo rápidamente una porción del riñón o del hígado de cada cerdo, se congeló en nitrógeno líquido y se mantuvo a -80 grados hasta los análisis posteriores.
Este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado Animal del Instituto Nacional de Ciencias Ganaderas y de Pastizales (Nos. 1711B060, 1811B032, 1911B068, 20B005NILGS). Todos los animales fueron tratados humanitariamente bajo las directrices del Comité.
Tratamiento de andrógenos
Como se describe en informes anteriores,23,24)testosteronapropionato (TP, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE. UU.) disuelto en aceite de maíz se inyectó por vía intramuscular cinco veces a intervalos de 48-h en la pata trasera de cada cerdo, a una dosis de 10 mg/kg peso corporal; los cerdos fueron sacrificados 24 h después de la inyección final.
Cantidad de suerotestosterona
La cantidad de suerotestosteronaen cerdos machos individuales se midió usando eltestosteronaKit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (Enzo Life Sciences Inc., NY, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, como se describió anteriormente.24) Además, también se utilizaron los datos obtenidos en nuestros estudios anteriores.24,25)
Cantidades de ARNm de CYP
El ARN total se preparó a partir de tejidos individuales utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE. UU.) y se utilizó para determinar las cantidades de CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29, CYP3A46, ARNm de CYP4A24/25 y CYP4B1. Las cantidades de estos ARNm se evaluaron mediante RT-PCR en tiempo real utilizando un sistema de PCR en tiempo real 7500 y una mezcla maestra verde SYBR (PE Applied Systems, Tokio, Japón), como se describió anteriormente,25) excepto para el ARNm de CYP3A. Las cantidades de ARNm de CYP3A22, CYP3A29 y CYP3A46 se examinaron usando Eagle Taq Master Mix con ROX (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, EE. estudio fueron los mismos que los de nuestros estudios previos22,25), excepto para CYP1A1, CYP1A2, CYP4A24/25 y CYP4B1, donde las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: CYP1A1, 5′-ACT TCA TCC CTA TCC TCC GTT ACC{{53} }′ (hacia adelante) y 5′-GCA TTC TCG TCC ATC CTC TTG TC-3′ (hacia atrás); CYP1A2, 5′-GCT ATC GGG ACT TTG ACA AGA ACT-3′ (directo) y 5′-CCA GGA GAT GGC TGT GGT AAT TG-3′ (reverso); CYP4A24/25, 5′-CAC CGT GCC GCC AGG ATA-3′ (directo) y 5′-CAA GGA GGA GGA TGT CCA GGA A-3′ (reverso); CYP4B1; 5′-GAG CAC CAG CAT CGT TGT CG-3′ (adelante) y 5′-TCC CCA GAT CCT CCC CCT G-3′ (reversa). Se usó proteína ribosómica L7 (RPL7) como patrón interno. La cantidad de cada cDNA se evaluó mediante el método de la curva estándar relativa según PE Applied Biosystems User Bulletin #2 (1997). Se generaron curvas estándar para determinar las cantidades de ARNm de CYP usando una mezcla de reacción de RT con ARN total del hígado de cerdos Landrace hembras de 5-meses de edad, o del riñón de cerdos Landrace de 5-meses de edad. cerdas hembras Landrace o Meishan, según el propósito
Análisis estadístico
Las diferencias estadísticamente significativas se evaluaron mediante la prueba post hoc de Tukey después de ANOVA o la prueba t de Student. Las correlaciones entre los parámetros indicados se determinaron mediante análisis de regresión.
RESULTADOS
Cantidades de ARNm de CYP en el riñón de cerdos Landrace y Meishan
Las cantidades de ARNm de CYP se midieron primero en el riñón de ambos sexos de cerdos Landrace y Meishan de 5-meses de edad. Para comparar la cantidad de cada ARNm de CYP entre el riñón y el hígado, la cantidad de cada ARNm de CYP en el riñón se expresó como una proporción relativa a la cantidad correspondiente en el hígado de cerdos Landrace hembras de 5-meses de edad, y los resultados se muestran en la Tabla 1.
En todos los cerdos examinados, las cantidades de ARNm de CYP4A24/25 y CYP4B1 en el riñón fueron muy superiores a las del hígado, mientras que las de los otros CYP fueron opuestas (Tabla 1). Además, aunque se detectaron ARNm de CYP2E1 y CYP3A22 en el riñón, esas cantidades estaban por debajo de una milésima parte de las del hígado en cada raza (datos no mostrados).
