El papel central del factor de crecimiento transformante (TGF-) en el desarrollo de la fibrosis renal
Mar 26, 2022
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PARTE Ⅰ: Papel del fibroblasto renal primario humano en dispositivos que imitan la fibrosis mediados por TGF- 1-
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee y otros.
1. Introducción
fibrosis renal, la vía común final de innumerables enfermedades renales progresivas, se caracteriza por un aumento en la producción de proteínas de la matriz extracelular (MEC), una disminución en la degradación de la matriz, disfunción de la interacción célula-matriz, la transformación de las células residentes y la infiltración de células inflamatorias.factor de crecimiento transformante-(TGF-) es un péptido dimérico multifuncional que regula procesos biológicos como la proliferación celular, la diferenciación y las respuestas inmunológicas [1]. Entre los numerosos factores fibrogénicos, TGF- (factor de crecimiento transformante-) juega un papel central y tiene un efecto antiinflamatorio. TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)-los ratones deficientes mueren de una inflamación masiva. Ratones transgénicos que sobreexpresan TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)están virtualmente protegidos de desarrollar patología fibrótica renal, principalmente a través de su actividad antiinflamatoria [2]. Las propiedades profibróticas y antiinflamatorias del TGF-(factor de crecimiento transformante-)son espadas de doble filo en cuanto a la aplicación terapéutica de TGF-(factor de crecimiento transformante-)inhibición. Se han hecho esfuerzos notables para obstruir TGF-(factor de crecimiento transformante-)acción para impedir la progresión derenalfibrosis[3]. Aunque se han utilizado muchos enfoques para combatirrenalfibrosis, un modelo experimental para evaluar los fármacos actualmente disponibles no es ideal.
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En general, los estudios en animales juegan un papel fundamental en las pruebas preclínicas para predecir la farmacocinética y la eficacia de los medicamentos. Sin embargo, existen varias diferencias entre los animales y los humanos, lo que nos lleva a cuestionar la precisión de las pruebas de seguridad y eficacia de los medicamentos en animales 4. Informes anteriores dependían de estudios preclínicos en animales durante el desarrollo de medicamentos para evaluar la nefrotoxicidad y la seguridad de los medicamentos. El funcionamiento renal de los animales es más del doble que el de los riñones humanos. Por lo tanto, las drogas se metabolizan más rápidamente en animales que en humanos, lo que dificulta dilucidar los resultados de las pruebas de toxicidad de drogas utilizando estudios en animales. Además, los resultados de los experimentos con animales no se pueden usar para predecir las respuestas a los medicamentos en humanos, ya que los animales tienen diferentes funciones fisiológicas. basado en animalesfibrosis renallos modelos tienen dificultades para reproducir humanosfibrosis renal; por lo tanto, se están realizando investigaciones para superar los obstáculos actuales y optimizar las plataformas de descubrimiento de fármacos [5].
La tecnología Organ-on-a-chip (OoC) ha surgido como un concepto novedoso para resolver estos problemas. Esta plataforma se diseñó teniendo en cuenta las deficiencias actuales y se ha mostrado muy prometedora en el campo de la nefrología [6]. Además, los modelos OoC tienen un gran potencial como reemplazo de los modelos animales experimentales, brindan una solución para las diferencias entre especies y pueden ayudar a terminar con la crueldad animal y los debates éticos [7]. Existen pocos modelos in vitro que utilicen simultáneamente fibroblastos renales primarios con células endoteliales y epiteliales, que son células importantes enriñónfibrosis. El papel de cada célula enfibrosisse está estudiando por separado; sin embargo, existe un conocimiento limitado sobre la interacción de las células.
En el presente estudio, desarrollamosfibrosis-dispositivos que imitan el uso de fibroblastos primarios humanos. Confirmamos que TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)El tratamiento tiene varios efectos sobre elfibrosis renalmodelo. En particular, los fibroblastos desempeñan un papel fundamental como células efectoras, promueven la formación de un microambiente profibrótico y secretan factores de crecimiento y citoquinas. Por lo tanto, en base a este nuevo método, los fibroblastos pueden proporcionar un sistema de modelo celular ideal para estudiar la enfermedad renal. Evaluamos si los fibroblastos derivados de la enfermedad renal fibrótica afectan la integridad de las células cultivadas en tres dimensiones (3D). Finalmente, presentamos un estudio de prueba de principio que demuestra el potencial de los humanosfibrosis renaldispositivos de imitación como modelo para predecir la respuesta a humanosfibrosis renal.
