Abstracto

Los trastornos de hiperpigmentación de la piel, como el melasma, las pecas y la hiperpigmentación posinflamatoria (PIH), suelen ser desencadenados por la radiación ultravioleta B (UVB), lesiones cutáneas e inflamación local de la piel. El exceso de depósito de melanina perjudica la apariencia de la piel e influye negativamente en el bienestar psicológico del paciente. Los agentes despigmentantes convencionales, como la hidroquinona, se dirigen principalmente a la tirosinasa con acción monomodo y conllevan riesgos de seguridad bien documentados. Las mezclas botánicas naturales multiobjetivo han surgido como alternativas prometedoras para las formulaciones cosméticas funcionales modernas.

Los glucósidos feniletanoides (PhG) son componentes bioactivos característicos aislados deCistanche deserticola, una conocida hierba medicinal procedente de regiones áridas y desérticas. Glabridina (Gla), un isoflavono prenilado extraído deGlycyrrhiza glabra, es ampliamente reconocido como un compuesto natural iluminador de la piel de alta potencia. Esta investigación investigó sistemáticamente el rendimiento antihiperpigmentación sinérgico de los PhG combinados con glabridina. Para la detección preliminar de la proporción de masas se aplicaron ensayos bioquímicos in vitro que incluían pruebas de inhibición de la tirosinasa, DPPH y ABTS⁺ de eliminación de radicales libres. Se construyeron además tres modelos celulares: modelo de pigmentación de células de melanoma de ratón B16F10 irradiadas con UVB; modelo inflamatorio de queratinocitos HaCaT estimulado por lipopolisacáridos (LPS); Modelo de estrés oxidativo HaCaT inducido por AAPH. Se cuantificaron los indicadores que cubren la actividad de la tirosinasa intracelular, el contenido de melanina, la liberación de citoquinas proinflamatorias (IL-6, TNF-), la actividad de la enzima superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT). Se implementó el cálculo del índice de combinación (IC) para identificar cuantitativamente la interacción sinérgica entre los dos extractos botánicos.

Entre las proporciones probadas, las proporciones de masa m(PhGs):m(Gla)=1:1, 5:1 y 10:1 exhibieron una destacada sinergia antioxidante y supresora de tirosinasa. A una concentración total de 0,4 g/l en solución salina tamponada con fosfato (PBS) de pH 6,8, las tasas de inhibición de la tirosinasa alcanzaron el 94,37 % (1:1), el 92,93 % (5:1) y el 88,06 % (10:1). Los porcentajes correspondientes de eliminación de radicales del DPPH fueron 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %; La capacidad de eliminación de radicales catiónicos de ABTS⁺ alcanzó el 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %. A una concentración de trabajo de 25 ug/ml, las tres formulaciones de compuestos no mostraron citotoxicidad significativa hacia las líneas celulares B16F10 y HaCaT. El grupo combinado 1:1 generó una eficacia integral superior: la actividad de tirosinasa intracelular residual cayó al 23,80 %, el contenido relativo de melanina disminuyó al 30,90 %. Además, PhGs/Gla (1:1) ejerció una supresión más fuerte sobre la secreción de IL-6 y TNF y restauró al máximo la actividad de las enzimas antioxidantes SOD y CAT. Los resultados experimentales confirmaron que los PhG combinados con glabridina logran resultados antihiperpigmentación sinérgicos a través de vías triples: inhibiendo la biosíntesis de melanina, mitigando la inflamación de la piel y contrarrestando el estrés oxidativo. La relación de masa 1:1 ofrece un rendimiento biológico integrado óptimo. Este estudio proporciona evidencia experimental que respalda la aplicación decistancheMateriales compuestos de glucósidos de feniletanoide y glabridina en el desarrollo de materias primas para el cuidado de la piel blanqueadoras de origen vegetal y belleza limpia.

Palabras clave: Cistanche deserticolaglucósidos de feniletanoides; glabridina; efecto sinérgico; antihiperpigmentación; antioxidante; antiinflamatorios; materias primas botánicas cosméticas