En ambas razas de cerdo, las cantidades de ARNm de CYP2A19 y CYP3A29 fueron menores en los machos que en las hembras (Tabla 1, Fig. 1). Por el contrario, la cantidad de ARNm de CYP4A24/25 en ambas razas de cerdos fue significativamente mayor en los machos que en las hembras. Además, en cerdos Meishan, las cantidades de ARNm de CYP2C33 y CYP2C49 fueron significativamente más altas en los machos que en las hembras. No se observaron tales diferencias de sexo en las cantidades de ARNm de CYP2C33 y CYP2C49 en cerdos Landrace. No se observaron diferencias sexuales significativas en las cantidades de ARNm de CYP1A1, CYP1A2, CYP2B22 y CYP4B1 en ninguna raza de cerdo, aunque una diferencia de sexo en la cantidad de ARNm de CYP2B22 en cerdos Meishan fue significativa mediante la prueba t de Student. Además, se detectó ARNm de CYP3A46 en ambos sexos de cerdos Landrace, mientras que estaba por debajo del límite de detección en ambos sexos de cerdos Meishan.
Breed differences in the amounts of several CYP mRNAs were also found. The amounts of CYP2B22 and CYP4B1 mRNAs in Landrace pigs were signifificantly higher than those in sex-matched Meishan pigs, while those of CYP2C49 and CYP3A29 mRNAs were the opposite. A significant breed difference (Meishan > Landrace) in the amounts of CYP2C33 and CYP4A24/25 mRNA was also observed in males, but no such difference was found in females. Furthermore, the breed differences (Landrace >Meishan) en las cantidades de ARNm de CYP1A1, CYP1A2 y CYP2A19 entre cerdos Landrace y Meishan del mismo sexo.
Efecto de los andrógenos en la expresión génica de CYP representativos relacionados con el sexo Para aclarar la dependencia androgénica de la expresión génica de CYP (CYP2A19, CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49 y CYP3A29) en el riñón, se evaluaron los efectos de la castración y/o el tratamiento con TP. examinado usando cerdos Meishan y Landrace de 5-meses de edad (Fig. 1). En los machos castrados de ambas razas, la cantidad de ARNm de CYP2A19 fue mayor que en los correspondientes machos intactos. Además, el tratamiento con TP de machos castrados y hembras intactas de ambas razas de cerdo dio como resultado una disminución en la cantidad de ARNm. Las cantidades de ARNm de CYP2B22 y CYP3A29 aumentaron en los cerdos Meishan castrados, pero no en los cerdos Landrace castrados, en comparación con los machos intactos correspondientes. El tratamiento con TP de machos castrados y hembras intactas de ambas razas de cerdo resultó en una disminución en las cantidades de esos ARNm, aunque no se observaron efectos significativos de TP en el ARNm de CYP2B22 en Meishan castrado y ARNm de CYP3A29 en cerdos Landrace castrados debido a la gran cantidad de ARNm. diferencia individual.
