Resumenacto

Fondo: Cada vez más estudios han informado el efecto terapéutico de los exosomas derivados de células madre mesenquimales (MSC) por los cuales se caracterizan las proteínas y los miARN. Sin embargo, los perfiles proteómicos y de miARN de exosomas derivados de células madre embrionarias humanas (hESC) y células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) siguen sin estar claros.

El glucósido de cistanche también puede aumentar la actividad de SOD en los tejidos del corazón y el hígado, y reducir significativamente el contenido de lipofuscina y MDA en cada tejido, eliminando de manera efectiva varios radicales de oxígeno reactivos (OH-, H₂O₂, etc.) y protegiendo contra el daño causado en el ADN. por radicales OH. Los glucósidos de feniletanoide de Cistanche tienen una fuerte capacidad de eliminación de radicales libres, una mayor capacidad reductora que la vitamina C, mejoran la actividad de SOD en la suspensión de esperma, reducen el contenido de MDA y tienen un cierto efecto protector sobre la función de la membrana del esperma. Los polisacáridos de cistanche pueden mejorar la actividad de SOD y GSH-Px en eritrocitos y tejidos pulmonares de ratones experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactosa, así como reducir el contenido de MDA y colágeno en pulmón y plasma, y ​​aumentar el contenido de elastina, han un buen efecto de eliminación de DPPH, prolonga el tiempo de hipoxia en ratones senescentes, mejora la actividad de SOD en suero y retrasa la degeneración fisiológica del pulmón en ratones experimentalmente senescentes Con degeneración morfológica celular, los experimentos han demostrado que Cistanche tiene una buena capacidad antioxidante y tiene el potencial de ser un fármaco para prevenir y tratar las enfermedades del envejecimiento de la piel. Al mismo tiempo, el echinacósido en Cistanche tiene una capacidad significativa para eliminar los radicales libres DPPH y puede eliminar las especies reactivas de oxígeno, prevenir la degradación del colágeno inducida por los radicales libres y también tiene un buen efecto de reparación en el daño del anión de radicales libres de timina.

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Métodos: En este estudio, aislamos exosomas de hESC, hiPSC y células madre mesenquimales del cordón umbilical humano (hUC-MSC) mediante ultracentrifugación clásica y un filtro 0.22- μm, seguido de una identificación conservadora. El etiquetado de etiquetas masivas en tándem y la cuantificación de péptidos relativos sin etiquetas definieron juntos su proteómica. Se realizó una secuenciación de alto rendimiento para determinar los perfiles de miARN. Luego, llevamos a cabo un análisis bioinformático para identificar los procesos y vías biológicos dominantes modulados por cargas de exosomas. Finalmente, se realizaron western blot y RT-qPCR para detectar las cargas reales de proteínas y miRNAs en tres tipos de exosomas.

Resultados: Según nuestro estudio, las cargas de tres tipos de exosomas contribuyen a procesos biológicos sofisticados. En comparación, los exosomas hESC (hESC-Exos) fueron superiores en la regulación del desarrollo, el metabolismo y el antienvejecimiento, y los exosomas hiPSC (hiPSC-Exos) tuvieron funciones biológicas similares a las hESC-Exos, mientras que los exosomas hUC-MSC (hUC-MSC-Exos) contribuyeron más a la regulación inmunológica.

Conclusiones: Los datos presentados en nuestro estudio ayudan a definir los paisajes de proteínas y miARN de tres exosomas, predecir sus funciones biológicas a través de un análisis de red sistemático y completo a nivel de sistema, y ​​revelar sus respectivas aplicaciones potenciales en diferentes campos para optimizar la selección de exosomas en preclínicos y clínicos. juicios

Palabras clave: Células madre embrionarias humanas, Células madre pluripotentes inducidas por humanos, Células madre mesenquimales del cordón umbilical humano, Exosomas, Proteómica, miARN

