Efectos antiinflamatorios sinérgicos del extracto de Laminaria Japonica Fucoidan y Cistanche Tubulosa

Como respuesta inmune contra antígenos extraños, los macrófagos liberan citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF-), interleucina-1 (IL- 1), IL-6 y otras. Estas citocinas inducen una afluencia quimiotáctica de granulocitos, monocitos, linfocitos y mastocitos al tejido dañado que promueve la eliminación de antígenos y la recuperación del tejido. Sin embargo, la infiltración y activación excesiva de las células agrava las lesiones tisulares, provocando edema (exudación vascular) y dolor, que son fenómenos inflamatorios bien conocidos.

El TNF- es un factor importante para inducir la expresión del gen de la óxido nítrico sintasa (iNOS) en varias líneas celulares. La activación de iNOS conduce a la producción de óxido nítrico (NO) que no solo modula varias funciones fisiológicas como la bactericida y la vasodilatación, sino que también causa inflamación. Después de una lesión tisular, la degradación por las fosfolipasas de los fosfolípidos de la membrana celular genera ácido araquidónico. El ácido araquidónico se descompone aún más mediante la ciclooxigenasa (COX) en prostaglandinas (PG). Una cantidad excesiva de PGE2 formada por la COX-II induce varias citocinas que provocan inflamación. Dado que tanto el NO como la PGE2 actúan como factores importantes para la inflamación y la inducción del dolor, las vías TNF-NO y COX-II-PGE2 son las corrientes principales del proceso inflamatorio, que son inhibidas por los corticosteroides y los no esteroides.medicamentos antiinflamatorios(AINE), respectivamente.

Aunque existen varios esteroides y AINE parala terapia de enfermedades inflamatorias, estos fármacos pueden provocar efectos adversos sobre el sistema inmunológico, el tracto gastrointestinal, los riñones, el hígado, el sistema nervioso central, la presión arterial y el sistema cardiovascular. Por tanto, es necesario minimizar los efectos adversos de las terapéuticas químicas reemplazándolas o usándolas en combinación con productos naturales.

El fucoidan, un complejo de polisacáridos de sulfato procedente de algas como Laminaria japonica y Cladosiphon okamuranus, ampliamente distribuido en muchos países, se ha utilizado como terapéutico en la medicina oriental durante un largo período. En estudios previos, se ha demostrado que el fucoidan tiene propiedades antioxidantes, anticoagulantes, anticancerígenas yactividades antiinflamatorias. En consecuencia, los efectos beneficiosos del fucoidan sobre las enfermedades inflamatorias, la isquemia, la disfunción inmune y los tumores están atrayendo la atención de los investigadores. Por otro lado,cistanche tubulosa(CT) también se ha utilizado ampliamente como medicamento tradicional en China. Se informó que los extractos de CT reducen la producción de TNF-á e IL- 4, que son factores importantes para la producción de NO en las vías inflamatorias [19].

Estos hallazgos previos nos llevaron a investigar la eficacia combinada de fucoidan y extracto de CT en las 2 vías principales de inflamación. Para dilucidar el mecanismo de acción, analizamos NO y PGE2 en los exudados de la inflamación de las bolsas de aire inducida por carragenina.

CISTANCHA TUBULOSA NATURAL PARA PREVENIRACTIVIDADES INFLAMATORIASPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiales y métodos

Materiales

El fucoidan semipurificado y el extracto acuoso de CT se obtuvieron de Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Corea). Fucoidan y extracto de CT se mantuvieron a 4 grados, se mezclaron (1:3) se disolvieron en agua purificada antes de su uso y se administraron por vía oral en un volumen de 5 ml/kg.

Cultivo celular y NO cuantificación.

La línea celular RAW 264.7 de macrófagos murinos se adquirió de la American Type Culture Collection (Manassas, EE. UU.) y se cultivó en medio Eagle modificado por Dulbecco (Sigma, St. Louis, EE. UU.) que contenía suero bovino fetal al 10 % y antibióticos [100 U/ml penicilina (Sigma) y estreptomicina 100 µg/mL (Sigma)]. Las células se incubaron en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 grados.