Tabla 1. Cantidades relativas de ARNm de isoformas renales de CYP en cerdos Meishan y Landrace de 5-mes de edad
Fig. 1. Efectos de la castración y/o la administración de TP sobre las cantidades de ARNm de CYP en riñón de cerdo de 5-mes de edad
Se inyectó TP por vía intramuscular en cerdos Landrace y Meishan machos castrados y hembras intactas de {{0}} meses de edad, como se describe en Materiales y Métodos. La cantidad de cada ARNm de CYP en el riñón se determinó mediante RT-PCR en tiempo real y se normalizó a la de RPL7 como estándar interno. Las curvas estándar se generaron usando una mezcla de reacción RT con ARN total de riñones de cerdos Landrace hembras de 5-meses de edad, excepto para la determinación de la cantidad de ARNm de CYP2C49, donde las curvas estándar se generaron usando una mezcla de reacción RT con ARN total de los riñones de cerdos Meishan hembras de 5-meses de edad. Cada columna representa la media de cada grupo experimental, y cada barra representa la desviación estándar (DE) de la media (n= 6 para cerdos Landrace y Meishan machos y hembras intactos; n= 3 para otros). a,b Las diferencias significativas con respecto a los cerdos machos intactos correspondientes se evaluaron mediante la prueba post hoc de Tukey: ap < 0.{{20}}5,="" pb="">< 0,01.="" c,="" d="" diferencias="" significativas="" con="" respecto="" a="" los="" cerdos="" no="" tratados="" con="" tp="" correspondientes,="" según="" lo="" evaluado="" mediante="" la="" prueba="" t="" de="" student:="" cp="">< 0,05,="" dp="">< 0,01.="" los="" cuadrados="" en="" cyp2b22="" y="" cyp3a29="" indican="" cerdos="" meishan="" y="" landrace,="" respectivamente,="" con="">
La cantidad de ARNm de CYP2C33 disminuyó en los cerdos Meishan castrados, pero no en los cerdos Landrace castrados, en comparación con los machos intactos correspondientes, y el tratamiento con TP de machos castrados y hembras intactas de ambas razas de cerdo resultó en un aumento en la cantidad de ARNm. En cerdos Meishan, la cantidad de ARNm de CYP2C49 también disminuyó por la castración, y el tratamiento con TP de machos castrados y hembras intactas condujo a un aumento en su cantidad. No se observaron tales efectos de castración o tratamiento TP en cerdos Landrace.
Fig. 2. Efectos de la castración y/o la administración de TP sobre las cantidades de ARNm de CYP4A24/25 y CYP4B1 en el riñón y el hígado de cerdos de 5-meses de edad
Se inyectó TP por vía intramuscular en cerdos Landrace y Meishan machos castrados y hembras intactas de {{{{10}}}} meses de edad, como se describe en Materiales y Métodos. La cantidad de cada ARNm de CYP en el riñón y el hígado se determinó mediante RT-PCR en tiempo real y se normalizó a la de RPL7 como estándar interno. Las curvas estándar se generaron utilizando una mezcla de reacción RT con ARN total de los riñones de cerdos Landrace hembra de 5- meses de edad. Cada columna representa la media en cada grupo experimental, y cada barra representa la SD de la media (n= 6 para cerdos Landrace y Meishan machos y hembras intactos; n= 3 para otros). Las diferencias significativas con respecto a los cerdos machos intactos correspondientes se evaluaron mediante la prueba post hoc de Tukey: p < 0,01.="" b,="" c="" diferencias="" significativas="" de="" los="" correspondientes="" cerdos="" no="" tratados="" con="" tp,="" según="" lo="" evaluado="" mediante="" la="" prueba="" t="" de="" student:="" pb="">< 0,05,="" cp=""><>
To date, there are no reports concerning the constitutive amounts of CYP4A24/25 and CYP4B1 mRNAs and sex differences in their amounts in the pig liver, although a clear sex difference (male >hembra) en la cantidad de ARNm de CYP4A24/25 se observa aquí en el riñón de cerdo (Tabla 1). Por lo tanto, para aclarar los efectos de los andrógenos en la expresión de esos ARNm en el riñón y el hígado de cerdos Landrace y Meishan, examinamos no solo los efectos de la castración sino también los efectos del tratamiento con TP de machos castrados y hembras intactas ( Figura 2). La cantidad de ARNm de CYP4A24/25 en el riñón disminuyó en los cerdos Landrace y Meishan por castración, y el tratamiento con TP de los machos castrados y las hembras intactas de ambas razas de cerdo resultó en un aumento de su cantidad. Sin embargo, en el hígado de ambas razas de cerdo, no se observaron tales efectos de castración, y tampoco se observaron diferencias de sexo en la cantidad de ARNm de CYP4A24/25. Asimismo, no se observó un efecto significativo del tratamiento con TP sobre la cantidad de ARNm hepático de CYP4A24/25 en ambas razas de cerdo, aunque el aumento de su cantidad por el tratamiento con TP se observó solo en machos castrados de cerdos Landrace. Además, el ARNm de CYP4B1 no mostró diferencias sexuales ni en el riñón (Fig. 2 y Tabla 1) ni en el hígado para cada raza de cerdo. En ambas razas de cerdos, la cantidad de ARNm de CYP4B1 no cambió significativamente por la castración y/o el tratamiento con TP (Fig. 2).