Introducción

Las vesículas extracelulares (EV) son vesículas diminutas secretadas activamente por las células, que contienen principalmente exosomas, microvesículas (MV) y cuerpos apoptóticos [40, 56, 57]. Se distribuyen ampliamente en múltiples fluidos corporales, como la saliva, la leche materna, la sangre, el líquido cefalorraquídeo, la bilis y la orina [57]. Entre ellos, los exosomas tienen una bicapa lipídica con un diámetro de 40 a 200 nm, una densidad de flotación de 1,13 a 1,18 g/ml en el gradiente de sacarosa y una apariencia en forma de copa bajo un microscopio electrónico [21, 53]. Varios compuestos bioactivos, que incluyen proteínas, ácidos nucleicos y lípidos, otorgan la función de comunicación intercelular de los exosomas entre las células [16, 17]. La bicapa lipídica es una barrera delicada que protege el contenido de los exosomas de la degeneración enzimática de los fluidos corporales [49]. Los exosomas estables pueden mediar procesos fisiológicos y patológicos complicados a través de la actividad paracrina, incluido el desarrollo reproductivo y de órganos, la presentación de antígenos, la comunicación neuronal, la respuesta inmunitaria, la regulación del envejecimiento y la proliferación celular [57, 62].

La formación y liberación de exosomas es un proceso totalmente regulado, y la clasificación de los contenidos encapsulados en exosomas se produce mediante la movilización de diversas proteínas [22, 47]. Múltiples proteínas son cruciales para la formación de exosomas, que contienen el complejo de clasificación endosomal requerido para el transporte (ESCRT), tetraspaninas (CD9, CD63 y CD81), gen ligado a la apoptosis 2-proteína X que interactúa (Alix) y susceptibilidad tumoral gen 101 (TSG101) [38, 55]. El tráfico intracelular de exosomas está impulsado por la actividad colectiva de una serie de proteínas, incluidas las RAB GTPasas de interruptor molecular y proteínas del citoesqueleto, como la actina y la tubulina [24]. Posteriormente, la secreción de exosomas se complementa con el complejo SNARE y la familia de sinaptotagminas [22]. La investigación ha determinado que la brotación y el desprendimiento de los exosomas dependen de la actividad del calcio y el reclutamiento de ESCRT [15]. Como mensajero, la liberación de exosomas participa en la diafonía celular en respuesta a la fisiología celular y los cambios patológicos, como la activación, el cambio de pH, la hipoxia, el daño por radiación o el estrés celular [61].

Para descubrir los componentes de los exosomas y sus posibles funciones fisiológicas y patológicas, a menudo se utilizan técnicas proteómicas, transcriptómicas y de otro tipo para estudiar los ARN y las proteínas de los exosomas de diferentes especies, tejidos y células [44]. El análisis proteómico de exosomas generalmente incluye tres pasos: el aislamiento, la purificación y la caracterización de los exosomas, la identificación de los componentes de las proteínas mediante espectrometría de masas y el análisis de datos sin procesar [14]. El estado celular afecta significativamente la composición proteica y la abundancia de exosomas. En la actualidad, las técnicas proteómicas cuantitativas para analizar la caracterización y la abundancia de proteínas se utilizan para dilucidar el mecanismo subyacente a la producción de exosomas y profundizar nuestra comprensión de los roles fisiológicos y patológicos de los exosomas en las células [39]. Entre ellos, las tecnologías proteómicas cuantitativas basadas en espectrometría de masas son ampliamente utilizadas, incluyendo principalmente métodos marcados con isótopos estables y sin etiquetas [13, 42]. Los miARN son pequeñas moléculas bioactivas que están estrechamente asociadas con diversas actividades de la vida. La técnica de secuenciación de alto rendimiento se caracteriza por una alta sensibilidad y precisión y tiene una amplia aplicación en la secuenciación de miARN (18-30 nt) [6]. Dado el desarrollo de la tecnología actual, no hay barrera para diseccionar los perfiles de proteínas y miARN de los exosomas.