1. Introducción

La acumulación excesiva de melanina en las capas epidérmicas da como resultado fenotipos heterogéneos de pigmentación de la piel, incluidos melasma, efélides e hiperpigmentación posinflamatoria (PIH). Busque en Google... Múltiples factores impulsores extrínsecos e intrínsecos contribuyen a la sobreproducción patológica de melanina. La irradiación ultravioleta UVB representa el principal desencadenante ambiental; Los traumatismos cutáneos y las respuestas inflamatorias locales crónicas amplifican aún más los trastornos pigmentarios. Está bien establecido que la interferencia entre los queratinocitos epidérmicos y los melanocitos domina la progresión del pigmento. Tras la estimulación externa, los queratinocitos activados liberan especies reactivas de oxígeno (ROS) y mediadores proinflamatorios. Estas moléculas de señalización se difunden y actúan sobre los melanocitos adyacentes, regulando positivamente la actividad catalítica de la tirosinasa, acelerando la síntesis de melanina y promoviendo el transporte de melanosomas hacia los queratinocitos, produciendo finalmente lesiones pigmentadas visibles en la superficie de la piel. En consecuencia, una intervención eficaz para la hiperpigmentación no puede centrarse simplemente en la inhibición de la tirosinasa. Las estrategias terapéuticas multimodales deberían abarcar simultáneamente la inhibición de la melanogénesis, la intervención antiinflamatoria y la neutralización del estrés oxidativo.

Los activos sintéticos tradicionales para aclarar la piel, como la hidroquinona, aportan eficacia despigmentante principalmente mediante la supresión directa de la tirosinasa. Sin embargo, los mecanismos de objetivo único limitan el rendimiento práctico y la aplicación tópica de hidroquinona a largo plazo puede provocar irritación de la piel, dermatitis de contacto y posibles riesgos para la seguridad, lo que limita el alcance de uso de grado cosmético. Los bioingredientes naturales derivados de plantas atraen un interés creciente por parte de los formuladores y consumidores de cosméticos por sus perfiles suaves y acciones farmacológicas de múltiples vías. Las mezclas compuestas de diferentes extractos botánicos son capaces de producir efectos biológicos sinérgicos, mejorando la eficacia general y al mismo tiempo reduciendo los requisitos de dosificación efectiva, lo que abre nuevas direcciones técnicas para la investigación de materias primas cosméticas antipigmentación.

Cistanche deserticola, comúnmente llamado "ginseng del desierto", es una hierba tónica clásica en la medicina tradicional china. Las investigaciones fitoquímicas modernas revelan que los glucósidos feniletanoides (PhG) constituyen su principal fracción farmacológicamente activa, con el equinacósido y el acteósido como compuestos representativos. La investigación farmacológica publicada demuestra que los PhG poseen una sólida capacidad antioxidante, bioactividad antiinflamatoria y un potencial inhibidor de la tirosinasa moderado, lo que implica perspectivas de aplicación prospectivas en materiales dermatológicos para el cuidado de la piel. La glabridina es un compuesto isoflavonoide característico aislado deGlycyrrhiza glabraraíz, conocida en la industria cosmética como "oro blanqueador". Suprime potentemente la melanogénesis y al mismo tiempo modula las cascadas inflamatorias cutáneas. Desde la perspectiva teórica de la medicina tradicional,cistanchenutre la esencia del riñón y tonifica el yang, mientras que las raíces de regaliz tonifican el bazo y eliminan la toxina del calor. La utilización combinada se ajusta a los principios de compatibilidad de compuestos de las terapias dermatológicas a base de hierbas.

La hipótesis mecanicista sostiene que la combinación PhGs-glabridina puede regular la pigmentación de la piel a través de modos de múltiples objetivos y múltiples rutas: inhibiendo conjuntamente la función catalítica de la tirosinasa para cortar el origen de la generación de melanina; apagar la acumulación de especies reactivas de oxígeno; restringir la liberación excesiva de factores proinflamatorios, a fin de interrumpir la amplificación de la señal mediada por ROS y citoquinas para la activación de los melanocitos. Hasta la fecha, pocos artículos de investigación han informado sistemáticamente de una evaluación antihiperpigmentación sinérgica para esta mezcla binaria.

Este artículo se propone explorar los efectos biológicos combinatorios entrecistancheglucósidos feniletanoides y glabridina. Primero se implementaron experimentos bioquímicos in vitro de inhibición de enzimas y de detección de eliminación de radicales. Se construyeron tres modelos celulares representativos que imitaban la deposición de pigmentos, la inflamación de la piel y el daño oxidativo para evaluar la eficacia multidimensional. Se aplicó la metodología del índice combinado para cuantificar las interacciones de sinergia o antagonismo. Nuestro objetivo era determinar la proporción óptima de masa del compuesto, aclarar los mecanismos funcionales de modo triple y proporcionar datos experimentales que respalden el desarrollo de materias primas cosméticas naturales y sinérgicas para iluminar la piel.