Hemos encontrado previamente que el tratamiento con TP resultó en un aumento en la cantidad de ARNm de CYP3A46 en el hígado de cerdos Landrace.22) Por lo tanto, los efectos del tratamiento con TP y la castración en la cantidad de ARNm en el riñón se examinaron más a fondo usando {{3} Cerdos Landrace de }meses de edad (Fig. 1). Aunque la castración de machos no tuvo un efecto significativo sobre la cantidad de ARNm de CYP3A46 en el riñón, el tratamiento con TP de machos castrados y hembras intactas dio como resultado una disminución en la cantidad de ARNm de CYP3A46. Además, el ARNm de CYP3A46 estuvo por debajo del límite de detección tanto en el riñón como en el hígado de todos los cerdos Meishan tratados con castración y/o TP.22)
Factores genéticos responsables de la expresión relacionada con el sexo de los ARNm de CYP
We have previously reported that sex-related expression of CYP mRNAs in the pig liver is, at least in part, dependent on the amount of serum testosterone,8) and that the amount is determined by autosomal dominant inheritance.25) Therefore, using F1 progeny (LM and ML) of Landrace and Meishan pigs, the amounts of sex-related CYP mRNAs in the kidney were measured (Fig. 3). Incidentally, the amounts of serum testosterone in 5-month-old male LM and ML pigs, as well as Meishan pigs, were >40 ng/mL, y los de cerdos Landrace machos de 5-mes de edad fueron<23 ng>
In both LM and ML pigs, the mRNA amounts of CYP2A19, CYP2B22, and CYP3A29 in males were much lower than those in females, while the converse was observed for CYP2C33 and CYP4A24/25. For CYP2C49 mRNA, a significant sex difference (males >hembras) en los cerdos ML, pero no se observaron diferencias significativas en los cerdos LM debido a las considerables diferencias interindividuales entre los cerdos machos LM. Se detectó ARNm de CYP3A46 en cerdos LM y ML, así como en cerdos Landrace, y una diferencia de sexo (machos< females)="" in="" the="" amount="" of="" cyp3a46 mrna was observed in lm and ml pigs ="">
Fig. 3. Diferencias de sexo en la cantidad de ARNm de CYP en el riñón de cerdos LM y ML de 5-meses de edad
La cantidad de ARNm de cada CYP en el riñón se determinó mediante RT-PCR en tiempo real y se normalizó a la de RPL7 como estándar interno. Las curvas estándar se generaron utilizando una mezcla de reacción RT con ARN total de los riñones de cerdos Landrace hembras de 5-meses de edad, excepto para la determinación de la cantidad de ARNm de CYP2C49, donde las curvas estándar se generaron utilizando una reacción RT mezcla con ARN total de los riñones de cerdos Meishan hembras de 5-meses de edad. Cada círculo muestra un cerdo individual (n= 6 y 9 para cerdos LM macho y hembra, respectivamente; n= 7 y 10 para cerdos ML macho y hembra, respectivamente). La barra indica el promedio en cada grupo. a,b Las diferencias significativas entre machos y hembras en cada raza se evaluaron mediante la prueba t de Student: ap < 0.05,="" pb=""><>
Relación entre la cantidad de testosterona sérica y la expresión de ARNm de CYP relacionados con el sexo en el riñón
Se cree que la concentración de andrógenos en suero es uno de los factores críticos que producen diferencias de sexo y raza en las cantidades de varios ARNm de CYP en el riñón de cerdo. Por lo tanto, la relación entre la concentración sérica de andrógenos y la expresión relacionada con el sexo de los ARNm de CYP (CYP2A19, CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A29, CYP3A46 y CYP4A24/25) en el riñón se examinó más a fondo utilizando 1-, { {17}} y 5-cerdos de un mes. Algunos de los 1-cerdos de un mes (inmaduros,< 10 ng testosterone/ml ="" serum) ="" were ="" treated ="" with ="" tp="" and="" used="" as="" samples="" for="" the="" present="" experiments.="" the="" concentrations="" of="" serum="" testosterone="" in="" the="" tp-treated="" pigs="" were ="" 28–59 ng/ml. ="" in ="" addition, ="" serum ="" testosterone ="" amount ="" increased="" in="" an="" age-dependent="" manner="" in="" males25) ="" but ="" not ="" in ="" females="" of="" all="" the="" pigs=""><7 ng testosterone/ml ="" serum) ="" used. ="" therefore,="" as="" representative="" samples="" of="" females,="" 1-month-old="" and ="" 5-month-old ="" pigs ="" but ="" not ="" 3-month-old ="" pigs ="" were ="" used ="" for ="" the="" present="">