Las hESC y las hiPSC tienen un alto potencial de diferenciación [36]. Sin embargo, su aplicación directa en el tratamiento está limitada debido al riesgo de malignidad y cuestiones éticas [31]. Por el contrario, las células madre mesenquimales (MSC) tienen una aplicación más amplia para la intervención en múltiples enfermedades en entornos clínicos [8]. Sin embargo, su uso directo aún enfrenta varias limitaciones, incluida una baja tasa de supervivencia, rechazo inmunológico y problemas de seguridad [8, 43]. Actualmente, se ha prestado mucha atención a los exosomas debido a su bioseguridad, estabilidad, ausencia de aneuploidia y baja inmunogenicidad [51]. Estudios previos han documentado la comparación de componentes de MSC derivadas de diferentes tejidos y sus exosomas que contienen perfiles proteómicos y de miARN [59]. Gong et al. también describió la red reguladora de las vesículas extracelulares (EV) de hESC en términos del proteoma, pero solo en las vías relacionadas con el envejecimiento sin centrarse en otras [19]. Questa et al. tejió el atlas proteómico EV de hiPSCs derivados de fibroblastos de prepucio humano (HFF) [45]. Aunque estos estudios informaron en parte los componentes proteicos de los vehículos eléctricos, no se centraron únicamente en los exosomas, y su análisis proteómico integral no está claramente articulado. En particular, los perfiles de miARN aún no se han descrito. Para abordar esto, los exosomas aislados de hESC, hiPSC y hUC-MSC se seleccionaron en el presente estudio para una mayor investigación dirigida a sus perfiles de proteoma y miARN para obtener nuevos conocimientos para su investigación y aplicación clínica.

Métodos

Preparación y caracterización de exosomas

Las hESC y las hiPSC se cultivaron en medio ncTarget (n.º de cat. RP01020; Nuwacell. Ltd, China), mientras que la 3.ª generación de hUC-MSC se cultivó en medio Mission hMSC sin suero (n.º de cat. RP02010; Nuwacell. Ltd, China). A continuación, se recogieron 350 ml del sobrenadante de las células en la fase de crecimiento logarítmico (~80 por ciento de confluencia) para la purificación del exosoma. Los exosomas se extrajeron mediante una serie de centrifugaciones y ultracentrifugaciones reconocidas, como se describió anteriormente [34, 52]. Brevemente, los medios acondicionados (CM) se recogieron y se sometieron a centrifugación en gradiente (300 × g durante 10 min, 2000 × g durante 15 min, 10, 000 × g durante 30 min) para separar restos celulares. Los exosomas se sedimentaron a partir de los sobrenadantes recolectados a 100, 000xg durante 70 min utilizando un rotor Ti45 (Beckman Coulter, EE. UU.). Luego se resuspendieron en PBS para la siguiente filtración utilizando un filtro de membrana MF-Millipore™ de 0,22-μm (Sigma, EE. UU.). El filtrado se sometió a ultracentrifugación a 100.000 xg durante 70 min. El sedimento de exosomas final se resuspendió en PBS para el siguiente análisis. Se utilizó un sistema de dispersión de luz dinámica (DLS) (Wyatt Technology, EE. UU.) para medir la concentración y el tamaño de los exosomas aislados.

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Se realizó un escaneo TEM para describir la morfología de los exosomas aislados, como se describió anteriormente. Los exosomas resuspendidos (1 ug en 10 ul de PBS) se plantaron en una rejilla de cobre recubierta de carbono (200-mesh) y se les permitió adsorberse durante 2 min, seguido de dos lavados con agua bidestilada. Luego, las rejillas se tiñeron negativamente con 8 μL de solución de acetato de uranilo al 2 por ciento durante 1 min. Después del secado natural, las muestras se examinaron utilizando un sistema Tecnai Spirit (Thermo Fisher, EE. UU.) a 120 kV.