Para evaluar los efectos del fucoidan y el extracto de CT sobre la secreción de NO, se incubaron células RAW 264,7 (1×106 células/mL) con fucoidan o extracto de CT (1–320 µg/mL) durante 5 min. , seguido de interferón- (IFN-, 10 U/mL) y lipopolisacárido (LPS, 10 µg/mL) durante 24 horas. En nuestros estudios preliminares, se confirmó que el tratamiento con IFN-más LPS para la activación de células RAW 264.7 no afectó la viabilidad de las células hasta 24 horas y que el fucoidan y el extracto de CT no fueron citotóxicos hasta 1 mg/mL. La concentración de nitrito (NO2 – ), el producto oxidado del NO, se midió como indicador de NO. El medio de cultivo se mezcló con un volumen igual de reactivo de Griess (1% de sulfanilamida, 0,1% de naftil etilendiamina en 2,5% de ácido fosfórico) [21] y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. La concentración de nitrito se analizó a 540 nm, donde se utilizó NaNO2 para generar una curva estándar.

Animales y tratamiento.

Se adquirieron ratones ICR macho (7 semanas de edad) de Daehan Biolink (Eumseong, Corea) y se alojaron en una habitación con condiciones ambientales constantes (22 ± 2 ºC; 40-70 % de humedad relativa; 12- horas de luz). -ciclo de oscuridad; 150-300 lux de brillo). El alimento en pellets y el agua purificada estaban disponibles ad libitum. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Nacional de Chungbuk (CBNU), Corea, y se realizaron de acuerdo con los Procedimientos Operativos Estándar (SOP) del Centro de Investigación con Animales de Laboratorio, CBNU.

Los ratones (n=8/grupo) fueron tratados por vía oral con fucoidan (18 o 54 mg/kg), extracto de CT (54 o 162 mg/kg) o su mezcla (18+54, {{6 }} o 90+270 mg/kg) una vez al día durante 7 días. Las dosis bajas de fucoidan (18 mg/kg) y extracto de CT (54 mg/kg) provinieron de dosis humanas estimadas de 100 mg/cuerpo (70 kg) y 300 mg/cuerpo después de la traducción del área de superficie del peso corporal (Km{{14 }} para humanos/Km=3 para ratón), respectivamente. Las dosis altas de fucoidan y extracto de CT se establecieron en 3 veces, solos o en mezcla, y la mezcla de dosis más alta se fijó en 5 veces para evaluar los efectos sinérgicos máximos.

El primer día de tratamiento con fucoidan y extracto de CT, a los ratones se les inyectó por vía subcutánea 10 ml de aire estéril en la parte posterior para formar una bolsa [22,23]. Después de 2 y 5 días, se reinyectó la bolsa con 5 ml de aire. Una hora después del tratamiento final, se inyectó en la bolsa 1 ml de carragenina (1% en solución salina; Sigma) o su vehículo (solución salina).

Análisis de los exudados.

La bolsa de aire se lavó con 1 ml de solución salina fría 6 horas después de la inyección de carragenina y se registró el volumen neto de líquido de lavado. El número total de células inflamatorias, neutrófilos, monocitos y linfocitos se determinó utilizando un contador Coulter. Las concentraciones de NO y PGE2 se determinaron mediante el reactivo de Griess (Sigma) y el inmunoensayo enzimático (EIA) utilizando un kit Correlate-EIA (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA), respectivamente.

CISTANCHE TUBULOSA NATURAL PARA BLOQUEO DE LA ACCIÓN SOBRE QUIMOTAXIS DE CÉLULAS INFLAMATORIAS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Examen histopatológico

Se retiró el tejido que recubría la bolsa y se fijó en una solución neutra de formalina. Los portaobjetos de tejido incluidos en parafina se tiñeron con hematoxilina-eosina y se examinaron bajo un microscopio óptico para detectar lesiones inflamatorias.

análisis estadístico

Los resultados se presentan como media ± SE. Las comparaciones de grupos experimentales se realizaron mediante análisis de varianza unidireccional seguido de una corrección de la prueba de Tukey. valor AP<0.05 was considered statistically significant.

Resultados

In vitro, el cultivo de células RAW 264.7, el tratamiento con IFN- y LPS aumentaron considerablemente la producción de NO (Figura 1). El tratamiento previo con fucoidan (1–320 µg/ml) no afectó la liberación de NO de la línea celular de macrófagos (Figura 1A). En comparación, el extracto de CT (32–320 µg/mL) suprimió significativamente la producción de NO, lo que indica una actividad antiinflamatoria (Figura 1B).