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2. Resultados
2.1.Identificación de actina de músculo liso alfa (a-SMA) y queratina-8(KRT-8) por TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)en celdas HK-2
En la fase inicial, examinamos marcadores conocidos defibrosisy el citoesqueleto en cultivos bidimensionales (2D). Se realizaron ensayos de tinción inmunofluorescente para estimar la expresión de -SMA de fibrosis y el marcador de transición epitelial a mesenquimatosa (EMT) tubular y los niveles de KRT8 como marcador de citoesqueleto. La tinción de inmunofluorescencia mostró que la expresión de -SMA era originalmente débil y que los niveles de KRT8 eran altos en las células epiteliales de monocapa HK-2. No hubo alteración significativa en la intensidad de la fluorescencia por TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)(5 ng/mL) o el tratamiento con inhibidor específico de células epiteliales HK-2 durante 24 h (Figura 1).
Figura 1. La inmunofluorescencia muestra que la expresión de alfa-SMA y queratina-8(KRT8) se mantuvo con el tratamiento de TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)o el inhibidor en las células HK-2.(A) La expresión de alfa-SMA y (B) CCK-8 no tuvo efecto en las células HK-2por TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)(5 ng/mL) o el inhibidor. Las células se colocaron originalmente en placas a una densidad de 1 × 10 grados por pocillo (ac) control sin tratar y (df) se estimularon con 5 ng/ml de TGF- 1(factor de crecimiento transformante-) o (gi) inhibidor 10 μM (SB431542) durante 24 h y fijado con paraformaldehído al 4 por ciento. A continuación, las células se tiñeron con anti- -SMA y anticitoqueratina-8 durante 20 min. Se realizó una tinción conjunta con colorante Hoechst H33342 para identificar los núcleos celulares. Las barras de escala en las micrografías indican 200 um.
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2.2. Expresión KRT8 disminuida por TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)en un chip
A continuación, evaluamos los niveles de expresión de -SMA y KRT8 en HK cultivada en 3D-2 y la longitud total de células endoteliales de vena umbilical humana GFP (HUVEC) tratadas con TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)y un inhibidor específico. Para lograr esto, primero establecimos un patrón de chip de tejido que comprende dos tipos de células, células epiteliales HK-2 y GFP-HUVEC. Tras la confirmación de la construcción, expusimos el chip de tejido con TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)(5 ng/mL) o un inhibidor específico (10 um SB431542) durante 24 h.
Como se muestra en la Figura 2A-C, la expresión de -SMA no fue modificada específicamente por TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)o el tratamiento con inhibidores específicos. Sin embargo, la expresión de KRT8 se redujo en el chip cocultivado de tipo de dos células. Además, la adición de un inhibidor de TGF-ß1 aumentó la expresión de KRT8.
Examinamos la formación de una red similar a un capilar tubular 3D por TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)tratamiento en HUVEC, ya que las células endoteliales pueden formar espontáneamente una red similar a un capilar tubular 3D. De acuerdo con nuestras condiciones culturales, la formación de líneas gruesas se redujo significativamente. Sin embargo, las líneas delgadas similares a capilares aumentaron en el TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)GFP-HUVEC tratadas. En el caso del TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)tratamiento con inhibidor en el chip cultivado en 3D, la longitud total de las líneas gruesas y gruesas mostró una tendencia inversa a TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)tratamiento. Se observó un aumento en la longitud de la línea gruesa en comparación con el grupo de control no tratado. Se observó un patrón similar en el diámetro de la línea gruesa en GFP-HUVEC después de TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)tratamiento y tratamiento con inhibidores. El diámetro de la GFP-HUVEC fue suprimido por el TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)tratamiento pero aumentó independientemente del grosor de la línea por el inhibidor en comparación con los controles y TGF- 1(factor de crecimiento transformante-). La longitud total y el diámetro de la línea gruesa aumentaron drásticamente con el tratamiento con inhibidor de TGF- 1 en comparación con el control sin tratar y el tratamiento con TGF- 1. En particular, los resultados obtenidos indicaron una mayor densidad de pequeños vasos en el TGF-(factor de crecimiento transformante-)-grupo tratado en comparación con sus contrapartes no tratadas. Por el contrario, la densidad de vasos gruesos en el TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)grupo de tratamiento fue menor que en el grupo de control no tratado (Figura 2D, E).