Dispersión dinámica de la luz

La distribución del tamaño de los exosomas se describió mediante un análisis de seguimiento de nanopartículas utilizando un dispersómetro de luz dinámica (Wyatt Technology, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (271-DPN), como se informó anteriormente[23]. Brevemente, el sedimento de exosomas se resuspendió en 100 μL de PBS. Diez, se agregaron 50 μL de los exosomas anteriores a 1450 μL de PBS y se agitaron durante 30 s. Los exosomas (1,5 ml) se transfirieron a una cubeta desechable para equilibrarlos a 25 grados durante 30 s. El valor del índice de refracción del dispersante fue de 1,37, y tanto el promedio Z como la polidispersidad (PDI) determinaron el tamaño de las partículas del exosoma. Se tomaron medidas independientes del árbol para cada muestra.

Etiquetado de etiquetas de masa en tándem (TMT) y análisis de cuantificación relativa de péptidos (LFQ) sin etiquetas

Total protein was extracted from exosomes, and the concentration was quantified using the Bradford method.  The samples were separated by 12.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).  The protein suspensions were digested with trypsin (cat.   no. 9002-07-7; Sigma, USA) in 40 μL of tetraethylammonium bromide (TEAB) buffer for 12  h at 37  °C and then labeled with TMTsixplex™ isobaric label reagent set (cat. no. 90061; Thermo Fisher, USA). TMT-labeled peptides were fractionated by reversed-phase chromatography using an Agilent 1260 Infinity II HPLC system  (Agilent Technology, USA). LC-MSC/MS analysis was performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou,  China). Briefly, the analysis was completed using the combination of a Q Exactive Plus mass spectrometer and Easy nLC (Thermo Fisher, USA). Survey scans were acquired at a resolution of 70,000 at m/z 200. MS/MS   spectra were captured by the MASCOT engine using the built-in software Proteome Discoverer 2.4. Label-free relative peptide quantification analysis was also performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. as previously reported  [27]. Briefly, the digested proteins of exosomes were separated by HPLC and detected by mass spectrometry.  Raw files from technical and biological replicates were filtered, de novo sequenced, and assigned with protein ID   using PEAKS 8.0 by searching against the human SwissProt database. Tree-independent exosome samples were subjected to TMT or label-free assay. The final protein profiles of exosomes were determined by overlapping the data of TMT (mascot score>60, abundance>100 y P<0.05) and label-free (at least two tests results>0 y P<0.05).

Differentially expressed proteins (DEPs) were considered valid after the data were normalized by protein loading and differential p-value false discovery rates (FDR) corrected [30]. In particular, the proteins with log2|fold change|>1 (|log2FC|>1), así como la significación estadística (P<0.05), were classified as enriched in exosomes.

análisis del perfil de miARN

El ARN total se extrajo de los exosomas aislados con el kit de aislamiento de miARN mirVana™ (n.º de cat. AM1560; Thermo Fisher, EE. UU.). Las muestras de ARN se sometieron a una inspección de calidad para el ensayo de micromatrices de miARN realizado por LC-Bio Technology Co., Ltd. El análisis de los datos sin procesar se realizó como se informó anteriormente [9]. Los miARN expresados ​​diferencialmente se seleccionaron como miARN candidatos en un valor p<0.05 and |log2FC|>2. Data were omitted if they corresponded to questionable miRNAs, according to previous reports or in-house validated miRNAs [12]. The miRNA target genes were determined by the overlap of prediction of Targetscan and miRanda databases under the restriction of threshold value>90 (Targetscan) y máxima energía libre<−10 (miRanda).

Análisis bioinformático

Los datos sin procesar se sometieron a análisis utilizando el paquete de software Maxquant (v1.6.0), y los datos de Swiss-Prot_Human se establecieron como referencia (20 600 proteínas) (Proteome ID: UP000005640) . Las proteínas identificadas se asignaron a Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) en función de los términos del análisis KOBAS [60] para determinar sus propiedades biológicas y funcionales. Se utilizó el software Cytoscape y el paquete igraph en el software R (versión 3.6.1) para dibujar la red entrelazada de proteínas de exosomas o miARN entre las vías de señalización.

análisis estadístico

Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. La repetibilidad cuantitativa de las proteínas y los miARN se elevó mediante el análisis de componentes principales (PCA), la desviación estándar relativa y el coeficiente de correlación de Pearson. Los resultados se analizaron usando una prueba t de Student para datos no apareados. Los datos se expresan como el error estándar medio de la media (SEM). Los valores de P se consideraron estadísticamente significativos en *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001.