2. Materiales y métodos

2.1 Reactivos, cepas celulares e instrumentos de laboratorio

La línea celular de melanoma de ratón B16F10 (STCC20013G‑1) se adquirió de Saierbio Co., Ltd. El queratinocito epidérmico humano inmortalizado HaCaT (iCell‑h066) se obtuvo de iCell Bioscience Inc.cistancheLos glucósidos feniletanoides (PhG) y la glabridina (Gla) fueron suministrados comercialmente por Shaanxi Tianxingjian Biochemical Technology Co., Ltd. Se suministraron tirosinasa de hongos, arbutina, L-tirosina, L-DOPA, DPPH, sal de diamonio ABTS, ácido L-ascórbico (vitamina C), AAPH, LPS, Triton X-100, DMSO y otros reactivos químicos de grado analítico. procedente de los principales proveedores de reactivos bioquímicos. Los consumibles para cultivos celulares incluyeron medio DMEM con alto contenido de glucosa, suero fetal bovino y solución mixta de penicilina y estreptomicina. Los kits de ensayo ELISA dirigidos a la detección de IL-6, TNF-, CAT y SOD total humana se adquirieron de los correspondientes fabricantes de biotecnología.

El equipo de laboratorio clave incluía un lector de microplacas de longitud de onda completa Multiskan FC, una incubadora de CO₂ Heracell 371 (Thermo Fisher); limpiador ultrasónico KQ‑200VDB; baño de agua a temperatura constante; Horno de secado rápido DHG‑9246A; Instrumento de irradiación ultravioleta KN4006B UVB con irradiancia de salida de 8 mW/cm².

2.2 Preparación de la solución de muestra

Se prepararon soluciones madre de PhG y glabridina en tampón PBS de pH 6,8 o disolvente etanol-agua al 50 % (v/v), diluidas en serie hasta concentraciones de trabajo: 0,001 g/L, 0,005 g/L, 0,025 g/L, 0,1 g/L, 0,4 g/L, 0,8 g/L, 1,2 g/L, 1,6 g/L. 2,0 g/l. Se configuraron nueve grupos compuestos a una concentración de masa total fija de 0,4 g/l con proporciones de masa variadas m(PhGs):m(Gla)=40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, designados como PhGs/Gla (40:1) a PhGs/Gla (1:40).

Para los ensayos de experimentos celulares, las muestras de polvo se disolvieron en medio DMEM sin suero para preparar series de soluciones de concentración de trabajo.

2.3 Ensayos bioquímicos in vitro

2.3.1 Ensayo de inhibición de tirosinasa

Se agregaron secuencialmente 50 μl de solución de muestra, 50 μl de PBS con pH 6,8 y 50 μl de solución de sustrato de tirosina de 1 g/LL a cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos. La preincubación se realizó en un baño de agua a 37 grados durante 10 minutos. Posteriormente, se suplementaron 50 µl de solución de tirosinasa de hongo de 0,4 g/l (200 U/ml) y la incubación continuó a 37 grados durante 10 minutos. La arbutina funcionó como sustancia de control positivo, el control en blanco adoptó un tampón PBS de pH 6,8. El valor de absorbancia se midió en una longitud de onda de 490 nm en un lector de microplacas. Fórmula de cálculo de la tasa de inhibición de la tirosinasa:

Tasa de inhibición de tirosinasa (%)={1 − [(A_reaction − A_reaction‑control) / (A_blank − A_blank‑control)]} × 100 %

Donde: A_reacción: absorbancia que contiene muestra, sustrato, PBS y tirosinasa; A_reacción‑control: absorbancia de muestra, sustrato y PBS sin enzima; A_blank: absorbancia del sustrato, PBS y tirosinasa; A_blank‑control: absorbancia solo para sustrato y tampón PBS.

2.3.2 Determinación de eliminación de radicales libres del DPPH

Se disolvió polvo de DPPH en etanol anhidro para preparar líquido de trabajo de DPPH de 0,2 mmol/l. Se disolvieron PhG, glabridina y sustancia de referencia de vitamina C en un disolvente de etanol-agua al 50 % para formar soluciones madre con gradiente de concentración. Se mezclaron uniformemente muestras de mezcla binaria con nueve proporciones de masa. Cada pocillo recibió 100 µL de líquido de muestra más 100 µL de solución de trabajo DPPH. Después de mezclar bien, la microplaca se mantuvo alejada de la luz a temperatura ambiente durante 30 minutos. La lectura de absorbancia se registró a λ = 517 nm. La vitamina C actuó como control positivo, cada grupo experimental se repitió durante 3 réplicas biológicas. Fórmula de tasa de eliminación de DPPH:

Tasa de eliminación de DPPH (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A₁: absorbancia de la muestra + fluido de trabajo DPPH; A₂: absorbancia de etanol al 50 % + fluido de trabajo DPPH; A₃: absorbancia de la solución de muestra mezclada con un disolvente de etanol al 50 %.