Figura 2. Expresión de KRT8 en HK-2 y longitud y diámetro total de las HUVEC.(A) La inmunofluorescencia muestra que la expresión de -SMA se mantuvo y la expresión de KRT8 disminuyó drásticamente con el tratamiento de TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)en Hong Kong-2. Las células se sembraron en placas y se estimularon con 5 ng/mL de TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)o inhibidor de 10 μm (SB 431542) durante 24 h y fijado con paraformaldehído al 4 por ciento. Las células se tiñeron con anti- -SMA y anticitoqueratina-8 durante 20 min. Se realizó una tinción conjunta con colorante Hoechst H33342 para identificar los núcleos celulares. La expresión de -SMA(ac) no tuvo alteración, pero la expresión de KRT8(df) en células HK-2 y GFP en HUVEC (gi) cambió significativamente por TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)(5 ng/mL) y el inhibidor (B, C). En la longitud total de las HUVEC, el vaso delgado aumentó pero el vaso grueso disminuyó por TGF- 1(factor de crecimiento transformante-). El diámetro se incrementó tanto en los vasos delgados como en los gruesos. Estos resultados fueron revertidos por el inhibidor SB431542 (D, E). Las barras de escala en las micrografías indican 100 μm.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
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2.3. TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)Afecta a tres tipos de celdas del chip con estructura multicompartimental
Para estudiar el TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)respuestas del chip 3D propuesto, realizamos inmunotinción en cada compartimento por separado (Figura 3). En este análisis se utilizaron fibroblastos renales humanos primarios. Las muestras se analizaron usando FACS y se confirmó que eran positivas para el anticuerpo marcador de fibroblastos. Después de la incubación de los tres tipos de células con TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)durante 24 h se realizó inmunotinción para evaluar la expresión de -SMA y KRT8. La expresión de a-SMA aumentó con el tratamiento con TGF-1 y se observaron resultados opuestos con TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)tratamiento con inhibidores. Por el contrario, la expresión de KRT8 fue regulada a la baja por TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)y mostró una respuesta opuesta al TGF-(factor de crecimiento transformante-)inhibidor (Figura 4A-C).
Figura 3. Imagen de muestra con demostración esquemática del dispositivo de la fabricación y programa experimental.(A) Las dos imágenes superiores muestran el diseño. La imagen de la izquierda muestra una foto general de arriba hacia abajo del dispositivo. Las imágenes inferiores muestran la sección transversal. Vista esquemática detallando las dimensiones de las guías de líquido. (B) Esta figura describe los programas experimentales parafibrosis-Dispositivos de imitación. El proceso de carga de cuatro pasos para cada pocillo. Ubicación de cada área de patrón de hidrogel, así como la colocación de los medios en sección transversal isométrica y de arriba hacia abajo. (1) Un total de 1,5 uL de hidrogel 1 se guía espontáneamente hacia el canal central. (2) El canal central se llena con 5 uL de hidrogel. (3) Un total de 10 ul de hidrogel 3 están modelados en el suelo del depósito. (4) Se dispensa un total de 200 μL de medios. Barra de escala roja=9 mm.
Como se muestra en la Figura 4D-G, la longitud de la línea delgada similar a un capilar aumentó significativamente con TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)tratamiento en los GFP-HUVEC. Sin embargo, el grosor de la línea gruesa se redujo en el TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)HUVEC tratadas. El diámetro se redujo en promedio para los vasos delgados y gruesos en los HUVEC. En el caso del TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)tratamiento con inhibidor en el chip cultivado en 3D, la longitud total de las líneas gruesas y gruesas mostró una tendencia opuesta al tratamiento con TGF- 1. Además, la longitud de la línea gruesa aumentó en comparación con el grupo de control no tratado.