Resultados

Aislamiento e identificación de exosomas

El cultivo y la identificación de tres células madre pluripotentes humanas se describieron en el archivo adicional 1. Los exosomas se aislaron de los medios acondicionados de tres tipos de células madre (archivo adicional 1: Fig. S1) y se identificaron según la morfología, el tamaño de las partículas, la concentración, y marcadores de superficie [19]. TEM reveló que estos exosomas tenían una morfología en forma de copa (Fig. 1A), y DLS reveló que su distribución de tamaño estaba entre 50 y 200 nm (Fig. 1B). La transferencia de Western indicó que los exosomas aislados portaban los marcadores positivos CD63, TSG101 y HSP70 pero no el marcador negativo calnexina (Fig. 1C). Cada hESC tuvo un rendimiento de exosomas similar al de las hiPSC, y ambos fueron más altos que los de las hUC-MSC (Fig. 1D). Estos resultados indican que se detuvieron exosomas representativos, sin diferencias de forma; sin embargo, se encontraron diferencias entre las concentraciones de exosomas aislados de los tres tipos de células madre.

Bioinformática de proteínas compartidas y top-loaded

The SDS-PAGE and quantitative analyses revealed that while the protein concentrations of hESC-Exos and hiPSC-Exos were not different, they were both higher than those of hUC-MSC-Exos (Additional file 1: Fig.  S2A and B). The PCA plot indicated that exosomes had good uniformity within each group (Additional file 1:  Fig. S2C). The peptide fragments digested via enzymatic hydrolysis passed the quality inspection (Additional file 1: Fig. S2D–G) and then were subjected to the next bioinformatics analysis. Moreover, the proteins of three exosomes were mainly located in the extracellular region,   followed by the cytoplasm (Additional file 1: Fig. S2H).  To describe the protein profiles of the three types of exosomes, we integrated the TMT (Additional file 2) and label-free data (Additional file 3) under the conditions of mascot score>60 and abundance>100 (TMT assay)   and abundance of at least two repetitions>0 (ensayo sin etiquetas). Finalmente, se seleccionaron 554, 437 y 911 semillas para analizar los perfiles de proteínas de hESC-Exos, hiPSC-Exos y hUC-MSC-Exos, respectivamente (Archivo adicional 1: Fig. S3A). Luego, estos candidatos se sometieron a un ensayo de diagrama de Venn para seleccionar proteínas compartidas (archivo adicional 1: Fig. S3B). El análisis bioinformático reveló que las 303 proteínas compartidas dominaban la regulación en estas vías de señalización, incluida la regulación del citoesqueleto de actina, la adhesión focal, PI3K-AKT, el metabolismo del carbono, etc. (Archivo adicional 1: Fig. S3C). El análisis GO también indicó que las proteínas compartidas estaban enriquecidas en exosomas extracelulares, membrana, unión a proteínas y región extracelular (archivo adicional 1: Fig. S3D).

Furthermore, the top-loaded proteins were selected from the candidates with high FDR confidence (TMT   assay) and abundance of each repetition>0 (ensayo sin etiquetas) (Fig. 2A). En función de estos resultados, se examinaron las proteínas 163, 187 y 451 en hESC-Exos, hiPSC-Exos y hUC-MSC-Exos, respectivamente (Archivo adicional 1: Fig. S3E). Luego describimos la curva de abundancia de expresión de los tres tipos de exosomas e identificamos los diez principales símbolos genéticos de proteínas cargadas en los exosomas (Fig. 2B). elLas proteínas altamente cargadas fueron sometidas a bioinformática basada en el algoritmo KOBAS. Los proteomas de los tres tipos de exosomas estaban todos involucrados en una compleja red reguladora de vías de señalización, y luego se ordenaron las 20 vías principales según el valor de -log10 (valor P) (Fig. 2C-E). Todos los proteomas se enriquecieron en la interacción matriz extracelular (ECM)-receptor y vías de señalización PI3K-AKT. El análisis de interacción proteína-proteína (PPI) reveló que las proteínas cargadas en la parte superior tanto en hESC-Exos como en hiPSC-Exos eranenriquecido en el ciclo celular y la vía metabólica, mientras que las proteínas cargadas en la parte superior en hUC-MSC-Exos se enriquecieron en las vías relacionadas con la regulación de la inmunidad (Fig. 2F-H).

