Identificación de objetivos y análisis de mecanismos para la activación de macrófagos de sacáridos de bajo peso molecular de Cistanche Deserticola basado en cromatografía de afinidad molecular

[Abstracto]Este estudio tiene como objetivo investigar los objetivos y el mecanismo involucrado en los objetivos para la activación de macrófagos de sacáridos de bajo peso molecular de Cistanche deserticola (LMSC). La actividad fagocítica y la liberación de NO de RAW264. Se detectaron 7 células y los resultados mostraron que LMSC ejerce un efecto de activación inmune al aumentar significativamente la actividad fagocítica y la liberación de NO. Se prepararon perlas de sefarosa activadas con epoxi conjugadas con LMSC como reactivo de afinidad para capturar las proteínas diana. Veinticuatro proteínas como Eef2 fueron identificadas por análisis LC-MS/MS. El análisis de enriquecimiento de la vía mostró RAW264 activado por LMSC. 7 mediante la regulación de la fagocitosis dependiente del receptor Fcgamma, la vía de señalización de TNF-alfa NF-κB, la glucólisis/gluconeogénesis y el ciclo del ácido cítrico y la vía de transporte respiratorio de electrones.

［Palabras clave］Cistanche deserticola; sacáridos de bajo peso molecular; activación de macrófagos; cromatografía de afinidad molecular; identificación de objetivos; análisis del mecanismo

ginseng del desierto

Cistanches Herba es una famosa medicina tradicional china para tonificar el riñón y el yang, beneficiar la esencia y la sangre y nutrir los intestinos y las deposiciones. Se le conoce como "ginseng del desierto". La investigación de química analítica moderna muestra que Cistanche deserticola contiene una variedad de componentes de carbohidratos, incluidos compuestos de monosacáridos que incluyen principalmente fructosa, compuestos de oligosacáridos como sacarosa y polisacáridos como ACDP-2, que son sustancias eficaces para que Cistanche deserticola desempeñe funciones en regulación inmunológica, defecación, etc. [2-5]. Los polisacáridos de Cistanche deserticola se han informado ampliamente como una clase de ingredientes activos con efectos inmunomoduladores, mientras que los azúcares de bajo peso molecular (LMSC), como los oligosacáridos y los monosacáridos, rara vez se han estudiado. Un estudio realizado por nuestro grupo de investigación sobre la activación de los macrófagos de los principales componentes activos en Cistanche deserticola encontró que el azúcar de bajo peso molecular es un tipo de componente activo con activación de macrófagos, pero su objetivo de activación inmune y el mecanismo de acción aún no están claros.

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La cromatografía de afinidad molecular es un método cromatográfico que logra la separación y purificación de moléculas objetivo uniéndolas específicamente a una fase estacionaria [6]. Este método tiene una alta afinidad y especificidad y es particularmente adecuado para sistemas orgánicos complejos con concentraciones de productos diana extremadamente bajas [7]. En los últimos años, se ha convertido gradualmente en una poderosa herramienta para identificar objetivos farmacológicos naturales. En este estudio, se utilizó tecnología de captura de proteínas diana de molécula pequeña basada en cromatografía de afinidad molecular para identificar proteínas diana de LMSC con activación de macrófagos. A través del análisis bioinformático, se obtiene la información de la ruta reguladora de la señal del grupo objetivo para explorar la actividad reguladora inmune y los mecanismos relacionados de LMSC.

1 Materia

1.1 Células

Línea de macrófagos de ratón CRUDO264 7 Adquirido en el Centro Celular de la Academia China de Ciencias Médicas.

