Dirigirse a la catepsina B mediante cicloastragenol mejora la inmunidad antitumoral de las células T CD8 mediante la inhibición de la degradación del MHC-I Parte 1

ABSTRACTO

FondoLa pérdida de antígenos tumorales y el agotamiento de las células T CD8 causadas por la vía PD-1/PD-L1 son factores importantes para el escape inmunitario del tumor. En los últimos años, ha habido una creciente investigación sobre la medicina tradicional china en el tratamiento de tumores. Se ha descubierto que el cicloastragenol (CAG), una molécula activa eficaz en Astragalus membranaceus, tiene funciones antivirales, antienvejecimiento, antiinflamatorias y otras. Sin embargo, su efecto antitumoral y su mecanismo no están claros.

El glucósido de cistanche también puede aumentar la actividad de SOD en los tejidos del corazón y el hígado, y reducir significativamente el contenido de lipofuscina y MDA en cada tejido, eliminando de manera efectiva varios radicales de oxígeno reactivos (OH-, H₂O₂, etc.) y protegiendo contra el daño causado en el ADN. por radicales OH. Los glucósidos de feniletanoide de Cistanche tienen una fuerte capacidad de eliminación de radicales libres, una mayor capacidad reductora que la vitamina C, mejoran la actividad de SOD en la suspensión de esperma, reducen el contenido de MDA y tienen un cierto efecto protector sobre la función de la membrana del esperma. Los polisacáridos de cistanche pueden mejorar la actividad de SOD y GSH-Px en eritrocitos y tejidos pulmonares de ratones experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactosa, así como reducir el contenido de MDA y colágeno en pulmón y plasma, y ​​aumentar el contenido de elastina, han un buen efecto de eliminación de DPPH, prolonga el tiempo de hipoxia en ratones senescentes, mejora la actividad de SOD en suero y retrasa la degeneración fisiológica del pulmón en ratones experimentalmente senescentes Con degeneración morfológica celular, los experimentos han demostrado que Cistanche tiene una buena capacidad antioxidante y tiene el potencial de ser un fármaco para prevenir y tratar las enfermedades del envejecimiento de la piel. Al mismo tiempo, el echinacósido en Cistanche tiene una capacidad significativa para eliminar los radicales libres DPPH y tiene la capacidad de eliminar las especies reactivas de oxígeno y prevenir la degradación del colágeno inducida por los radicales libres, y también tiene un buen efecto de reparación en el daño del anión de radicales libres de timina.

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MétodosEl efecto antitumoral de CAG se investigó en modelos tumorales trasplantados en ratones MC38 y CT26. El efecto antitumoral de CAG se analizó más a través de la secuenciación multiómica de una sola célula. Se utilizó la tecnología de perfilado de accesibilidad sensible al objetivo para encontrar la proteína objetivo de CAG. Posteriormente, se exploró el mecanismo antitumoral de CAG mediante microscopía confocal, inmunoprecipitación y transfección de plásmidos mutantes. Finalmente, se investigó el efecto antitumoral combinado de los anticuerpos CAG y PD-1 en ratones u organoides.

ResultadosEncontramos que CAG inhibió efectivamente el crecimiento tumoral in vivo. Nuestro atlas multiómico de una sola célula demostró que CAG promovió la presentación de antígenos de superficie de células tumorales y se caracterizó por la función de destrucción mejorada de las células T CD8 plus. Mecánicamente, CAG se unió a su proteína diana, la catepsina B, que luego inhibió la degradación lisosomal del complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC-I) y promovió el agregado de MHC-I a la membrana celular, impulsando la pre-estación del antígeno tumoral. . Mientras tanto, la combinación de CAG con el anticuerpo PD-1 mejoró de manera efectiva las células T CD8 plus que matan tumores en ratones con xenoinjerto y organoides de cáncer colorrectal. Conclusión Nuestros datos informaron por primera vez que la regulación a la baja de la catepsina B confiere inmunidad antitumoral y agota el mecanismo antitumoral del producto CAG natural.