The mRNA amounts of CYP2A19, CYP2B22, CYP3A29, and CYP3A46 in all the pigs with high concentrations (>aprox. 30 ng/ml) de testosterona sérica fueron bajos en comparación con los de todos los cerdos con concentraciones bajas de testosterona sérica (<30 ng l). ="" in ="" particular, ="" the ="" amount ="" of ="" cyp3a29="" mrna="" decreased="" in="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent ="" manner ="" in ="" all ="" the ="" breeds ="" of ="" pig ="" examined ="" (fig. ="" 4). ="" furthermore,="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent="" decrease="" in="" the="" amount="" of="" cyp3a46 mrna was also observed ="" in="" all="" the="" pigs="" except="" meishan="">
Sin embargo, las cantidades de ARNm de CYP2C33 y CYP4A24/25 aumentaron de manera dependiente de la concentración sérica de testosterona en todas las razas de cerdo examinadas (Fig. 5). La cantidad de ARNm de CYP2C49 aumentó de manera dependiente de la concentración sérica de testosterona en los cerdos Meishan, LM y ML, pero no en los cerdos Landrace. Además, se observó un pequeño aumento en la cantidad de ARNm de CYP2C49 en los cerdos Landrace y Meishan de 1-meses de edad tratados con TP. Esto sugiere que la expresión de tal efecto asociado con TP depende del nivel de expresión de factor(es) transcripcional(es) sensible(s) a TP para la expresión del gen CYP2C49, que está implicado en la maduración.
DISCUSIÓN
En el presente estudio, inicialmente encontramos diferencias de sexo y raza en las cantidades de varios ARNm de CYP en el riñón utilizando cerdos Landrace y Meishan de 5-meses de edad y su progenie F1 (LM y ML). Posteriormente, para aclarar el efecto de los andrógenos sobre las cantidades de ARNm de CYP renal, examinamos los efectos de la castración y/o el tratamiento con TP sobre esas cantidades. Estos resultados se resumen en la Tabla 2. Al analizar tales diferencias de sexo y raza en relación con la concentración de testosterona sérica, aquí demostramos que la testosterona sérica es al menos uno de los factores críticos que producen esas diferencias en la cantidad de cada ARNm de CYP en el riñón.
Fig. 4. Correlaciones negativas entre las concentraciones séricas de testosterona y las cantidades de ARNm de CYP2A19, CYP2B22, CYP3A29 y CYP3A46 en riñón de cerdo
Las concentraciones de testosterona sérica y las cantidades de ARNm de CYP se midieron como se describe en Materiales y Métodos. Algunas de las concentraciones séricas de testosterona de cerdos individuales se tomaron de datos obtenidos previamente.24,25) Cada símbolo representa a cada cerdo individual. Cuadrados abiertos y rombos, machos y hembras de 1-mes de edad, respectivamente, de cerdos Landrace y Meishan (n= 3 para ambos sexos de cerdos Landrace y Meishan); cuadrados grises, cerdos Landrace y Meishan machos de 3-meses de edad (n= 4 para cerdos Landrace y n= 6 para cerdos Meishan); cuadrados cerrados y rombos, machos y hembras de 5-mes de edad, respectivamente, de cerdos Landrace y Meishan (n= 6 para ambos sexos de cerdos Landrace y Meishan); triángulos cerrados y abiertos, cerdos LM machos y hembras de 5-meses de edad, respectivamente (n= 6 para machos y n= 9 para hembras); triángulos inversos cerrados y abiertos, 5-cerdos ML machos y hembras de un mes, respectivamente (n= 7 para machos y n= 10 para hembras); círculos cerrados y abiertos, cerdos Landrace y Meishan machos y hembras de 1-mes de edad tratados con TP, respectivamente (n= 3 para ambos sexos de cerdos Landrace y Meishan). Las correlaciones se examinaron usando los datos de todos los animales probados y determinados por análisis de regresión, donde r es el coeficiente de correlación.