2.3.3 Ensayo de eliminación de radicales catiónicos ABTS⁺

Se mezclaron por igual una solución madre de ABTS de 7,4 mmol/l y una solución de persulfato de potasio de 2,6 mmol/l y se incubaron en un ambiente oscuro durante 12 h para producir un reactivo de trabajo ABTS⁺ estable. Las soluciones de muestra se configuraron siguiendo los protocolos descritos en la sección 2.3.2. 40 Se pipetearon μL de solución de muestra y 160 μL de líquido de trabajo ABTS⁺ a los pocillos de la microplaca. Después de una incubación protegida de la luz durante 6 minutos a temperatura ambiente, se midió la absorbancia a 734 nm. Fórmula ABTS⁺ con tasa de eliminación de radicales:

Tasa de eliminación de ABTS⁺ (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A₁: absorbancia de la solución de muestra más la solución de trabajo ABTS⁺; A₂: absorbancia de agua desionizada mezclada con reactivo de trabajo ABTS⁺; A₃: valor de absorbancia de la solución de muestra mezclada con disolvente de agua desionizada pura.

2.4 Procedimientos de cultivo celular

Se cultivaron células de melanoma B16F10 y queratinocitos HaCaT en medio DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con suero fetal bovino al 10 % y penicilina-estreptomicina al 1 %. Parámetros de la incubadora: 37 grados, 5 % de fracción en volumen de CO₂, humedad relativa 70 %. El paso celular y el refresco del medio se realizaron de acuerdo con la densidad de crecimiento celular observada bajo un microscopio óptico invertido. Se recogieron células en fase de crecimiento logarítmico para su posterior siembra en placas de cultivo de 96 pocillos.

2.5 Establecimiento de tres modelos funcionales celulares

2.5.1 Modelo de pigmentación B16F10 inducida por UVB

Después de 1 h de pretratamiento con el medio de muestra correspondiente, la superficie de la capa celular se cubrió con tampón PBS. La intensidad de la irradiación UVB se estableció en 8 mW/cm², la distancia de irradiación en 3 cm y la duración de la irradiación en 110 s. El grupo normal recibió un medio idéntico sin intervención de radiación UVB. El grupo de control del modelo obtuvo un tratamiento previo con PBS seguido de una exposición a dosis iguales de UVB sin suplementación de muestra.

2.5.2 Modelo de activación inflamatoria HaCaT mediada por LPS

Las células HaCaT se preincubaron con medio DMEM de muestra de prueba durante 24 h. Posteriormente, se complementó la solución de lipopolisacárido LPS hasta alcanzar una concentración final de 20 ug/ml y el cocultivo duró otras 24 h. Las células del grupo modelo fueron desafiadas por LPS sin tratamiento previo de muestra. El grupo normal mantuvo un cultivo ordinario en medio completo.

2.5.3 Modelo de estrés oxidativo HaCaT activado por AAPH

Las células recibieron una preincubación de muestra de 24 h. Se añadió reactivo AAPH al medio de cultivo, concentración final de 25 mmol/l, y se continuó la incubación durante 24 h. El grupo de control modelo fue estimulado por AAPH sin intervención de muestra. El grupo de control normal creció en condiciones medias regulares.

Todos los grupos de modelos celulares contenían tres pozos técnicos replicados.

2.6 Prueba de citotoxicidad (Método CCK‑8)

La suspensión celular se ajustó a una densidad de 1 x 10⁴ células/ml y se inoculó en microplacas de 96 pocillos. Después de la adherencia celular, se administró medio de muestra de concentración en gradiente y la incubación continuó durante 24 h, 48 h, 72 h. El reactivo de detección CCK-8 se mezcló con medio DMEM nuevo (fracción de volumen 10 %) reemplazó al medio antiguo, la incubación se realizó durante 60 minutos. El lector de microplacas midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm. Fórmula de cálculo para el porcentaje relativo de viabilidad celular:

Viabilidad celular (%)=[(A_sample − A_blank) / (A_0 − A_blank)] × 100 %

A_sample: absorbancia de los pocillos que contienen células, reactivo CCK‑8 y medio de muestra; A_blank: absorbancia del medio de cultivo más CCK‑8 sin células sembradas; A_0: absorbancia de células y reactivo CCK‑8 cultivadas con medio blanco (sin muestras de prueba).