INTRODUCCIÓN

El cáncer colorrectal es uno de los cánceres más comunes en todo el mundo. Su tasa de incidencia y tasa de mortalidad se encuentran entre las tres principales y amenazan seriamente la vida y la salud humanas.1 Los métodos de tratamiento comunes incluyen cirugía, quimioterapia y radioterapia, medicamentos dirigidos e inmunoterapia.2–4 Sin embargo, las células cancerosas generalmente presentan pérdida de antígenos de superficie y expresan altos niveles de inhibir las moléculas para escapar de la vigilancia de las células inmunes. Por lo tanto, para resolver el problema del escape inmunitario del tumor, los investigadores han desarrollado inhibidores del punto de control inmunitario y terapia con neoantígenos para bloquear el enmascaramiento de las células cancerosas a las células inmunitarias.5–8 Aunque los inhibidores del punto de control inmunitario pueden restaurar las células inmunitarias agotadas, el antígeno de superficie del cáncer las células no se ha mejorado significativamente. Por lo tanto, es particularmente importante encontrar fármacos que puedan promover la presentación de antígenos de superficie tumoral. El reconocimiento de células cancerosas por parte de las células T citotóxicas CD8 plus depende de la vía TCR/CD3/complejo mayor de histocompatibilidad (MHC-I). El TCR recibe el antígeno presente por la proteína CI de la membrana de la célula dendrítica/célula cancerosa y transmite la señal para conectar firmemente el CD3, que luego se extiende más profundamente en el citoplasma.9 10 Al mismo tiempo, con la activación de la señal CD28/B7 , las células T CD8 plus se pueden coactivar para reconocer y destruir las células cancerosas.11 Estudios recientes han encontrado que, en el proceso de progresión del tumor, los lisosomas dan como resultado la reducción de la agregación de MHC-I en la superficie de las células cancerosas, lo que no actúa de manera efectiva. presentan antígenos.12 13 Liu et al informaron que la inhibición de PCSK9 puede prevenir la degradación de MHC-I en los lisosomas y permitir que MHC-I regrese a la membrana celular para presentar antígenos.12 Por lo tanto, restaurar la función presentadora de antígenos de MHC-I es particularmente importante para bloquear el escape inmune del tumor.

Un número creciente de estudios ha encontrado que la aplicación de moléculas activas de la medicina tradicional china en la intervención antitumoral tiene grandes perspectivas.14 15 El cicloastragenol (CAG) es una molécula activa eficaz en Astragalus membranaceus, que tiene propiedades antivirales, antibacterianas, anti- inflamatorio y otros efectos farmacológicos, pero su efecto antitumoral rara vez se informa. 16–19 catepsina B (CTSB), promoviendo la presentación de antígenos de las células cancerosas y luego mejorando la capacidad de destrucción de las células T CD8 plus.

MATERIALES Y MÉTODOS

Anticuerpos y reactivos

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 por ciento). Anticuerpos de CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929 ), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426 ), Actina (Cat#{{ 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), tubulina (Cat#10094-1-AP, PRID: AB_2210695 ) y kit de detección de inmunohistoquímica anti-ratón/conejo (Cat#PK10006) fueron adquiridos de Proteintech. Anticuerpos de H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853), y CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology. El anticuerpo de Ki-67 (Cat#12202, PRID: AB_2620142) se adquirió de Cell Signaling Technology. El anticuerpo de la Na/K ATPasa (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) se adquirió de Abcam. Anticuerpos de citometría de flujo de CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003) y CD{ {31}}PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802 ) se adquirieron de BD Bioscience. El anticuerpo de citometría de flujo de Gzmb-FITC (Cat# 515403, RRID: AB_2114575) se adquirió de BioLegend. Anticuerpos de citometría de flujo de NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) e IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID :AB_466192) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific. El medio DMEM (Cat#01-052-1ACS), PenicilinStreptomicina (Cat#15140122) y Fetal Bovine Serum (Cat#C04001-500) se adquirieron de Biological Industries. El suero de cabra (n.º de catálogo 88RNG001) y el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (n.º de catálogo 23225) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific. Los anticuerpos de PD anti-humano-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) y anti-PD de ratón-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) se adquirieron de Bio X cell. El kit de disociación de tejido tumoral MACS (Cat#130-095-929) se adquirió de Miltenyi Biotec.

Cultivo de células

Las líneas celulares de cáncer de colon de ratón MC38 y CT26 se mantuvieron en nuestro laboratorio.20 Las líneas de cáncer de colon humano l HCT-116 se obtuvieron de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). Las células MC38, CT26 y HCT-116 se cultivaron en un medio DMEM que contenía suero bovino fetal al 10 por ciento y penicilina/estreptomicina al 1 por ciento a 37 grados en una incubadora con CO2 al 5 por ciento.