Comparación por pares de proteómica de exosomas

Para evaluar la diferencia entre cada dos proteomas de exosomas, construimos un diagrama de Venn para reconocer los grupos de genes de codificación de proteínas únicos y superpuestos. Los genes de codificación de proteínas compartidos se sometieron luego al análisis de volcán y mapa de calor y a GSEA, y las proteínas expresadas diferencialmente se filtraron en P<0.05 and  |log2FC|≥1. Comparison of hESC-Exos and hiPSC-Exos  (Additional file 1: Fig. S4A) revealed that their unique clusters were both enriched in ECM-receptor interaction and complement and coagulation cascades (Additional file 1: Fig. S4B and C) while overlapping clusters participated in multiple signaling pathways, including metabolic, cell cycle, and Hippo pathways (Fig. 3A). Significant differentially expressed protein-coding genes are presented in the volcano plot (Fig. 3 B). Heatmap analysis revealed that Cluster 1 proteins related to developmental biology, TGF-β signaling, and pluripotency regulation were enriched in hESC-Exos. Proteins in Cluster 2,   which were mainly enriched in hiPSC-Exos, were related to taurine and hypotaurine metabolism, RNA transport,   thiamine metabolism, and folate biosynthesis (Fig. 3 C).  GSEA further emphasized the more important role of hESC-Exos in developmental biology and cell cycle compared to hiPSC-Exos (Additional file 1: Fig. S5).

La comparación entre hESC-Exos y hUC-MSC- 1: Fig. S4 D) reveló que los grupos únicos de genes codificadores de proteínas de hESC-Exos estaban principalmente involucrados en EGFR, TGF-, ciclo celular, regulación de pluripotencia y Wnt señalización (Archivo adicional 1: Fig. S4E). Por el contrario, los grupos únicos de hUC-MSC-Exos se enriquecieron en muchas vías de señalización relacionadas con la inmunorregulación, como el sistema del complemento, la regulación de la inflamación y la infección microbiana (Archivo adicional 1: Fig. S4F). Los grupos superpuestos estaban altamente enriquecidos en interacción ECM-receptor, cascadas de complemento y coagulación, y señalización PI3K-AKT (Fig. 3D). El gráfico del volcán muestra las diferencias entre hESC-Exos y hUC-MSC-Exos (Fig. 3E). Las proteínas reguladas al alza en hUC-MSC-Exos (Grupo 1) estaban involucradas principalmente en la respuesta del complemento, la actividad de las células asesinas naturales y la señalización de Rap1 y PPAR. Por el contrario, las proteínas reguladas por aumento de hESC-Exos estaban principalmente involucradas en la señalización de PI3K-AKT, MAPK y AMPK (Fig. 3F). GSEA confirmó la mayor capacidad reguladora de hiPSC-Exos en pluripotencia (Archivo adicional 1: Fig. S6A y D) y la de hESC-Exos en inmunorregulación, incluida la citotoxicidad mediada por células asesinas naturales (Archivo adicional 1: Fig. S6B y E) y regulación de COVID19-SARS-CoV2 (Archivo adicional 1: Fig. S6C y F).