Previamente encontramos diferencias de sexo (masculino< female)="" in="" the="" amounts="" of="" cyp1a1="" and="" cyp1a2="" mrnas="" in="" the="" liver="" of="" meishan, lm, and ml pigs but not in landrace pigs.23–25) however, ="" no ="" such ="" sex ="" differences were ="" observed in the ="" kidney ="" of landrace="" and="" meishan="" pigs.="" on="" the="" contrary,="" there="" was="" a="" sex="" difference="" (male="" >="" female)="" in="" the="" amount="" of="" cyp4a24/25="" mrna="" in ="" the ="" kidney ="" but ="" not ="" in ="" the ="" liver. ="" sex ="" differences ="" in ="" the ="" amounts="" of="" cyp2a19,="" cyp2c33,="" and="" cyp2c49="" mrnas="" in="" the="" pig="" kidney,="" especially="" in="" meishan,="" lm,="" and="" ml="" pigs,="" correlated="" with="" the="" previous="" results="" in="" the="">< female="" for="" cyp2a19;="" male="" >="" female="" for="" cyp2c33="" and="" cyp2c49.="" interestingly, ="" sex ="" differences ="">< female)="" in="" the="" amounts="" of="" cyp2b22,="" cyp3a29, and/or cyp3a46="" mrnas="" in="" the="" kidney="" of="" meishan,="" lm,="" and="" ml="" pigs="" were="" the="" opposite="" of="" that="" previously obtained in the liver.22) sex differences in the amount of ="" cyp2a19,="" cyp3a29,="" and="" cyp4a24/25 ="" mrnas ="" were ="" observed ="" in the kidney of all the breeds of pig examined. although ="" sex ="" differences ="" in cyp2b22,="" cyp2c33, ="" and/or cyp2c49 ="" were ="" observed in meishan, lm, ="" and ml ="" pigs, ="" no ="" such ="" sex ="" differences ="">
Tabla 2. Resumen de las diferencias de raza y sexo dependientes de los andrógenos en la expresión génica de las isoformas de CYP en el riñón de cerdo
These sex and breed differences can be explained by the differences in the concentration of serum testosterone in male pigs. Male 5-month-old Meishan, LM, and ML pigs had high concentrations of serum testosterone (>aprox. 40 ng/mL) mientras que los de los cerdos Landrace tenían concentraciones bajas (<23 ng l). ="" because ="" the ="" amount ="" of ="" cyp2a19="" and="" cyp3a29 ="" mrnas ="" considerably ="" decreased ="" in ="" pigs ="" with ="">aprox. 20 ng/mL de testosterona sérica, diferencias de sexo (masculino< female) in ="" their ="" amounts ="" were ="" observed ="" in ="" all ="" the ="" breeds ="" of ="" pig. ="" likewise, ="" since ="" the ="" amount ="" of ="" cyp4a24/25="" mrna="" increased="" in="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent manner up to 80 ng/ml, a sex difference (male =""> female) was observed in all the breeds of pig. However, because clear changes in the amount of CYP2B22, CYP2C33, and CYP2C49 mRNAs occurred at >30 ng/mL de testosterona sérica, se observaron diferencias de sexo en sus cantidades en cerdos Meishan, LM y ML, pero no en cerdos Landrace. En consecuencia, se cree que tales diferencias de sexo y raza dependen de las de la concentración sérica de testosterona. Esta hipótesis está respaldada por los experimentos con cerdos castrados y/o tratados con TP. Es decir, las cantidades de esos ARNm en machos castrados (<12 ng testosterone/ml ="" in ="" serum) ="" were ="" almost ="" the="" same="" as="" the="" corresponding="" females.="" serum="" concentrations="" of="" testosterone="" in="" 5-month-old="" castrated="" males="" and="" intact="" females="" rose="" to="">100 ng/mL en tratamiento TP. En consecuencia, en los cerdos tratados con TP, las cantidades de ARNm de CYP2C33 y CYP4A24/25, ARNm de CYP2C33 y CYP4A24/25 aumentaron tanto o más que en los cerdos Meishan machos de 5-meses de edad, y las cantidades de Los ARNm de CYP2B22, CYP3A29 y CYP3A46 disminuyeron tanto como en los correspondientes cerdos machos.