Experimento de trasplante de tumor

Se adquirieron ratones hembra C57BL/6JGpt, ratones BALB/c y ratones desnudos BALB/c de seis y ocho semanas de edad de GemPharmatech (Nanjing, China). Se inocularon por vía subcutánea células cancerosas MC38 o CT26 (1 x 106) en cada ratón. Cuando el tumor crece hasta 100 mm3, el mic se dividió aleatoriamente en el grupo de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (p. ej., una vez al día) y el grupo CAG (p. ej., 50 mg/kg una vez al día). Los volúmenes de los tumores se determinaron mediante medición con calibre usando la fórmula V=longitud × anchura2/2. Cuando el volumen del tumor de los ratones del grupo PBS alcanzó los 1000 mm3, se extrajo, fotografió y pesó el tumor de los ratones.

Disociación unicelular del ratón para ARN/ATACseq unicelular

Se digirieron tumores sólidos de ratones utilizando el kit de disociación de tumores para obtener células individuales de células individuales. Single celSingle-cell s con una concentración de 1000 células/1000 células cargadas en las células individuales del controlador de cromo 10xgenomics siguiendo el protocolo del fabricante 10xgenomics. Los reactivos de transcripción inversa, las perlas de gel con código de barras y el aceite de partición se mezclaron con las células para que gen genere perlas de gel en emulsiones (GEM) para la transcripción inversa. Preprocesamiento de datos scRNA-seq y control de muelle.

Basado en el genoma de referencia del ratón GRCm38 (mm10), la canalización CellRanger V.4.0.0 (10×Genomics) para procesar ARN unicelular datos de secuencia para cada experimento (GSE197229). Las matrices de expresión génica digital se zed en R (V.4.0.4) utilizando el paquete Seurat (V.4.0.0).21 Antes del análisis dBeforem, las células se filtraron por número UMI (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

Preprocesamiento de datos SeaTac-seq y control de calidad

Los datos ATAC-seq de una sola celda (GSE197229) fueron preprocesados ​​por cell ranger-at (V.2.0.0) con la línea de comando de conteo. Para el posterior procesamiento y análisis de datos de scATAC-seq, usamos el paquete ArchR (V.1.0.1).24 Luego, usamos la función addArchRGethe nome ("mm10") para la anotación del genoma y creamos un archivo de flecha con la función cre ArrowFiles con los parámetros predeterminados. A continuación, usamos la función filterDoublets para eliminar los dobletes potenciales y creamos un proyecto ArchR usando la función ArchRProject con parámetros predeterminados. Luego usamos el paquete Harmony para eliminar el efecto por lotes mediante la función addHarmony.25 Para la reducción de la dimensionalidad, usamos la función addIterativeLSI en ArchR para ejecutar con los parámetros def t. Para la incrustación de una sola celda, seleccionamos el objeto de dimensiones reducidas con armonía y usamos la función addTSNE con el parámetro 'perplejidad=30' para la visualización.

Análisis integrado de datos de siRNA-seq y scATAC-seq

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Para mejorar la precisión de las predicciones para integrar mejor los dos conjuntos de datos, una vez más integramos los datos scATAC-seq y scRNA-seq utilizando el modo de "integración restringida". Brevemente, anotamos los datos de scATAC-seq con tipos de células en función de las puntuaciones genéticas de scATAC-seq. Luego, creamos una lista restringida de modo que la similitud de la expresión génica se calculó solo en el mismo tipo de célula para scATAC-seq y scRNA-seq. El agrupamiento no supervisado con t-SNE reveló 13 grupos de subcélulas, que fueron anotados por marcadores conocidos o putativos en la Tabla 1 complementaria en línea.

Trayectoria del linaje del pseudotiempo

La trayectoria del linaje celular de las células cancerosas se dedujo mediante el uso del paquete R Monocle2 (V.2.18.0). procesos biológicos de manera robusta y precisa.27 Usamos la función '' differentialGeneTest '' para derivar DEG de cada grupo, y después de construir la trayectoria celular, detectamos los genes expresados ​​​​diferencialmente en el pseudo tiempo. Todos los genes pseudodependientes del tiempo se visualizaron mediante la función plot_pseudotime_heatmap tomando un objeto CellDataSet. Los diagramas de trayectoria de linaje y las curvas de expresión suave basadas en CellDataSet se generaron mediante plot_cell_trayectoria y plot_genes_in_pseudotime, respectivamente.28

Llamada de variación de número de copia de celda única

Para identificar células malignas con variaciones en el número de copias cromosómicas (CNV) clonales a gran escala, utilizamos el paquete inferCNV R para inferir los perfiles genéticos de cada célula en función de la expresión promedio de grandes conjuntos de genes en cada región cromosómica del genoma tumoral en comparación con células normales.29 Muestra por muestra, las células inmunitarias se usaron como referencia para estimar las CNV en las células relacionadas con el cáncer.