2.7 Cuantificación de la actividad tirosinasa intracelular

Después de 48 h de procesamiento de establecimiento del modelo, se descartó el sobrenadante celular. La monocapa celular se lavó dos veces con PBS a pH 7,4. Se añadió por pocillo una solución de lisis Triton X-100 al 1 %. La microplaca se congeló a -80 grados en un refrigerador durante 30 minutos y luego se descongeló a temperatura ambiente para lograr la ruptura total de la membrana celular. El tratamiento de precalentamiento a 37 grados duró 5 min. Se complementó con sustrato L-DOPA (10 mmol/l, 10 μl). La microplaca se incubó durante 1 h dentro de una incubadora de CO₂. La absorbancia se detectó a 475 nm para calcular la actividad tirosinasa intracelular relativa.

2.8 Medición del contenido de melanina intracelular

Se adoptó el método de escisión de NaOH para la detección del contenido de melanina. Después de la intervención del modelo de 72 h, se eliminó el sobrenadante del cultivo, las células se enjuagaron dos veces con tampón PBS . 100 μL, se añadió una solución acuosa de NaOH de 1 mol/L que contenía DMSO al 10 %. La microplaca se incubó dentro de un horno a 90 grados durante 60 minutos para la disolución completa de la melanina. La absorbancia se leyó a 490 nm para calcular el porcentaje relativo del contenido de melanina.

2.9 Detección de indicadores de factores inflamatorios y enzimas antioxidantes

Después de 48 h de procesamiento del modelo, las células HaCaT se rasparon, se recolectaron y se centrifugaron para recolectar el sobrenadante de células. Se utilizaron kits comerciales de ELISA para la determinación cuantitativa de las concentraciones de IL-6 y TNF-proinflamatorias-citoquinas. Para las pruebas de enzimas antioxidantes, los sedimentos celulares se sometieron a ciclos repetidos de congelación y descongelación para lograr la fragmentación celular. Condición de centrifugación: 12 000 r/min, 4 grados, 10 min. La fracción sobrenadante se recogió para analizar la vitalidad de SOD y el contenido de enzima CAT de acuerdo con las especificaciones operativas del kit.

2.10 Análisis del índice combinado (IC)

Se implementó el algoritmo del índice de combinación (IC) de Chou-Talalay para juzgar la interacción sinérgica/aditiva/antagonista entre PhG y glabridina dentro de los ensayos de inhibición de tirosinasa y antioxidantes:

CI=D₁/DX₁ + D₂/DX₂

D₁ and D₂: individual mass‑concentration of PhGs and glabridin inside compound solution, when reaching fixed biological‑effect level X. DX₁ and DX₂: required mass‑concentration for single PhGs or glabridin to produce identical X‑level biological effect. CompuSyn software completed CI‑value computation. Evaluation criteria: CI >1 representa interacción antagónica; CI ≈ 1 significa efecto aditivo; CI< 1 indicates significant synergistic‑enhancement effect.

2.11 Análisis estadístico

Los resultados de las mediciones experimentales se expresaron como valor medio ± desviación estándar (Media ± DE). El software GraphPad Prism 9.5.0 realizó cálculos estadísticos. Se utilizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para la comparación multigrupo. Valor p< 0.05 was regarded as statistically significant difference; P < 0.01 marked significant difference; P < 0.001 stood for extremely significant statistical difference.
 

3. Resultados y Discusión

3.1 Rendimiento inhibidor de la tirosinasa in vitro de muestras de PhG, glabridina y mezclas binarias

Half‑inhibitory concentration IC₅₀ values for single‑component PhGs PBS solution, glabridin PBS solution and positive‑control arbutin were (2.192 ± 0.038) g/L, (1.376 ± 0.025) g/L and (0.101 ± 0.003) μg/mL respectively. In‑vitro tyrosinase‑suppressing potency sequence: arbutin > glabridin >PhG.

A una concentración total de 0,4 g/l para la solución compuesta de PBS, PhGs/Gla (10:1), PhGs/Gla (5:1), PhGs/Gla (1:1) produjeron una tasa de inhibición de tirosinasa de 88,06 %, 92,93 %, 94,37 %. Tanto la proporción 5:1 como la 1:1 superaron la eficiencia de inhibición de los PhG de un solo componente (36,92 %) y de la glabridina de un solo componente (92,71 %) al igualar la concentración de masa total. El grupo 1:1 logró una magnitud de inhibición comparable con la arbutina de control positivo. Según los resultados del cálculo del valor de CI: m(PhGs):m(Gla) que oscila entre 40:1 y 1:1 CI generado< 1, confirming obvious synergistic enhancement on tyrosinase‑suppression. Conversely, proportion series from 1:5 up to 1:40 gave CI >1, que manifiesta interacción antagónica.