La comparación hiPSC-Exos y hUC-MSC-Exos (Archivo adicional 1: Fig. S4G) reveló que el exclusivo conjunto de genes que codifican la proteína hiPSCExos se asoció significativamente con la unión final no homóloga, el TGF- y el metabolismo de la vitamina B6 (Adicional archivo 1: Fig. S4H), mientras que el de hUC-MSC-Exos estuvo principalmente involucrado en vías relacionadas con la inmunorregulación (Archivo adicional 1: Fig. S4I). Sus proteínas superpuestas también participaron en la regulación de las interacciones ECM-receptor, las cascadas de complemento y coagulación y la señalización de PI3K-AKT (Fig. 3G). El gráfico del volcán presenta las proteínas expresadas diferencialmente (Fig. 3H). Las proteínas del grupo 1 en el mapa de calor indicaron que hUCMSC-Exos regulaba principalmente la respuesta inmune y la vía de señalización de AMPK, mientras que hiPSC-Exos regulaba principalmente el ciclo celular y las vías de señalización de insulina, Hippo y mTOR (Fig. 3 I). GSEA apoyó además el papel dominante de hiPSC-Exos en la regulación de los procesos de desarrollo (Archivo adicional 1: Fig. S7A y D) y el mantenimiento de la pluripotencialidad (Archivo adicional 1: Fig. S7B y E), mientras que hUC-MSC-Exos fueron principalmente involucrado en el proceso de inmunorregulación (Archivo adicional 1: Fig. S7C y F).

Bioinformática de proteomas superpuestos

A continuación, investigamos los proteomas compartidos de los tres tipos de exosomas. En total, 309 genes codificantes de proteínas (Fig. 4A) se sometieron a análisis GO y KEGG. Los resultados indicaron que los conjuntos de genes de codificación de proteínas compartidos entre los tres tipos de exosomas estaban principalmente involucrados en actividades extracelulares y procesos biológicos, incluidos los procesos metabólicos de proteínas celulares, la unión del receptor de señalización, la unión de ATP, la unión de NAD, la cicatrización de heridas y los procesos metabólicos de lípidos (Fig. 4B). También contribuyeron a la construcción de redes reguladoras complejas de vías de señalización como PI3K-AKT, glucólisis/gluconeogénesis, Hippo, oxitocina, HIF-1, ciclo celular y vías AMPK (Fig. 4C). Había relaciones reguladoras intrincadas entre estas vías de señalización proteómica y canónica (Fig. 4D). El gráfico de burbujas evidencia la diferente abundancia de cada grupo de proteínas en la vía de señalización canónica. Mientras que hESC-Exos y hiPSC-Exos podrían tener capacidades reguladoras más fuertes que hUC-MSC-Exos en términos del ciclo celular y las vías de señalización de AMPK, hUC-MSC-Exos podría tener efectos reguladores destacados en las vías de señalización de VEGF y NF-κB (adicional archivo 1: Fig. S8).

El análisis del mapa de calor reveló además diferencias en la expresión de proteínas compartidas (Fig. 4E). En el grupo A, las proteínas implicadas en las vías de señalización del receptor de células B, PI3K-AKT, Hippo y VEGF se enriquecieron en hUC-MSCExos y hESC-Exos. Las proteínas en el Grupo B participaron principalmente en la regulación de la señalización de PPAR, el metabolismo del colesterol y la producción de IgA y se agotaron en hESC-Exos. El hUC-MSC-Exos contenía principalmente proteínas del grupo C, que regulaban la respuesta del complemento, la infección microbiana, la señalización HIF-1, la señalización MAPK, las vías metabólicas y la vía NF-κB. Las proteínas en el grupo d, que se enriquecieron en hiPSC-Exos, participaron en la regulación de la señalización de Ras, la fosforilación oxidativa y la señalización de mTOR. Las proteínas en el grupo e eran más abundantes tanto en hiPSC-Exos como en hESC-Exos que en hUC-MSCExos, y estaban involucradas en múltiples procesos metabólicos, como el ciclo del citrato, el ciclo celular, la señalización de insulina, el metabolismo de ácidos grasos y la señalización de AMPK. . Las proteínas en el grupo f participaron en la regulación de la reabsorción de calcio, la glucólisis/gluconeogénesis, la señalización adrenérgica y el metabolismo del piruvato y se agotaron tanto en hUC-MSCExos como en hiPSC-Exos. Las proteínas en los diferentes grupos se enumeran en el archivo adicional 4.