Análisis de enriquecimiento

Los análisis de la ruta KEGG y la anotación GO se realizaron con el paquete R clusterProfiler (V.3.11.1) con parámetros de PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10 y MaxGSSize=500.20 Se aplicó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) usando 50 conjuntos de genes distintivos (h.all.V.7.4.symbols. gmt) para identificar significativamente enriquecidos vías funcionales a través del software GSEA (V.4.1.0), con criterios de selección de valor P nominal<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real

Se sembraron células MC38 y HCT-116 en placas de seis pocillos durante 6 horas y luego se trataron con CAG durante otras 24 horas. Las células se lavaron tres veces con PBS frío y se centrifugaron a 180g durante 5 minutos a 4 grados. Al mismo tiempo, después de moler el tejido tumoral. El ARN total se extrajo de células MC38, HCT-116 y tejido tumoral utilizando el reactivo TRIzol, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El volumen de reacción fue de 20 µL que contenía: 1 µg de ARN, 5 µL de 5×Hiscript III qRT SuperMix y RNase Free dH2 O. El cDNA se sometió a PCR cuantitativa, con un volumen de reacción de 10 µL con 1 µL de cDNA, 5 µL de mezcla de qPCR, 0,75 µL de cebadores 5 µM (hacia delante y hacia atrás) y 3,25 µl de dH2O libre de RNasa. Los cebadores fueron sintetizados por GenScript Biotech Corporation (Nanjing, China) de acuerdo con las siguientes secuencias (tabla 2 complementaria en línea).

Descubrimiento de objetivos a través de un enfoque de creación de perfiles de accesibilidad que responde al objetivo

La detección de proteínas de unión a CAG se realizó como se describió anteriormente.31 32 En resumen, se empleó el enfoque de perfil de accesibilidad sensible al objetivo (TRAP) para descubrir las proteínas de unión para CAG en el medio celular mediante el control de la lisina inducida por la participación de ligandos. la accesibilidad cambia a nivel de proteoma. Brevemente, se trataron dos placas de células con CAG 10 µM y dimetilsulfóxido (DMSO), respectivamente. Después de 1- horas de incubación, las células se permeabilizaron con tampón M-PER (Thermo Scientific) y los lisados ​​resultantes se marcaron covalentemente mediante la adición de formaldehído y un complejo de boranopiridina que, en conjunto, marcan específicamente los residuos de lisina proteica a temperatura ambiente para el perfil de accesibilidad. . Luego, los lisados ​​se precipitaron con un solvente orgánico y los sedimentos recolectados se redisolvieron en 8 mol/l de urea, se redujeron con ditiotreitol (DTT) a 56 grados durante 30 minutos, seguido de alquilación con yodoacetamida (IAA) en la oscuridad durante 30 minutos. Se añadió de nuevo una cantidad adecuada de solución de DTT para que reaccionara con el exceso de IAA. Posteriormente, el proteoma se diluyó con solución de bicarbonato de amonio hasta que la concentración final de urea alcanza 1 mol/L. Los productos de digestión de proteínas recogidos se desalinizaron en columnas C18 HLB (Waters, Milford, Massachusetts, EE. UU.), y los péptidos enriquecidos se secaron y reconstituyeron en una solución acuosa de ácido fórmico (FA) al 0,1 por ciento. Se empleó el sistema AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF (Waters) para analizar las muestras para obtener un perfil cuantitativo de los cambios de accesibilidad de la lisina en respuesta a la unión de CAG para el descubrimiento de objetivos. Se empleó la adquisición de dependencia de datos en el modo positivo para la adquisición de datos. El análisis de datos se realizó con PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Canadá). Específicamente, la alquilación de cys se seleccionó como una modificación fija, y la oxidación de metionina y la dimetilación de lisina, logradas mediante marcaje con TRAP, se establecieron como modificaciones variables. Brevemente, los péptidos que contienen dimetilación inducida por TRAP y exhibieron cambios de abundancia significativos con y sin incubación CAG se asignaron como péptidos sensibles al objetivo. La proporción de la abundancia de cada péptido marcado con TRAP indica el alcance del cambio de accesibilidad y está íntimamente asociada con la afinidad de unión al ligando. Se llevó a cabo la prueba t de Student para evaluar si los cambios de accesibilidad detectados de los péptidos marcados son estadísticamente significativos. Un valor p intergrupal (p<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Cultivo de organoides