Se cree que una diferencia en el perfil de secreción de la hormona del crecimiento (GH) entre machos y hembras en muchos animales, especialmente en roedores, da como resultado diferencias sexuales en las cantidades de varias enzimas metabolizadoras de fármacos, incluidas las CYP, en el hígado.26) Por ejemplo, las diferencias de sexo en las cantidades de ARNm de las isoformas Ugh, Sult y Cyp4a en el hígado de ratón están influenciadas por la secreción de GH de patrón masculino y/o andrógeno, mientras que esas diferencias de sexo están reguladas principalmente por el andrógeno en el riñón.21,27 ,28) Además, se propone un locus de transacción, llamado represión dependiente de GH (GDR), para regular el gen de la 15 -hidroxilasa de esteroides específica de mujeres (Cyp2a4) en el hígado de ratón,29) pero este gen se informa ser regulada recíprocamente por los andrógenos en el hígado y el riñón de los ratones macho.30) Por el contrario, hemos encontrado previamente que en los cerdos Landrace con una diferencia de sexo en el perfil de secreción de GH,31) no hubo diferencias de sexo en las cantidades de ARNm hepático de varias isoformas CYP, SULT y UGT que sí muestran diferencias de sexo en los cerdos Meishan.22–25,32) Por lo tanto, se cree que tales diferencias de sexo en los cerdos dependen principalmente de las diferencias en la concentración sérica de testosterona. Sin embargo, debido a que el perfil de secreción de GH es modificado por andrógenos,33–35) la posibilidad de que los cambios en las cantidades de ARNm observados en la castración y/o la administración de TP ocurran, al menos en parte, a través de un cambio en el nivel de GH mediado por andrógenos. No se puede descartar patrón de secreción.
Breed differences in amounts of the mRNAs of CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, and CYP4B1 between sex-matched Landrace and Meishan pigs were also observed in the kidney (Table 1), while no such clear breed differences were observed in the liver.22,25) Additionally, as for CYP2C49 mRNA, individual differences in each breed of pig were observed regardless of serum testosterone concentration, suggesting that these varieties have genetic diversity. Incidentally, pig breeds are not genetically homogeneous. Interestingly, CYP3A46 mRNA was clearly detected in both the kidney and the liver of Landrace pigs but was below the detection limit in both organs of Meishan pigs.22) Furthermore, CYP3A46 mRNA was clearly detected in both the kidney and the liver of LM and ML pigs, indicating that expression of CYP3A46 mRNA, as well as serum testosterone,25) is determined by autosomal dominant inheritance. Because 5-month-old male LM and ML pigs, but not Landrace pigs, had high concentrations of serum testosterone (>40 ng/mL), se observó una diferencia de sexo en la cantidad de ARNm de CYP3A46 en cerdos LM y ML pero no en cerdos Landrace. Estos hallazgos sugieren fuertemente que los factores genéticos (de raza) y selectivos de tejidos, junto con la testosterona sérica, están involucrados en los niveles de expresión relacionados con el sexo y la raza de varios genes CYP. Desafortunadamente, estos factores siguen sin estar claros.
En conclusión, aquí demostramos que existen diferencias de sexo y raza en las cantidades de ARNm de las isoformas de las familias CYP2, CYP3 y CYP4 en el riñón de cerdo, y sugerimos fuertemente que esas diferencias dependen de factores genéticos del huésped, incluida la concentración de andrógenos en suero. . Además, mostramos diferencias tisulares entre el riñón y el hígado en la expresión de genes CYP relacionada con el sexo/andrógenos y sugerimos fuertemente que existe un factor selectivo de tejido responsable de la expresión de genes CYP relacionada con andrógenos. En el futuro se requiere investigación para identificar el factor genético del huésped relacionado con el sexo y el factor selectivo de tejido responsable de la regulación de los genes CYP. En cualquier caso, dado que los andrógenos son uno de los factores del huésped que determinan los niveles de expresión de varios CYP responsables del metabolismo de los fármacos, se considera que la medición de la concentración sérica de testosterona contribuye al desarrollo de un tratamiento farmacológico individual adecuado.
Expresiones de gratitud
Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención para la investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (No. 19K06463, MK). Los autores agradecen a la Unidad de Operación Tsukuba 7, Centro de Soporte Técnico de la Región Central, NARO, Tsukuba, Japón por el cuidado de los animales y por la recolección de tejidos.
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