Perfiles de miARN de los tres tipos de exosomas

Para investigar los perfiles de miARN de los tres tipos de exosomas, se aisló el ARN total de los exosomas para acoplar los extremos 5' y 3' para la transcripción inversa posterior. El cDNA obtenido se usó para la construcción de bibliotecas y pruebas amplias. El número de integridad del ARN (RIN) fue 2,7, 2,6 y 2,6 en hESC-Exos, hiPSC-Exos y hUC-MSC-Exos, respectivamente (Archivo adicional 1: Fig. S9A). La determinación de la concentración de ARN reveló que hESC-Exos dominaba la carga de ARN, seguido de hiPSC-Exos y hUC-MSCExos (Archivo adicional 1: Fig. S9B). El coeficiente de correlación de Pearson (archivo adicional 1: Fig. S9C) y PCA (archivo adicional 1: Fig. S9D) se utilizaron para evaluar cuantitativamente la repetibilidad de los miARN. Se usaron mapas de calor para representar los miARN expresados ​​diferencialmente en los tres tipos de exosomas (archivo adicional 1: Fig. S9E), y el número de miARN expresados ​​diferencialmente en P<0.05 or 0.01,   was evaluated between each two exosome types (Additional file 1: Fig. S9F). Based on the sequencing results, the top 20 miRNAs in each of the three exosome types were identified (Fig. 5 A–C). In hESC-Exos, has-miR-302 dominated the read counts and comprised has-miR-302b-3p,   has-miR-302a-5p, and has-miR-302d-3p (Fig.  5A). The three miRNAs with the highest read counts were has-miR- 372-3p, has-miR-371a, and has-miR-302a in hiPSC-Exos and has-miR-21-5p (Fig.  5B), has-miR-146a-5p, and hasmiR-320a-3p in hUC-MSC-Exos (Fig. 5C).

Para investigar los miARN involucrados en los procesos biológicos, los miARN principales se filtraron en P<0.05 and read count>1000 para una mayor predicción del gen diana. Luego, los genes enriquecidos se sometieron a análisis GO y KEGG. Los resultados indicaron que los miARN hESC-Exos afectaron significativamente los siguientes procesos: Rap1, PI3K-AKT, calcio, Hippo, cAMP, ErbB, Foxo, ciclo celular, vía de señalización de AMPK, etc. (análisis KEGG) (Fig. 5D), y el ciclo celular, el desarrollo de múltiples organismos, la transducción de señales intracelulares, la diferenciación celular, el envejecimiento, la señalización de Wnt y el metabolismo de los ácidos grasos. (proceso biológico) (Fig. 5G). El enriquecimiento del gen objetivo de los miARN hiPSC-Exos indicó que los siguientes procesos estaban significativamente regulados: PI3K-AKT, Rap1, Ras, Calcium, Hippo, cAMP y cGMP-PKG, etc. (análisis KEGG) y el ciclo celular, desarrollo de múltiples organismos, fosforilación, diferenciación celular, migración celular y respuesta a la hipoxia. (proceso biológico) (Fig. 5H). En la red reguladora de miRNAs de hUC-MSC-Exos, los procesos biológicos más plausibles fueron: Rap1, Ras, PI3K-AKT, calcio, cAMP, Hippo, el ciclo celular, JAK-STAT y la vía de señalización HIF-1 . (análisis KEGG) (Fig. 5F) y fosforilación, transducción de señales intracelulares, unión de ATP, división celular, metabolismo de lípidos, coestimulación de células T, cicatrización de heridas, unión de NF-κB y respuesta inflamatoria. (proceso biológico) (Fig. 5 I). También se representó la red de los cinco miARN principales y sus vías reguladoras (Archivo adicional 1: Fig. S10).

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