La inyección de carragenano en la bolsa de aire del ratón aumentó notablemente el volumen de exudado dentro de la bolsa (Figura 2). Este aumento de exudación se atenuó mediante el tratamiento con fucoidan (18 mg/kg) y extracto de CT (54 y 162 mg/kg). En particular, el tratamiento combinado de fucoidan y extracto de CT disminuyó aún más el volumen de exudados, en comparación con los efectos individuales, aunque las combinaciones de dosis más altas (54+162 mg/kg y 90+270 mg/kg) no mostraron eficacia adicional. a la combinación de dosis más baja (18+54 mg/kg) (Figura 2A). El contenido de grado N en la bolsa también aumentó drásticamente después de la inyección de carragenina (Figura 2B). En comparación con el efecto leve del fucoidan, el extracto de CT redujo notablemente la concentración de grado N. El tratamiento combinado de fucoidan y extracto de CT disminuyó aún más el nivel de NO de manera dosis dependiente. De manera similar, el aumento del contenido de PGE2 fue suprimido sinérgicamente por la terapia combinada de fucoidan y extracto de CT (Figura 2C).

Paralelamente a los mediadores inflamatorios en la bolsa, el número de células inflamatorias aumentó drásticamente con la inyección de carragenano: 37,8, 4,8 y 24,1 veces los niveles de control para neutrófilos, monocitos y linfocitos, respectivamente (Tabla 1). Sin embargo, el fucoidan y el extracto de CT redujeron significativamente la infiltración de células inflamatorias, en las que el fucoidan fue algo superior al extracto de CT. Inesperadamente, no se logró ningún efecto sinérgico en la infiltración de células inflamatorias mediante la coadministración de fucoidan y extracto de CT.

Como se deduce de la infiltración de células inflamatorias en los exudados, el tejido subcutáneo que rodea las bolsas de aire exhibió lesiones inflamatorias graves (Figura 3). Se observaron una enorme cantidad de células en el tejido subcutáneo engrosado expuesto al carragenano (Figura 3B), en comparación con las características casi normales en los animales de control (Figura 3A). Estas lesiones inflamatorias se atenuaron notablemente mediante el tratamiento con fucoidan (Figuras 3C y 3D) o extracto de TC (Figuras 3E y 3F).

En particular, se obtuvieron mayores efectos antiinflamatorios mediante la terapia combinada con fucoidan y extracto de CT (Figuras 3G-3I).

Discusión

Utilizando un modelo de inflamación de bolsa de aire inducida por arragenano en grado in viv, la inyección de aire en el lomo de roedores induce la proliferación de células que se estratifican en la superficie de la cavidad para formar una estructura similar a la membrana sinovial. En este modelo, la inyección de infiltración de células inflamatorias inducida por carragenano aumentó el exudado, lo que es indicativo de fuga vascular. La bolsa de aire sirve como depósito de células inflamatorias y mediadores que pueden medirse fácilmente en el líquido que se acumula localmente.

Entre los diversos mediadores inflamatorios que pueden inducir la permeabilidad vascular, es bien sabido que el NO y la PGE2 son factores importantes implicados en la patogénesis de muchas enfermedades inflamatorias. También se les conoce como mediadores de la inducción y percepción del dolor. iNOS, que se expresa y activa en diversos tipos de células mediante estimulación con TNF y/o LPS durante la inflamación, produce concentraciones altas y persistentes de NO. El NO es una molécula reguladora importante en diversas funciones fisiológicas, como la vasodilatación que conduce a la fuga vascular. La PGE2, que se genera a partir del ácido araquidónico a través de las COX, contribuye al desarrollo de muchas enfermedades inflamatorias, y la sobreproducción de PGE2 en respuesta a diversos estímulos inflamatorios se asocia con una regulación positiva de los niveles de COX-II y la progresión de la inflamación. Por lo tanto, las vías TNF- -NO y COX-II-PGE2 se han considerado dos corrientes principales de procesos inflamatorios, que son bloqueadas por inhibidores de iNOS (corticosteroides) y COX (AINE), respectivamente.