Los organoides de cáncer colorrectal humano fueron construidos y cultivados por Chongqing Kingbiotech.33 Las muestras de tejido de pacientes adquiridas mediante la operación quirúrgica se trituraron en trozos lo más pequeños posible con tijeras estériles. Las piezas de tejido se mezclaron completamente con Matrigel (Corning, Cat#356231) en una proporción aproximada de 1:4 en hielo. El procesamiento posterior se refirió a los protocolos publicados. Brevemente, las suspensiones de piezas-Matrigel se sembraron rápidamente en la placa multipocillo para formar gotas hemisféricas y se transfirieron a 37 grados durante 15 a 20 minutos, lo que permitió que las gotas se solidificaran. Se agregó la cantidad adecuada de medio de cultivo (medio de crecimiento organoide KingcultureTM, n.° de catálogo KCW-2) ​​a cada pocillo y se cambió el medio cada 2 a 4 días.

Aislamiento y cultivo de células T CD8 humanas

Agregue el mismo volumen de solución salina normal a la sangre periférica de personas sanas que contengan anticoagulantes para diluir la sangre completa. Agregue un cierto volumen de solución de separación a un tubo de centrífuga de 15 ml, agregue lentamente la sangre entera diluida a lo largo de la pared del tubo hasta la parte superior de la solución de separación y centrifugue a 750 g durante 20 minutos. Después de la centrifugación, utilice una pipeta para succionar con cuidado los monocitos de la capa blanca media en un tubo de centrífuga de 15 ml, agregue un cierto volumen de PBS para volver a suspender, centrifugue 250 g durante 5 minutos y deseche el sobrenadante. Después de añadir perlas magnéticas CD8 humanas a los precipitados celulares, las células T CD8 se clasificaron mediante la columna de clasificación LS. Se agregaron células T CD8 a la placa perforada recubierta previamente con 5 µg/ml de anticuerpo CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578) y luego 10 ng/ml de IL{{15} } (Peprotech Cat# 212-12) y 5 µg/ml de anticuerpos funcionales CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) se añadieron cultivados durante 24 horas.

cocultura

Después de incubar los organoides con CAG durante 24 horas, se reemplazó el medio de cultivo fresco y luego los organoides y las células T CD8 activadas se suspendieron en el gel matriz, luego se agregó la suspensión a la placa de seis pocillos y se colocó en el 37 incubadora de grado durante 15 minutos, y luego se agregaron 2 ml de medio de cultivo completo libre de suero durante 24 horas.

mancha occidental

Se sembraron células MC38 y HCT-116 en placas de seis pocillos durante 6 horas y luego se trataron con CAG durante otras 24 horas. Las células se lavaron tres veces con PBS frío y se centrifugaron a 180 g durante 5 minutos a 4 grados. La proteína total se lisó con lisis WB-IP que contenía inhibidor de proteasa al 1 por ciento durante 30 minutos en hielo. La proteína total se evaluó utilizando un kit de cuantificación de proteínas BCA. Las muestras de proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS del 10 al 12 % y se transfirieron a membranas de PVDF (fluoruro de polivinilideno) a 350 mA durante 90 min. Las membranas de PVDF se bloquearon con BSA al 5 por ciento durante 1 hora, las tiras con el anticuerpo primario indicado durante la noche y el anticuerpo secundario se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, las tiras se detectaron utilizando un sistema de sustrato quimioluminiscente LumiGLO (KPL, Gaithersburg, Maryland, EE. UU.).

Citometría de flujo

Después de la digestión del tejido tumoral, se preparó la suspensión unicelular. La tinción de la superficie se realizó con anticuerpos de antígeno de superficie en el tampón FCM (citometría de flujo) (PBS que contenía FBS al 1 por ciento) y se tiñó en hielo con los anticuerpos apropiados durante 30 min. Se utilizaron colorantes reactivos (eBioscience) para eliminar las células muertas. La tinción de citoquinas intracelulares se realizó con solución fijadora de células BD/solución de membrana extracelular, y las células se fijaron y permearon, y luego se tiñeron con anticuerpos contra citoquinas en tampón Perm/Wash (BD Biosciences).

Plásmidos mutantes CTSB transfectados

Se sembraron células HCT-116 en 6-placas de pocillos durante 12 horas y luego se transfectaron con plásmidos mutantes CTSB-WT-EGFP o CTSB (Y75A, A77V y G198A) durante 36 horas.