Los grupos hidroxilo fenólicos constituyen el resto funcional central de la capacidad inhibidora de la tirosinasa. Los PhG contienen fragmentos estructurales de ortodihidroxifenilo capaces de quelar iones de cobre dentro del bolsillo catalítico activo de tirosinasa, obstaculizando competitivamente la unión sustrato-enzima. El esqueleto de isoflavono de glabridina lleva grupos 2-OH y 4-OH en su anillo B, estructuralmente análogo al anillo aromático sustituido con hidroxilo de L-tirosina/L-DOPA, lo que permite la ocupación competitiva del dominio del sitio activo de la enzima. Después de la mezcla de compuestos, la cantidad acumulada de hidroxilo fenólico aumenta; mientras tanto, dos moléculas pueden unirse a distintos sitios de unión de la proteína tirosinasa, amplificando conjuntamente la eficacia inhibidora.

3.2 Actividad antioxidante eliminadora de radicales de las muestras de prueba

DPPH‑scavenging IC₅₀ data: PhGs (21.135 ± 1.164 μg/mL), glabridin (55.537 ± 5.230 μg/mL), Vitamin C positive reference (2.852 ± 0.252 μg/mL). DPPH radical‑quenching‑ability ranking: Vitamin C > PhGs >glabridina. Los PhG abundan en restos del grupo cafeoilo y del 3,4-dihidroxifeniletanol, y sus sistemas de doble enlace conjugados fortalecen el rendimiento neutralizante de los radicales libres. La estructura de flavonoides de glabridina también proporciona grupos hidroxilo y una arquitectura de anillo conjugado extendida para estabilizar electrones desapareados de especies reactivas de oxígeno.

Tres grupos de compuestos prometedores, PhG/Gla (1:1), (5:1), (10:1) presentaron un excelente rendimiento de eliminación de DPPH y ABTS⁺. La tasa de eliminación de ABTS⁺ casi alcanzó el 100 %, lo que indica una eliminación casi completa de los radicales libres catiónicos. Diferentes proporciones de masa producen diversos estados de interacción molecular entre dos moléculas, lo que lleva a disparidades en el estado de exposición al grupo hidroxilo y resulta en una divergencia de la magnitud sinérgica de los antioxidantes.

3.3 Evaluación de citotoxicidad de PhG, glabridina y preparaciones mezcladas

Las pruebas de citotoxicidad CCK-8 demostraron que los PhG dentro del rango de concentración de 62,5 ~ 500 ug/ml y glabridina de 6,25 ~ 25 ug/ml no desencadenaron una reducción obvia de la viabilidad de las líneas celulares B16F10 y HaCaT. En condiciones de concentración de masa total de 25 ug/ml, tres grupos de proporciones de compuestos PhG/Gla (1:1, 5:1, 10:1) mantuvieron una alta viabilidad celular y no mostraron ningún efecto citotóxico detectable contra ambas cepas celulares. En consecuencia, se seleccionó 25 ug/ml como concentración de trabajo segura para la evaluación posterior de la función celular. Para los grupos de agente único, la dosis baja/media/alta de PhG se definió como 125 ug/ml, 250 ug/ml, 500 ug/ml; Dosis baja/media/alta de glabridina: 6,25 ug/ml, 12,5 ug/ml, 25 ug/ml.

3.4 Influencia sobre la actividad tirosinasa intracelular y el contenido de melanina en células B16F10 estimuladas por UVB

Después del tratamiento con irradiación UVB, el grupo modelo B16F10 mostró una elevación estadísticamente significativa en la actividad de tirosinasa intracelular y la acumulación de melanina (P< 0.001), verifying successful construction of cellular pigmentation‑model. Both single‑agent PhGs and glabridin reduced tyrosinase‑activity and melanin level following concentration‑dependent tendency.

A una concentración total unificada de 25 ug/ml, los grupos de compuestos mostraron resultados biológicos superiores en comparación con sus homólogos de un solo componente. Entre las tres proporciones, PhGs/Gla (1:1) produjo un efecto óptimo: la actividad residual de la tirosinasa intracelular fue solo del 23,80 %, el contenido relativo de melanina cayó al 30,90 %. La comparación estadística reveló diferencias significativas en comparación con los grupos compuestos 5:1 y 10:1. La proporción 1:1 manifestó una amplificación sinérgica prominente para restringir la biosíntesis de melanina dentro de las células de melanocitos.