Figura 4. Alteración de HK-2 cultivadas en 3D y HUVEC con fibroblastos renales primarios.Las células totales se colocaron en placas a una densidad de 5 × 10 grados por chip 3D y se estimularon con 5 ng/ml de TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)o inhibidor de 10 μm (SB 431542) durante 24 h y fijado con paraformaldehído al 4 por ciento. (A) Las células del chip 3D se tiñeron con anti-o-SMA y anti-citoqueratina-8. La expresión de -SMA (ac) aumentó y la expresión de KRT8(df) disminuyó significativamente por TGF- 1(5 ng/mL). La longitud total de los HUVEC; los vasos delgados aumentaron dramáticamente y los vasos gruesos disminuyeron por TGF-ß1(factor de crecimiento transformante-)(D, E). El diámetro se redujo para vasos delgados y gruesos (F, G). Estos resultados fueron revertidos por el inhibidor SB431542. Las barras de escala en las micrografías indican 100 μm.*p<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 modula mediadores inflamatorios y factores de crecimiento
A continuación, investigamos las citoquinas inflamatorias y los factores de crecimiento en el sobrenadante; IL-1 , FGF-2, TGF- 2(factor de crecimiento transformante-)y TGF- 3(factor de crecimiento transformante-)la secreción de proteína fue dramáticamente mayor en los chips cultivados en 3D que en los fibroblastos 2D bien cultivados, a pesar de que tenían el mismo recuento total de células. Sin embargo, TGF- 1(factor de crecimiento transformante-) los niveles fueron similares, ya que los modelos cultivados en 2D o 3D se trataron con concentraciones similares de TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)(Figura 5A-E). En particular, la liberación de FGF-2 de fibroblastos renales primarios humanos fue de 20,9 ± 0,4 pg/día/5 × 10 células de grado del cultivo monocapa 2D y 3094,8± 0,2 pg/día/5 células de 10 grados, incluidas las HUVEC y HK-2 del chip cultivado en 3D en el control no tratado. La secreción de FGF-2 por TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)la estimulación fue de 31.0±0.2pg/día/5×10 grados de células para el cultivo 2D y 3683.9± 0.8 pg/día/5×10 grados de células para el cultivo 3D -chip cultivado. Este aumento en la producción de proteína FGF-2 en el cultivo de monocapa 2D fue paralelo a un aumento en el modelo de chip cultivado en 3D por TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)tratamiento (Figura 5B).
Figura 5. Comparación de modelos cultivados en 2D y 3D como plataformas que imitan la fibrosis renal.Las células se colocaron en placas a una densidad de 5 × 10 grados por pozo 2D o chip 3D y se estimularon con 5 ng/ml de TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)o inhibidor 10 um (SB 431542) durante 24 h. Se usaron fibroblastos renales humanos primarios en el modelo cultivado en 2D y en el cultivado en 3D. Los fibroblastos se utilizaron a una densidad de 8 × 10* cultivados con HUVEC y HK-2. La proporción primaria de fibroblastos renales humanos a HUVEC, o proporción F:H, fue de 1:5 para evaluarfibrosisSe utilizaron células .HK-2 a una densidad de 2x104. La detección de (A)IL-1, (B)factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF-2) y (CE)TGF-beta 1, 2 y 3 en el sobrenadante se realizó mediante análisis multiplex de citocinas e inmunoensayo de microesferas multiplex. Cada barra representa la media± SE.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(factor de crecimiento transformante-).
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Además, estimamos la expresión de ARNm de citocinas proinflamatorias como IL-1, IL-6, IL-8 y TNF-. Los resultados fueron significativamente regulados a la baja por el TGF humano recombinante- 1(factor de crecimiento transformante-)tratamiento en el chip cultivado en 3D como una propiedad antiinflamatoria de TGF-(factor de crecimiento transformante-). Descubrimos que la expresión de ARNm estaba regulada positivamente por el TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)inhibidor (SB431542). Además, la expresión mediada por inhibidores de IL-6, IL-8 y TNF- se reguló específicamente a la baja en comparación con el control no tratado (Figura 6A-D). El nivel de ARNm de VEGF, un factor fibrótico, aumentó significativamente con TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)tratamiento. El inhibidor de TGF- 1 disminuyó el nivel de ARNm de VEGF (Figura 6E), mientras que la expresión de ARNm de IL-10 con efecto antifibrótico disminuyó en condiciones fibróticas inducidas por TGF- 1 . Por el contrario, la expresión de ARNm de I-10aumentó con el tratamiento con inhibidor de TGF- 1(Figura 6F).
Figura 6. La PCR en tiempo real muestra la expresión general de ARNm del chip 3D.Las células se colocaron en placas a una densidad de 5 × 10 grados por chip 3D y se estimularon con 5 ng/ml de TGF- 1(factor de crecimiento transformante-)o inhibidor de 10 um (SB431542) durante 24 h. ARN total extraído del chip cultivado en 3D. La expresión de ARNm de (A)IL-1 ,(B)TNF- ,(C)IL-6 y (D)IL-8 representa el efecto antiinflamatorio del TGF{ {10}}(factor de crecimiento transformante-)tratamiento. Se incrementó la expresión de (E)VEGF como factor angiogénico. La expresión de (F)IL-10 como factor antifibrótico se redujo significativamente por TGF- 1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(factor de crecimiento transformante-).