Interferencia de transfección o plásmido de sobreexpresión de CTSB en células MC38 o células HCT-116

Se inocularon células MC38 (1×106/pocillo) en 6-placas de pocillos durante 6 horas, luego se transfectaron con ARN de interferencia CTSB (secuencia: Adelante-GGACAUAGAUCUACCUGAATT y Reversa-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) durante 48 horas, y los niveles de expresión de ARNm o proteína de Ctsb y H2-k1 fueron detectados. Se inocularon células HCT-116 (1 × 106 /pocillo) en 6-placas de pocillos durante 6 horas, luego se transfectaron con interferencia CTSB (secuencia: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) o plásmido de sobreexpresión durante 48 horas, y el ARNm o se detectaron niveles de expresión de proteína de CTSB y HLA-A.

Tecnología de acoplamiento

La estructura 3D de CTSB se descargó de Protein Database (PDB ID: 2iPP), y las estructuras de CAG se descargaron de PubChem. El proceso de acoplamiento se realizó en Autodock 2 con acoplamiento grueso usando un algoritmo de recocido simulado y un refinamiento posterior usando un algoritmo genético.

Ensayo de cambio térmico celular

Las células MC38 se sembraron en placas de 10cm durante la noche y luego se trataron con CAG o DMSO al 0,1 por ciento durante otras 2 horas. Las células se recogieron, se lavaron con PBS frío y se centrifugaron a 180 g durante 5 min. Luego, las células se dividieron uniformemente en tubos de centrifugación (70 µL cada tubo) y se calentaron durante 3 minutos a la siguiente temperatura: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 y 67 grados, las muestras se enfriaron durante 3 minutos a temperaturas y luego se mantuvo en hielo. Luego, las muestras se colocaron en un refrigerador a -80 grados durante la noche. Las muestras se descongelaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se refrigeraron a -80 grados durante 4 horas. Finalmente, las muestras se centrifugaron a 12, 000g durante 25 min, se añadió el sobrenadante al tampón de carga y se analizaron mediante transferencia Western.

Tinción inmunohistoquímica

Las secciones de tejido tumoral en parafina se sumergieron en xileno durante 20 min para desparafinar y luego en etanol al 100 %, 75 % y 50 % durante 10 min. Después de que los cortes se sometieran a reparación de antígenos con solución de reparación de antígenos de citrato de sodio, el peróxido de hidrógeno endógeno se inactivó con peróxido de hidrógeno al 3 por ciento. Después de bloquear con suero de cabra al 5 por ciento durante 1 hora, se añadió el anticuerpo anti-Ki67 (1:200) y se incubó durante la noche a 4 grados. Se añadió el polímero marcado con HRP anti-ratón/conejo (100 µl) y las muestras se incubaron a 37 grados durante 30 minutos, seguido de 100 µl de solución de trabajo DAB e incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de 1 min de tinción con hematoxilina, las muestras se lavaron en etanol al 50 %, 75 % y 100 % y xileno durante 5 min, y se usó goma neutra para sellar la película. La película se observó y fotografió bajo un microscopio.

Estadísticoanálisis

El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism (V.8.0). Todos los resultados se expresan como la media ± SEM de tres experimentos independientes. Se utilizó un análisis de varianza de una vía seguido de la prueba post hoc de Dunnett para evaluar las diferencias cuando había más de dos grupos. Se utilizó la prueba t de Student para evaluar la diferencia significativa entre los dos grupos. Se fijó una significación estadística en p<0.05.

RESULTADOS

Análisis multiómico unicelular de CAG que inhibe el crecimiento de cáncer de colon trasplantado en ratones

Para investigar si CAG tiene un efecto antitumoral, primero trasplantamos células cancerosas MC38 en ratones C57BL/6. Notamos que CAG inhibió significativamente el crecimiento de tumores (figura complementaria en línea S1A, B). Posteriormente, trasplantamos células CT26 en ratones BALB/c y descubrimos que CAG también inhibía el crecimiento de tumores (figura complementaria en línea S1C, D).