1.2 Medicamentos y reactivos

El suero bovino fetal (FBS) se adquirió de PAN Biotech en Alemania; Antibióticos, medio DMEM con alto contenido de azúcar y 6 × El tampón de muestreo de proteínas se adquirió de Zhongke Maichen Technology Co., Ltd. El azúcar de bajo peso molecular de Cistanche deserticola fue elaborado por nuestro grupo de investigación y se determinó mediante HPLC que contenía principalmente manitol ( 16 53 por ciento), sacarosa (8 34 por ciento), fructosa (25 38 por ciento), glucosa (7 75 por ciento) y otros componentes monoméricos. Lipopolisacárido de Escherichia coli O55: B5, LPS, 3 - (4,5-dimetiltiazol-2) - 2,5-bromuro de difeniltetrazolio (MTT) y {{ Se adquirió una solución de rojo neutro al 14% por ciento de Sigma Aldrich en los Estados Unidos. El kit de reactivos de óxido nítrico (NO) se adquirió del Instituto de Investigación de Biotecnología Jiancheng de Nanjing. El gel de sefarosa activado con epoxi (6B) se adquirió de GE health care en Suecia. El kit de tinción rápida con plata se adquirió del Instituto de Investigación de Biotecnología de Biyuntian. Tanto el ácido fórmico como el acetonitrilo para espectrometría de masas se adquirieron de Thermo Fisher Scientific en los Estados Unidos. Todos los demás reactivos son domésticos analíticos puros.

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1.3 Instrumentos

incubadora de células de CO2 (SANYO, Japón); microscopio CIX100 (Olympus Corporation, Japón); centrífuga 5424R (Eppendorf, Alemania); Purificador de agua automático (Millipore, EE. UU.); Sunrise Basic ELISA (TECAN, Suiza); oscilador de temperatura constante de escritorio THZ-C (Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd.); cromatógrafos de líquidos EAS Y-nLC-II (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.); espectrometría de masas en tándem con trampa de iones LTQ-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.); Columna de cromatografía líquida capilar (Michrom Bioresources, EE. UU.).

2 métodos

2.1 Cultivo celular y administración

CRUDO264. Se cultivaron 7 células en medio DMEM alto en glucosa que contenía 10 por ciento de suero bovino fetal y 1 por ciento de anticuerpo dual, y se colocaron en una incubadora de temperatura constante de humedad saturada a 37 grados que contenía 5 por ciento de CO2. Pase una vez cada 2-3 días y realice experimentos cuando las células entren en la fase de crecimiento logarítmico. Divida las células en un grupo en blanco, un grupo de lipopolisacáridos o un grupo de azúcar de bajo peso molecular de Cistanche deserticola. Las células del grupo LPS se trataron con 1 mg de solución de L-1 LPS como control positivo; Se añadieron células del grupo LMSC con soluciones de LMSC de diferentes concentraciones de masa (0 25, 0, 5, 1, 2 g·L － 1; filtrar con una membrana de filtro antes de la administración); Agregue un volumen igual de medio de cultivo sin suero a las células del grupo en blanco.

2.2 Determinación de la actividad fagocítica de los macrófagos mediante el método del rojo neutro

CRUDO264. Se sembraron 7 células en una placa de 96-pocillos y se cultivaron durante la noche antes de reemplazarlas con medio sin suero o medio sin suero que contenía LPS o diferentes concentraciones de LMSC. Después de 48 horas de cultivo, las células se reemplazaron con 0 075 por ciento de solución de rojo neutro y se continuaron incubando a 37 grados durante 4 horas. Absorba y deseche el sobrenadante, lave dos veces con PBS y use solución de lisis celular (etanol de ácido acético glacial 1:1) para lisar las células a 4 grados. Después de la lisis completa, mida la absorbancia de cada pocillo (A540 nm).

2.3 Detección de liberación de NO en sobrenadante celular

CRUDO264. Se sembraron 7 células en una placa de 48-pocillos y se cultivaron durante la noche antes de reemplazarlas con medio sin suero o medio sin suero que contenía LPS o diferentes concentraciones de LMSC. Después de 24 horas de cultivo de inducción, recoja el sobrenadante y mida el contenido de NO en el sobrenadante de cada célula buena de acuerdo con las instrucciones del kit de reactivos.

