Los exosomas urinarios identifican vías inflamatorias en la lesión renal aguda asociada a vancomicina

Contacto:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Linda Awdishu 1*, Amy Le 1, Jordan Amato 1, Vidhyut Jani 1, Soma Bal 2, Robert H. Mills 1, Marvic Carrillo-Terrazas 1, David J. Gonzalez 1, Ashita Tolwani 3, Anjali Acharya 4, Jorge Cerda 5, Melanie S. Joy 6,7, Paola Nicoletti 8, Etienne Macedo 2, Sucheta Vaingankar 2, Ravindra Mehta 2, Satish P. Ramachandra Rao 9 y en representación de los Investigadores Directos †

1 Facultad de Farmacia y Ciencias Farmacéuticas Skaggs, Universidad de California, San Diego, CA 92093, EE. UU.;a6le@ucsd.edu (AL); jegilmor@ucsd.edu (JA); vgjani@ucsd.edu (VJ); rhmills@health.ucsd.edu (RHM);mac215@health.ucsd.edu (MC-T.); djgonzalez@ucsd.edu (DJG)

2 Facultad de Medicina, Universidad de California, San Diego, CA 92093, EE. UU.; sobal@ucsd.edu (SB);emacedo@ucsd.edu (EM); svaingankar@health.ucsd.edu (SV); rmehta@ucsd.edu (RM)

3 School of Medicine, University of Alabama, Birmingham, AL 35233, USA; atolwani@uab.edu

4 Albert Einstein College of Medicine, The Bronx, NY 10461, USA; anjali2526@gmail.com

5 Facultad de Medicina de Albany, Albany, NY 12208, EE. UU.; jorge.cerda82@gmail.com

6 División de Enfermedades Renales e Hipertensión, Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical, Aurora, CO 80045, EE. UU.; MELANIE.JOY@cuanschutz.edu

7 Facultad de Medicina, Universidad de Colorado, Aurora, CO 80045, EE. UU.

8 Escuela de Medicina Mount Sinai, Nueva York, NY 10029, EE. UU.; paola.nicoletti@mssm.edu

9 Departamento de Medicina Celular y Molecular, Sistema Médico de la Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI 48109, EE. UU.; satishpr@med.umich.edu

* Correspondencia: lawdishu@ucsd.edu; Tel.: más 858-534-3919

† La membresía de los Investigadores directos se proporciona en los Agradecimientos.

Resumen:

Fondo:La vancomicina se usa comúnmente como terapia de primera línea para organismos grampositivos como el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina. aguda inducida por vancomicinariñónlesión(LRA-V) se ha informado en hasta el 43 por ciento de los pacientes, especialmente en aquellos con concentraciones mínimas específicas más altas. El mecanismo preciso de la lesión en humanos sigue siendo difícil de determinar, con evidencia reciente dirigida a la apoptosis de las células del túbulo proximal. En este estudio, investigamos el contenido proteico de los exosomas urinarios en pacientes con V-AKI para dilucidar aún más los biomarcadores de los mecanismos de lesión y las posibles respuestas. Métodos: Se incluyeron en el análisis muestras de orina de pacientes con V-AKI que se inscribieron en el estudio DIRECT y controles sanos emparejados del UAB-UCSD O'Brien CenterBiorepository. Los exosomas se extrajeron utilizando el principio de exclusión de disolventes y la precipitación inducida por polietilenglicol. La identidad y la cuantificación de las proteínas se determinaron mediante cromatografía líquida sin etiquetas-espectrometría de masas (LC/MS). La creatinina sérica máxima media fue de 3,7 ± 1,4 mg/dl y el tiempo hastariñónlesiónfue de 4.0 ± 3.0 días. Al alta, el 90 por ciento de los pacientes demostraron una recuperación parcial; El 33 por ciento experimentó una recuperación completa el día 28. Los análisis proteómicos en cinco V-AKI y 7 muestras de control revelaron 2009 proteínas en todas las muestras y 251 proteínas significativamente asociadas con V-AKI (puntaje Pi > 1). Las principales proteínas discriminatorias fueron el complemento C3, el complemento C4, la proteína de unión a galectina-3-, el fibrinógeno, la macroglobulina alfa-2, la mu constante pesada de inmunoglobulina y la serotransferrina.

Conclusión:Los exosomas urinarios revelan una regulación positiva de las proteínas inflamatorias después de una lesión nefrotóxica en V-AKI. Se necesitan más estudios para una gran muestra de pacientes para confirmar estos hallazgos para la aclaración de los mecanismos fisiopatológicos y la validación de posibles biomarcadores de lesiones.