Para revelar aún más el mecanismo específico por el cual CAG inhibe el crecimiento tumoral, lo analizamos utilizando las técnicas scRNA-seq y scATAC-seq (figura 1A). Dividimos la población celular en cuatro grupos: células cancerosas, fibroblastos, células mieloides y linfocitos (figura 1B, figura complementaria en línea S2A, B). Descubrimos que las células cancerosas (52 por ciento) y los fibroblastos (41 por ciento) se infiltraron principalmente en los tejidos tumorales, mientras que las células inmunitarias representaron solo el 7 por ciento. Luego dividimos las células cancerosas en ocho subconjuntos y los fibroblastos en tres subconjuntos (figura 1C-E). Posteriormente, el análisis de enriquecimiento de genes altamente expresados ​​en cada población celular mostró que las vías moleculares del MHC-I en las células cancerosas estaban enriquecidas, al igual que las señales antitumorales de las células T y las células NK (figura complementaria en línea S2C). Luego, también se encontraron cuatro grupos de células utilizando el análisis de integración scATAC-seq y scRNA-seq (figura 2D-G). Después de la comparación, encontramos que las células cancerosas (células C01, C03), las células T CD8 más, las células Spp1 más TAM y los fibroblastos (células F01 y F02) aparecieron en la secuenciación ATAC (figura 1F, G) y, además, altamente expresados los factores de transcripción se enriquecieron en estas células (figura 1H). A través de estos análisis, especulamos que la inhibición del crecimiento tumoral por CAG está estrechamente relacionada con los cambios en estas células.

Cag promueve la presentación de antígenos de células tumorales

Para analizar el mecanismo antitumoral de CAG, primero analizamos la población de células tumorales y dividimos las células cancerosas en ocho subgrupos (figura 2A, B, figura complementaria en línea S3A). Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo PBS, las células del grupo C05 disminuyeron significativamente mientras que las células del grupo C07 aumentaron (figura 2C). Mientras tanto, para verificar la precisión de nuestro agrupamiento de células tumorales, comparamos la CNV de linfocitos y células mieloides como células de referencia. Los resultados mostraron que la CNV de las células cancerosas era significativamente mayor que la de las células inmunitarias (figura complementaria en línea S3B). Al analizar los subconjuntos de células cancerosas, encontramos que los genes de respuesta al interferón Isg15, Irf7, Ifit3 e Ifi47 estaban altamente expresados ​​en las poblaciones de células C07 y C08 del grupo CAG en comparación con el grupo PBS (figura complementaria en línea S3C). El análisis de la población de células tumorales encontró que las vías relacionadas con la presentación de antígenos estaban significativamente enriquecidas en múltiples poblaciones de células. Por lo tanto, especulamos que CAG puede promover la presentación de antígenos de las células cancerosas para desempeñar un papel antitumoral (figura 2D). Luego, seleccionamos los genes relacionados con la presentación de antígenos y descubrimos que el nivel de expresión en el grupo CAG era significativamente más alto que en el grupo PBS (figura 2E, figura complementaria en línea S3D). También encontramos que CAG promovió la presentación de antígenos en tejidos tumorales (figura 2F, G).

A continuación, utilizamos scATAC-seq para analizar las razones específicas detrás de la presentación de antígenos de células tumorales promotoras de CAG. Encontramos que la población de células tumorales expresó en gran medida los factores de transcripción Fos, Junb, Jund, Fosb y Fosl1 (figura 2H, I). Posteriormente, construimos un mapa de la interacción entre los factores de transcripción y los genes correspondientes para explicar que CAG promovió la expresión de genes relacionados con la presentación de antígenos de células tumorales (figura 2J). En los tejidos tumorales, también encontramos que los factores de transcripción Junb, Fos, Jund y Fosb se sobreexpresaron significativamente en el grupo de PBS bajo tratamiento con CAG (figura 2K-N, figura complementaria en línea S3E-I). Hasta ahora, hemos encontrado que CAG puede promover la expresión de factores de transcripción de genes relacionados con la presentación de antígenos, mejorando así la función de presentación de antígenos de las células cancerosas. Sin embargo, aún no está claro cómo responden estas células cancerosas a las respuestas de las células inmunitarias.

Para descubrir el fenómeno por el cual CAG promueve la presentación de antígenos de las células cancerosas, realizamos un análisis de trayectoria para investigar cómo las células cancerosas se alteran entre sí en respuesta a las respuestas de las células inmunitarias. Descubrimos que, con el tiempo, las células cancerosas C07 se transformaron en células C05, C06 y C08, y el enriquecimiento de genes también mostró que las células cancerosas se transformarían en presentación de antígeno (figura 3A-E).