2.4 Ensayo MTT para viabilidad de macrófagos

CRUDO264. Se inocularon 7 células en una placa de pocillos 96- y, después del cultivo durante la noche, se reemplazaron con medio sin suero o medio sin suero que contenía LPS o diferentes concentraciones de LMSC y se continuaron cultivando durante 24 horas. Reemplace cada celda en buen estado con 0 Incube 5 g · L-1 de solución de MTT a 37 grados C durante 4 horas, luego disuelva el producto de reacción de MTT con dimetilsulfóxido y mida la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 570 nm utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.

Preparación de 2.5 Cistanche deserticola medio de afinidad de azúcar de bajo peso molecular

Método de referencia [8], pese la resina de agarosa activada con epoxi 0 5 g, disuélvala en agua desionizada durante 40 min, centrifugue y deseche el sobrenadante, y repita el proceso tres veces para completar el gel. hinchado (su volumen es de aproximadamente 1 mL), para standby. Tome 0 Mezcle 5 mL de gel de agarosa activado con epoxi hinchado con 1 mL de solución de LMSC (1 g · mL - 1) o un volumen equivalente de solvente e incube en un agitador de temperatura constante a 37 grados durante la noche. Lave el blanco o el medio de agarosa acoplado de LMSC varias veces con agua desionizada hasta que el sobrenadante sea incoloro, luego agregue 1 ml de solución de etanolamina (1 mol · L-1) y séllelo en una mesa de agitación a temperatura constante a 37 grados durante 2 días. Una vez completada la reacción, limpie 5 veces cada uno con agua bidestilada, tampón NaCl Hac y tampón NaCl Tris HCl y, finalmente, use 0 Wash dos veces con 01 por ciento de eluyente NP40 como respaldo.

2.6 Enriquecimiento e Identificación de grupos objetivo

A RAW264 Extracto de proteína total de 7 células (0 Agregue 50 a 5 g · L-1 respectivamente μ L de medio en blanco o medio de afinidad de LMSC, como grupo de control en blanco y grupo de unión de LMSC ; Configure un grupo competitivo que agregue simultáneamente solución de LMSC y medio de afinidad de LMSC. Después de mezclar cada grupo, incube a 4 grados durante la noche para unir completamente LMSC a la proteína objetivo. Después de la reacción, use 0 Lave el medio de afinidad 6 veces con un 01 por ciento de eluyente NP40 para eliminar las proteínas libres residuales del medio de afinidad. Agregue el medio de afinidad lavado a un volumen igual de 2 × tampón de carga de muestras, desnaturalizado a 98 grados durante 8 minutos para disociar la proteína de unión. Aspire el sobrenadante, realice gel SDS-PAGE electroforesis y luego realice un análisis de tinción con plata de acuerdo con las instrucciones del kit.

2.7 Método LC-MS/MS para identificar grupos de proteínas diana

El método de referencia [8] se utilizó para identificar proteínas de unión específicas utilizando una espectrometría de masas con trampa de iones lineal en tándem nano HPLC-LTQ-Orbitrap/MS bidimensional (nano HPLC-LTQ-Orbitrap/MS). El método específico es el siguiente: en primer lugar, se usa tripsina para hidrolizar las bandas de proteínas expresadas diferencialmente dentro del gel para obtener una mezcla de segmentos de péptidos diana. La mezcla de péptidos se sometió a 0 veintidós μ Después de la filtración con una membrana microporosa, extraiga el 10 por ciento μ Agregue la solución de muestra L a la columna de cromatografía líquida capilar. Condiciones cromatográficas: fase móvil 0 1 porcentaje de solución acuosa de ácido fórmico (A) - acetonitrilo (B), las condiciones de elución en gradiente se muestran en la Tabla 1. Condición de espectro de masas: el voltaje de pulverización eléctrica es 1 8 kV, ion positivo recopilación de datos de modo, rango de escaneo completo establecido en m/z 350-2 000; Realice un escaneo MS/MS en los 15 picos más fuertes, con una energía de colisión secundaria establecida en 35 V. Finalmente, use el software de búsqueda SEQUEST para buscar y hacer coincidir los datos del segmento peptídico obtenido.