CISTANCHE TUBULOSA NATURAL PARA PROHIBIR ENFERMEDADES INFLAMATORIAS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

En el presente estudio, la administración conjunta de fucoidan y extracto de CT redujo el volumen de exudado en la bolsa, lo que sugiere que poseen actividad supresora contra la fuga vascular (Figura 2A). En comparación con los efectos individuales de cada extracto de fucoidan y CT, el tratamiento combinado aumentó aún más, lo que implica que los compuestos de dos grados actúan de forma sinérgica. Dichos efectos sinérgicos entre fucoidan y extracto de CT fueron respaldados por sus actividades sobre los niveles de NO y PGE2 en los exudados (Figuras 3B y 2C).

Curiosamente, sin embargo, se confirmó que el fucoidan no inhibe directamente la activación de los macrófagos en el ensayo in vitro (Figura 1A). De manera similar, el potencial inhibidor del fucoidan en el ensayo de acumulación de NO y PGE2 in vivo fue relativamente menor que el del extracto de CT (Figuras 2B y 2C). Este mecanismo de acción del fucoidan es diferente de una inactivación directa de las células mediante extracto de CT (Figura 1B). En comparación, fucoidan ejerció una alta eficacia en la inhibición de la infiltración de células inflamatorias en las bolsas (Tabla 1). Fucoidan fue superior al extracto de CT para bloquear la migración de neutrófilos, monocitos y linfocitos a los sitios de lesión tisular inducida por carragenina. Curiosamente, no hubo ningún efecto antimigratorio sinérgico, lo que indica diferentes mecanismos de acción entre el fucoidan y el extracto de CT: es decir, el fucoidan bloquea la infiltración de células inflamatorias, mientras que el extracto de CT inhibe la activación de las células.

Las células polimorfonucleares, especialmente los neutrófilos, son los principales componentes celulares reclutados en los sitios inflamatorios agudos inducidos por la carragenina. Además, las células inflamatorias resultantes, como los macrófagos y los linfocitos, también desempeñan un papel central en el proceso inflamatorio al secretar citoquinas. Cuando se pretrató con fucoidan o extracto de CT, se suprimió notablemente la cantidad de glóbulos blancos que migraron a las bolsas de aire inyectadas con carragenano. Este resultado fue consistente con un efecto que se obtendría con los corticosteroides como la dexametasona, pero no con los AINE, incluida la indometacina. Por lo tanto, se supone que el fucoidan y el extracto de CT tienen en parte propiedades de los esteroides.

Además de la acción bloqueadora de la quimiotaxis de las células inflamatorias, el extracto de CT pareció suprimir la activación de los macrófagos. Esto fue confirmado por sus acciones inhibidoras sobre el NO in vitro e in vivo, que es el principal mediador inflamatorio producido por los macrófagos. Por tanto, el efecto del extracto de CT sobre los macrófagos podría deberse a una supresión de la expresión del ARNm y/o una inhibición directa de la actividad de iNOS en estas células.

PGE2 también es uno de los principales mediadores inflamatorios. Aumenta en paralelo con el edema tisular, que es suprimido por los AINE, inhibidores de la COX. El carragenano puede aumentar la producción de PGE2 al inducir el ARNm de COX-II y la proteína COX-II en el exudado de la bolsa. En este modelo, la carragenina aumentó significativamente la cantidad de PGE2 y fue suprimida sustancialmente por el extracto CT. Es interesante observar que este resultado fue consistente con un efecto que se obtendría con un AINE indometacina. Por lo tanto, de los resultados se infiere que el extracto de CT tiene propiedades adicionales de los AINE. En conjunto, se cree que el extracto de CT ejerció efectos tanto corticosteroides como similares a los AINE en el modelo de inflamación inducida por carragenano y que el fucoidan mejoró laefectos antiinflamatorios del extracto de CTbloqueando la infiltración de células inflamatorias.

Aunque definir el mecanismo de acción exacto requiere más estudios, una mezcla de fucoidan y extracto de CT atenuó notablemente los signos inflamatorios al bloquear las vías TNF-NO y COX-II-PGE2 en la inflamación de las bolsas de aire inducida por carragenina. Estos hallazgos proporcionan evidencia de que el tratamiento combinado de fucoidan y extracto de CT podría ser un candidato prometedor para el alivio de varios tipos de inflamación que responden a los corticosteroides o AINE.

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