La irradiación UVB provoca una cascada de señalización melanogénica intrínseca de los melanocitos, regulando positivamente la expresión del factor de transcripción MITF e induciendo aún más la sobreexpresión de la proteína tirosinasa. Los resultados de nuestro experimento celular validaron que los PhG combinados con glabridina podrían revertir eficazmente la activación de tirosinasa inducida por UVB y reducir la generación de melanina.

3.5 Efecto antiinflamatorio hacia los queratinocitos HaCaT desafiados por LPS

La estimulación con LPS elevó fuertemente la secreción de citoquinas proinflamatorias de IL-6 y TNF en el grupo modelo HaCaT (P< 0.001), proving inflammatory‑model replication success. Individual PhGs and glabridin suppressed cytokine release in concentration‑dependent manner.

When comparing three compound ratios at 25 μg/mL, anti‑inflammatory potency sequence was PhGs/Gla (1:1) > PhGs/Gla (5:1) >PhGs/Gla (10:1). La formulación 1:1 generó una reducción máxima de la liberación de IL-6 y TNF, superando el efecto inhibidor obtenido mediante la aplicación separada de PhG o glabridina.

Explicación del mecanismo molecular: la fracción hidroxilo fenólica de PhG elimina los radicales libres que desencadenan la inflamación; además, los PhG pueden interferir en las cascadas de señalización intracelular de NF-κB y MAPK para restringir la transcripción de genes proinflamatorios. La glabridina inhibe la fosforilación de la quinasa JNK y p38 activadas por estrés, bloqueando la transducción de señales inflamatorias posteriores. Una sola sustancia puede simplemente suprimir parcialmente la activación de las vías de señales inflamatorias. La combinación binaria interviene simultáneamente en múltiples nodos dentro de la red de señalización inflamatoria, logrando un rendimiento antiinflamatorio sinérgico.

La inflamación cutánea actúa como factor fundamental para la aparición de PIH. Las citocinas inflamatorias secretadas por los queratinocitos actúan como mensajeros de señalización paracrinos, estimulando a los melanocitos adyacentes para acelerar la producción de melanina y la transferencia de melanosomas. La mitigación eficaz de la inflamación epidérmica es esencial para prevenir y mejorar las lesiones de hiperpigmentación. Por lo tanto, la ventaja antiinflamatoria del compuesto PhGs-glabridina confiere un valor adicional para la aplicación de materiales cosméticos antipigmentación.

3.6 Capacidad de regulación de enzimas antioxidantes en condiciones de estrés oxidativo inducido por AAPH

El grupo del modelo de estrés oxidativo AAPH mostró una disminución obvia de la vitalidad de las enzimas antioxidantes SOD y CAT intracelulares (P< 0.001). Treatment with PhGs or glabridin alone could partially restore SOD and CAT activity. Among compound‑ratio groups, PhGs/Gla (1:1) displayed most powerful capability to elevate SOD and CAT enzyme level inside HaCaT cells.

Skin exposed to ultraviolet radiation generates large‑quantity reactive‑oxygen‑species. Excess ROS not only directly oxidizes melanin‑synthesis‑related biomolecules, but also activates multiple melanogenic signaling pathways. Endogenous antioxidant‑enzyme system (SOD, CAT) constitutes major defense barrier to eliminate intracellular ROS. When oxidative‑stress over‑whelms intrinsic antioxidant capacity, ROS‑accumulation accelerates pigmentation progression. PhGs‑glabridin compound not only directly scavenges free‑radicals via phenolic‑hydroxyl chemical reaction, but also repairs cellular antioxidant‑enzyme‑system function, relieving oxidative‑stress damage from two dimensions. Different mass ratios change molecular‑interaction pattern between two natural molecules, resulting in discrepancy in final antioxidant‑regulating efficacy.

3.7 Discusión integral del mecanismo para la antihiperpigmentación sinérgica

El proceso patológico de hiperpigmentación de la piel forma una red de señalización compleja: la irradiación UVB actúa tanto sobre los melanocitos como sobre los queratinocitos circundantes. Los queratinocitos liberan ROS y citocinas proinflamatorias. Estas bioseñales activan aún más los melanocitos, regulan positivamente la actividad de la tirosinasa, estimulan la biosíntesis de melanina y facilitan el transporte de los melanosomas hacia los queratinocitos epidérmicos, lo que finalmente conduce a la deposición de pigmento visible en la superficie de la piel. En consecuencia, la inhibición de la tirosinasa de un solo objetivo no puede revertir completamente la pigmentación patológica. La estrategia de intervención de múltiples vías debe integrar la inhibición de la melanogénesis, la antiinflamación y la protección antioxidante.