Tabla 1 Perfil de gradiente del análisis de nano-HPLC

Nota: Los caudales son todos de 300 nL · min-1.

2.8 Vía del grupo destinatario de la acción y análisis funcional

Importe la proteína objetivo identificada en Cytoscape 3 En el software 5.1, se usó el complemento ClueGO para el análisis de KEGG, REACTOME Pathways y Wiki Pathways, y la especie se estableció como ratones con P<0 05 as the significance threshold, and the rest use default parameters.

2.9 Análisis estadístico

Todos los datos experimentales se expresan en x campo ± s. Se utilizó el software estadístico GraphPad Prism-6 02 para el análisis de varianza unidireccional (ANOVA), con P<0 01 having a very significant difference.

3. Resultados y discusión

3.1 El azúcar de bajo peso molecular de Cistanche deserticola afecta a RAW264 El efecto de la 7-actividad fagocítica celular

En otro estudio de nuestro grupo de investigación sobre los componentes activos de la activación de macrófagos en Cistanche deserticola, LMSC puede ser un tipo de componente con activación de macrófagos.

Estudio Experimental sobre Cistanche deserticola

Este experimento utilizó por primera vez el método de rojo neutro para determinar RAW264. El sistema de cultivo in vitro de 7 macrófagos peritoneales de ratón se estimuló con diferentes concentraciones de LMSC para investigar el efecto de LMSC en RAW264. El efecto de la actividad fagocítica de 7 células. En comparación con el grupo de control en blanco, el fármaco de control positivo LPS estimuló las células durante 48 horas y mejoró significativamente la actividad fagocítica celular (P<0 01); LMSC at 0 Each administration group of 25-2 g · L-1 significantly increased RAW264 The phagocytic activity of 7 cells (P<0 01), and exhibit dose-dependent characteristics. The above results suggest that LMSC may have activated RAW264 The role of 7 cells is shown in Figure 1.

En comparación con el grupo de control en blanco, 1) P<0 01 (same as Figure 2).

Fig. 1 Efectos de los sacáridos de bajo peso molecular de Cistanche deserticola sobre la actividad fagocítica de RAW264. 7 celdas

3.2 El azúcar de bajo peso molecular de Cistanche deserticola afecta a RAW264 El efecto de la liberación de NO en 7 células

El NO es una citocina importante con efectos reguladores inmunitarios en el cuerpo [9], y se ha informado ampliamente que participa en la regulación de la respuesta de activación de células RAW264 7-. Para investigar más a fondo el impacto de LMSC en RAW264, se determinó el efecto de activación de 7 células y se midió el contenido de NO en el sobrenadante celular después de la estimulación con LMSC. La liberación de NO en el grupo de LPS con fármaco positivo para la activación de macrófagos fue significativamente mayor que en el grupo de control en blanco (P<0. 05) 01), similar to it, 0 RAW264 in the LMSC administration group with 3 doses of 5, 1, 2 g · L-1 The NO release of 7 cells was significantly higher than that of the blank control group (P<0. 05) 01), and it is dose-dependent, as shown in Figure 2. The above results indicate that LMSC can promote RAW264 The effect of 7 cells releasing NO confirms its macrophage activation effect.

Fig. 2 Efectos de los sacáridos de bajo peso molecular de Cistanche deserticola sobre la liberación de NO de RAW264. 7 celdas

3.3 El azúcar de bajo peso molecular de Cistanche deserticola afecta a RAW264 El impacto de 7-la viabilidad celular

La citotoxicidad es un factor importante que restringe el desarrollo de nuevos fármacos y afecta su eficacia. Para investigar si la dosis de LMSC usada en este experimento tiene citotoxicidad potencial, se usó el método MTT para detectar RAW264 después de la administración de LMSC. 7 Viabilidad celular. LMSC a 0 25-2 g · L{3}} intervención RAW264 Después de 24 horas de 7 células, no hubo un efecto significativo sobre la viabilidad celular, y los resultados anteriores sugieren que 0 25-2 g · L{{8 }} LMSC vs. RAW264 7 no tiene citotoxicidad, como se muestra en la Figura 3.