CAG mejora la función de destrucción de las células inmunitarias

Estos resultados muestran que CAG puede presentar antígenos de células tumorales, por lo tanto, ¿la mejora de la presentación de antígenos de células tumorales conducirá a la mejora de la función de las células inmunitarias? Para resolver esto, analizamos linfocitos y células mieloides, respectivamente. Los resultados mostraron que CAG promovió la infiltración de células T CD8 plus en tejidos tumorales, y también aumentó la infiltración de células T CD8 plus y células NK, detectada por citometría de flujo (figura complementaria en línea S4A-F). También observamos que CAG mejoró la expresión de los genes Ifitm2, Cxcr6 y S100a6 en células T CD8 plus,

Genes Fcer1g, Gzmb, AW112010 y Zfp36i2 en células NK, y genes Nfkbia y Junb en células T CD4 plus (figura complementaria en línea S4G). La expresión de Ifng y Gzmb en células T CD8 plus también mejoró significativamente, según lo detectado por citometría de flujo (figura complementaria en línea S4H, I). Además, encontramos que después del tratamiento con CAG, la expresión de los receptores inhibidores Lag3, Tigit y Havcr2 en la superficie de las células T CD8 plus disminuyó, y la expresión de los genes Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5 y Pdcd1, que caracterizan la la activación de las células T CD8 plus aumentó significativamente (figura complementaria en línea S4J). Para verificar aún más que CAG mejoró la función de destrucción de las células T CD8 más al promover la presentación mejorada de antígenos tumorales, trasplantamos células CT26 en tumores trasplantados en ratones desnudos y observamos que CAG no podía inhibir de manera efectiva el crecimiento de tumores (figura complementaria en línea S4K-M ).

Después de esto, analizamos las células mieloides y encontramos que las células Spp1 más TAM aumentaron después del tratamiento con CAG, mientras que la cantidad de células C1qc más TAM disminuyó y la cantidad de Il1b más monocitos aumentó (figura complementaria en línea S5A-D). Después del tratamiento con CAG, las células Spp1 más TAM y C1qc más TAM fueron más susceptibles a la transformación proinflamatoria de TAM. El análisis de enriquecimiento encontró que se centró principalmente en Tnf-, Ifn-g y la vía de señalización de la respuesta inflamatoria (figura complementaria en línea S5E-H). Con base en los resultados mencionados anteriormente, inferimos que CAG mejora el reconocimiento y la función de destrucción de las células inmunitarias al promover la presentación de antígenos en las células cancerosas. Sin embargo, no está claro cómo se regula CAG.

Descubrimiento de la proteína diana CAG CTSB por trampa

A continuación, investigaremos la proteína diana CAG específica que desempeña un papel antitumoral. Seleccionamos las células cancerosas como objeto de investigación porque descubrimos que CAG puede mejorar la presentación de antígenos de las células cancerosas, mejorando así la función de destrucción de las células inmunitarias. Primero sintetizamos el derivado de biotina de CAG y descubrimos que solo 3-OH podía reaccionar (figura complementaria en línea S6A). Luego investigamos si CAG-biotina también promueve la expresión de genes relacionados con la presentación de antígenos en la línea celular tumoral MC38 de ratón. Los resultados muestran que la CAG-biotina no afectó la expresión de los genes H2-K1, Cd74 y Anxa1 (figura complementaria en línea S6B-D).

Por lo tanto, utilizamos el método de búsqueda de objetivos TRAP anterior en el laboratorio. 32 Tanto CAG como DMSO se incubaron con la línea celular MC38 (figura 4A). Seleccionamos la proteína con FC mayor o igual a 2 y ap menor o igual a 0.05 como la proteína diana candidata de CAG. Siguiendo el principio de que la unión de moléculas pequeñas a proteínas conducirá a una baja eficiencia de etiquetado de la lisina, seleccionamos el CTSB para el estudio (figura 4B). A continuación, utilizamos el ensayo de cambio térmico celular (figura 4C) y la termoforesis a microescala (MST) (figura 4D) para verificar la unión entre CAG y CTSB, y descubrimos que la afinidad entre CAG y CTSB era de 26,6 nM (figura 4D). Posteriormente, predijimos los sitios de unión entre CAG y CTSB de acuerdo con la estructura cristalina de proteína de CTSB en la biblioteca PDB. Descubrimos que los grupos hidroxilo en ambos extremos de CAG y los sitios ALA77 y GLY198 de CTSB estaban unidos por un enlace de hidrógeno, mientras que los sitios TYR75, PRO76 y ALA173 de CAG y CTSB estaban unidos por la fuerza de van der Waals (figura 4E) . Para verificar el sitio de unión entre CAG y CTSB, transfectamos el plásmido mutante de CTSB en células HCT-116. Los resultados muestran que la afinidad entre el plásmido mutante en A77V y G198A y CAG fue cientos de veces mayor que la del plásmido WT (figura 4F, G). En la siguiente sección, exploramos el mecanismo específico por el cual CAG juega un papel antitumoral a través de CTSB.

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