Nuestros resultados experimentales demostraron que los PhG combinados con glabridina realizan una intervención multimodal contra la hiperpigmentación:

Suprime directamente la actividad catalítica de la tirosinasa dentro de los melanocitos para inhibir la fuente de biosíntesis de melanina;

Inhibe la sobresecreción de citoquinas proinflamatorias de los queratinocitos, cortando la señal de estimulación inflamatoria paracrina hacia los melanocitos;

Elimina el exceso de especies reactivas de oxígeno y recupera la actividad enzimática antioxidante SOD/CAT endógena, mitigando la amplificación de pigmentos mediada por el estrés oxidativo.

La relación m(PhGs):m(Gla) = 1:1 mostró un rendimiento sinérgico integral óptimo en la inhibición de enzimas bioquímicas, la eliminación de radicales, el modelo de pigmento de melanocitos, el modelo de inflamación de queratinocitos y el modelo de estrés oxidativo. Esta proporción superó a los grupos de 5:1 y 10:1 en casi todos los indicadores de prueba. La sinergia puede originarse a partir de características estructurales moleculares complementarias: las PhG y la glabridina poseen estructuras de esqueleto fenólico distintas, interactuando con diferentes proteínas diana (tirosinasa, quinasas de señalización inflamatoria, vías relacionadas con enzimas antioxidantes). Después de la mezcla de compuestos, el estado de exposición al hidroxilo fenólico se optimiza mediante la interacción intermolecular, lo que mejora la actividad biológica general.

Desde una perspectiva práctica de la industria cosmética, las materias primas compuestas botánicas sinérgicas aportan dos beneficios principales. En primer lugar, el efecto sinérgico permite reducir la dosis requerida para cada ingrediente activo, lo que reduce el costo de la formulación; En segundo lugar, el perfil funcional de múltiples vías coincide con el complejo mecanismo patológico de la hiperpigmentación de la piel observada clínicamente, como la PIH y el melasma, y ​​ofrece una base teórica para desarrollar fórmulas cosméticas naturales de alta eficacia para iluminar la piel.

4. Conclusión

Esta investigación evaluó sistemáticamente la bioactividad antihiperpigmentación sinérgica deDerivado de Cistanche deserticolaglucósidos feniletanoides (PhG) combinados con glabridina (Gla). Se utilizaron exámenes bioquímicos in vitro y tres modelos celulares representativos para la caracterización multidimensional de la eficacia. Las principales conclusiones experimentales se resumen a continuación:

Dentro de los ensayos bioquímicos in vitro para la inhibición de la tirosinasa y la eliminación de radicales libres, las formulaciones de compuestos m(PhGs):m(Gla) = 1:1, 5:1, 10:1 presentaron un rendimiento inhibidor e interacción sinérgica favorables. Con una concentración total de 0,4 g/l en PBS con pH 6,8, las tasas de inhibición de la tirosinasa alcanzaron el 94,37 % (1:1), el 92,93 % (5:1), el 88,06 % (10:1). Tasas de eliminación de radicales DPPH: 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %. ABTS⁺‑tasas de eliminación de radicales: 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %.

A una concentración de trabajo segura de 25 ug/mL, las soluciones DMEM de PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) no mostraron citotoxicidad contra las células de melanoma B16F10 y los queratinocitos humanos HaCaT. Entre estos grupos, PhGs/Gla (1:1) logró la mejor eficacia integrada: la actividad de tirosinasa intracelular disminuyó al 23,80 %, el contenido de melanina se redujo al 30,90 %. Generó una inhibición más fuerte de la liberación de IL-6, TNF-citoquinas inflamatorias y una restauración máxima de la vitalidad de las enzimas antioxidantes SOD y CAT. El grupo con una proporción de masa de 1:1 exhibió un efecto de mejora sinérgica evidente, superior a los grupos de agente único y otros grupos con una proporción compuesta.

La mezcla binaria de PhG y glabridina ejerce un efecto anti-hiperpigmentación de la piel a través de tres vías: suprimiendo la biosíntesis de melanina, aliviando la inflamación epidérmica y contrarrestando el daño del estrés oxidativo. La relación de masa sinérgica óptima m(PhGs):m(Gla) = 1:1. Este estudio proporciona evidencia experimental y soporte técnico para el desarrollo de materias primas cosméticas multifuncionales naturales derivadas de plantas para aplicaciones antipigmentación y abrillantadoras de la piel.

Expresiones de gratitud

Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 82160772). Agradecemos al Laboratorio Clave de Investigación Clínica de Medicamentos de Xinjiang por el apoyo de la plataforma experimental.

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