Fig. 3 Efectos de los sacáridos de bajo peso molecular de Cistanche deserticola en RAW264. viabilidad de 7 células

3.4 Enriquecimiento e Identificación de Grupos Objetivo para la Activación de Macrófagos de Azúcar de Bajo Peso Molecular en Cistanche deserticola

El gel de agarosa activado con epóxido es un vehículo de fase sólida ampliamente utilizado para acoplar sacáridos, proteínas y otras moléculas que contienen grupos hidroxilo o amino. LMSC se compone principalmente de fructosa rica en hidroxilo, manitol y otros componentes. En este estudio, el hidroxilo contenido puede reaccionar con los grupos activos epoxi para unir el azúcar de bajo peso molecular de Cistanche deserticola a la superficie de las microesferas de gel de agarosa activadas con epoxi para construir un medio de afinidad LMSC, como se muestra en la Figura 4A. Utilizando la tecnología de cromatografía de afinidad molecular, el medio de afinidad de LMSC se mezcló con RAW264 Incube el extracto de proteína total de 7 células para capturar el grupo de proteína objetivo directamente. La tinción con plata se realizó en el grupo objetivo, como se muestra en la Figura 4B. Las bandas de proteína del grupo de unión al medio de afinidad de LMSC fueron significativamente más altas que las del grupo de medio blanco de LMSC desacoplado, mientras que el grupo competitivo de LMSC redujo significativamente el número de objetivos capturados en el medio de afinidad debido a la excesiva unión competitiva libre de LMSC con la proteína diana. Posteriormente, se utilizó el método HPLC MS/MS para identificar cada banda de proteína y se obtuvo un total de 24 proteínas diana como Eef2, lo que indica que el azúcar de bajo peso molecular de Cistanche deserticola puede provocar la activación de macrófagos a través de la acción combinada de estas proteínas diana.

3. 5 Análisis del mecanismo de acción relacionado con el grupo objetivo de activación de macrófagos de azúcar de bajo peso molecular en Cistanche deserticola

Para investigar la proteína objetivo de azúcar de bajo peso molecular de Cistanche deserticola que causa RAW264, el mecanismo de activación de los macrófagos se analiza en este estudio utilizando las bases de datos de vías de señalización KEGG, REACTOME y Wiki para investigar las vías biológicas involucradas en el grupo de proteínas objetivo de LMSC. Los resultados del análisis del enriquecimiento de la vía de señal se muestran en la Figura 5 y la Tabla 2. Las proteínas diana de activación de macrófagos de LMSC participan principalmente en 10 vías de señal relacionadas con la activación de macrófagos, que se pueden resumir en las siguientes 4 categorías: Fc Fagocitosis dependiente del receptor, TNF-NF - Vía de señalización de κ B, glucólisis/gluconeogénesis, ciclo del ácido cítrico (TCA) y transporte respiratorio de electrones.

4. Discusión

Las investigaciones modernas informan que la medicina tradicional china y los medicamentos naturales tienen una amplia gama de actividades biológicas, pero debido a su compleja composición química, aún existen desafíos para dilucidar el mecanismo de acción de los complejos sistemas de componentes de la medicina tradicional china y los medicamentos naturales. Basado en la tecnología de captura de proteína diana de molécula pequeña de cromatografía de afinidad molecular, este estudio combinó con la composición química común de que todos los componentes principales del azúcar molecular de Cistanche deserticola (LMSC) tienen grupos hidroxilo, y construyó microesferas de gel de agarosa activadas con epoxi unidas por LMSC como medio de afinidad, para identificar grupos de proteínas objetivo de LMSC con activación de macrófagos y analizar las vías de transducción de señales relacionadas con el grupo objetivo. Además, se reveló el mecanismo de activación de macrófagos de LMSC.

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Los macrófagos son un tipo de células de respuesta inmune importantes en el cuerpo que pueden fagocitar antígenos granulares. La activación de macrófagos provocada por estímulos exógenos se manifiesta principalmente por la potenciación de la función fagocítica y la liberación de NO y otros factores provocados por una serie de vías de señalización. Mejora dependiente de la dosis de LMSC RAW264 La actividad fagocítica de 7 células y un aumento significativo en la liberación de NO indican que LMSC tiene un efecto de activación de macrófagos. El análisis de enriquecimiento de las vías de señal de los objetivos de activación de macrófagos de LMSC capturados por cromatografía de afinidad molecular utilizando medios bioinformáticos sugiere que LMSC regula Fc por fagocitosis dependiente del receptor, TNF- NF- κ La vía de señalización B, glucólisis/gluconeogénesis, ciclo del ácido cítrico (TCA) y El transporte respiratorio de electrones desempeña funciones de activación de macrófagos.

A. Caracterización microscópica del medio de afinidad (bar=25 μ m); B. Electroforesis en gel teñido con plata de objetivos enriquecidos.

Fig. 4 La identificación de dianas para los sacáridos de bajo peso molecular de Cistanche deserticola

Fig. 5 Análisis de ruta de enriquecimiento para los objetivos de sacáridos de bajo peso molecular de Cistanche deserticola

Los receptores Fc son receptores de superficie celular y uno de los receptores de reconocimiento de patrones de macrófagos [11]. Están ubicados en la superficie celular y pueden reconocer específicamente partículas exógenas, haciendo que se unan a la superficie celular. La transducción de señales de fagocitosis mediada por el receptor Fc puede causar la polimerización de actina aguas abajo y la formación de fagocitos [11]. LMSC mejora significativamente la actividad fagocítica de las células RAW264 7, que puede estar relacionada con la unión de varios Fc, como las proteínas relacionadas con la señalización del receptor Hsp90 que regulan la fagocitosis dependiente del receptor Fc. NF-κ La vía de señalización B se considera una vía de señalización clave para la activación de los macrófagos [12]. NF- κ B es un importante factor regulador de la transcripción en el núcleo, NF- κ La activación de la vía de señalización B puede causar NF en el citoplasma. mediadores La estimulación de LMSC puede hacer que las células RAW264 7 liberen una gran cantidad de NO, que puede estar relacionado con el TNF al unirse a varios factores, como la vía de señalización Eef2- NF-κ B y otras proteínas relacionadas que activan el NF - κ Se implementa la vía de señalización B y sus procesos asociados de iniciación y extensión de la traducción eucariótica. Además, los objetivos relacionados con LMSC también involucran dos vías de metabolismo de carbohidratos: glucólisis/gluconeogénesis, ciclo del ácido cítrico (TCA) y transporte respiratorio de electrones. Se especula que LMSC contiene varios azúcares de bajo peso molecular, como fructosa y manitol, que pueden afectar a las células RAW264 7, proporcionar energía y unirse a proteínas como Aldoa relacionadas con el metabolismo de la glucosa, regulando así las vías relacionadas con el metabolismo de la glucosa.

En resumen, este estudio identificó 24 proteínas diana funcionales diferentes para la activación de macrófagos de LMSC utilizando tecnología de reconocimiento de proteínas diana relacionadas con la cromatografía de afinidad molecular; El análisis de enriquecimiento de las vías de señalización relacionadas con la proteína diana sugiere que LMSC actúa sobre la fagocitosis dependiente del receptor Fc, TNF- NF- κ La vía de señalización B y el proceso de metabolismo de la glucosa finalmente ejercen RAW264 7. Activación de macrófagos. Este estudio proporciona apoyo teórico para revelar los componentes activos y los mecanismos relacionados de regulación inmunitaria en Cistanche deserticola y también proporciona ideas para el reconocimiento de objetivos y la investigación de mecanismos de componentes activos complejos en fármacos naturales.

Tabla 2 Análisis de enriquecimiento de rutas para los objetivos de LMSC

[Referencia]

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