Palabras clave:vancomicina; LRA; nefrotoxicidad; exosomas; inflamación; complementar; vías inmunitarias

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1. Introducción

La vancomicina es un antibiótico glicopeptídico utilizado para el tratamiento de infecciones por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina en pacientes críticos. La nefrotoxicidad es un evento adverso grave que afecta al 10-20 % de los pacientes tratados y se asocia con una mayor duración de la estancia hospitalaria, 30-tasas de reingreso al hospital de día y 30-mortalidad diaria por todas las causas [1]. aguda asociada a vancomicinariñónlesión(V-AKI) está relacionado con la dosis y con un inicio de 4 a 17 días de inicio de la terapia. Aunque la V-AKI se ha reconocido durante mucho tiempo como un efecto secundario importante de la vancomicina, los mecanismos de nefrotoxicidad aún no se conocen bien. La comprensión de las respuestas celulares y moleculares desencadenadas por la vancomicina es de vital importancia para comprender los mecanismos y desarrollar estrategias para minimizar el riesgo de LRA y los costos asociados, al mismo tiempo que se maximiza su eficacia en el tratamiento de infecciones. La respuesta renal tóxica parece estar causada por un efecto directo de la vancomicina sobre el epitelio de los túbulos proximales [2]. Hasta la fecha, se han aplicado enfoques toxicogenómicos estándar para estudiar V-AKI en modelos de ratón, pero faltan estudios en humanos [3–5]. Los modelos animales demuestran que la administración de vancomicina induce estrés oxidativo que puede contribuir a la lesión renal [6,7]. Un posible mecanismo de lesión es el atrapamiento del fármaco en las células del túbulo proximal, ya que es transportado por los transportadores de cationes orgánicos (OCT) a través de la membrana basolateral y hacia la célula del túbulo proximal, pero no se han identificado mecanismos activos de transporte de salida [6]. –8].

Los exosomas son vesículas microcíticas derivadas de la membrana que desempeñan un papel clave en la comunicación intercelular y el suministro de proteínas/ácidos nucleicos y brindan el potencial para el descubrimiento de nuevos biomarcadores para ayudar en el diagnóstico clínico deriñónlesión[9]. Se ha propuesto que los exosomas tienen una mayor especificidad y sensibilidad para el descubrimiento de biomarcadores, lo que se atribuye a la estabilidad de las muestras en comparación con los enfoques transcriptómicos y proteómicos que utilizan muestras convencionales de suero y orina [9]. En este estudio, probamos la hipótesis de que el cambio en las proteínas del exosoma urinario en respuesta a V-AKI ayuda a dilucidar los mecanismos de lesión e identifica nuevos biomarcadores entre pacientes con lesión renal confirmada inducida por fármacos. Para ello, empleamos sujetos del estudio del Consorcio de Lesiones Renales Inducidas por Drogas (DIRECT), que es una cohorte internacional multicéntrica de casos adjudicados clínicamente de insuficiencia renal aguda inducida por fármacos.riñónlesióny controles basados ​​en la población para examinar predictores farmacogenómicos utilizando una asociación de todo el genoma. Los detalles del estudio DIRECT se describen en la sección Métodos y en una publicación reciente de nuestro laboratorio [10].

2. Resultados

Se incluyeron en los análisis muestras de orina de 22 sujetos, 10 casos de LRA-V y 12 controles. Los datos demográficos de los pacientes fueron similares entre los casos y controles de LRA-V y se resumen en la Tabla 1. Como era de esperar, la prevalencia de hipertensión, diabetes e insuficiencia cardíaca fue mayor en los casos de LRA-V que en los controles (Tabla 1).

Todos los casos de LRA-V desarrollaron LRA en estadio 2 o superior según lo definido por los criterios para mejorar los resultados globales de la enfermedad renal (KDIGO) (Figura 1) [11]. El inicio de V-AKI ocurrió 4.0 ± 3.0 días después del inicio de la vancomicina. El curso temporal de los cambios en la creatinina sérica (Scr) desde el ingreso al hospital hasta el alta hospitalaria, y posteriormente, se muestra en la Figura 1.

Figura 1. Cambios en la creatinina sérica durante el curso V-AKI. Esta figura muestra los cambios en la creatinina sérica en 10 casos durante el curso de la enfermedad aguda asociada a vancomicina.riñónlesióndesde el ingreso hospitalario hasta el día 90 posterior a la lesión. Los puntos de tiempo corresponden a los puntos de tiempo del estudio del Drug-Induced Renal InjuryConsortium (DIRECT). Abreviaturas: SCr=creatinina sérica, Hospital=ingreso hospitalario, Predrogas=antes de la exposición a las drogas, DIRI=se cumplió la definición de lesión renal inducida por drogas, DrugDC {{8} } suspensión del fármaco o reducción de la dosis, Nadir Scr=suero más bajo después de V-AKI, Hospital Disch= alta hospitalaria

Los factores de riesgo iniciales en los casos de LRA-VA incluyeron sepsis (30 por ciento), enfermedad cardíaca (30 por ciento), diabetes mellitus (30 por ciento), anemia (20 por ciento), exposición a radiocontraste (10 por ciento), enfermedad hepática (10 por ciento) y hipoalbuminemia (10 por ciento) (Figura 2).

A lo sumo, los casos de LRA-V habían recibido episodios de dosificación de tres fármacos de vancomicina. Las dosis diarias de vancomicina oscilaron entre 1000 y 4000 mg. La media (rango intercuartílico (RIC)) del número de días transcurridos en cada episodio de dosificación se muestra en la Figura 3. La media (desviación estándar (DE)) de las concentraciones plasmáticas mínimas de vancomicina asociadas con los episodios de dosificación 1–3 se elevaron a 20,6 ± 8,1, 29,6 ± 16,3, 38,0 ± 13 mg/L, respectivamente. Sin embargo, la diferencia de concentraciones entre cada uno de los episodios no fue estadísticamente significativa (episodio 1 vs 2 p=0.5, episodio 2 vs 3 p=0.41)

Otros datos de resultados se resumen en la Tabla 2. Dada la gravedad de la lesión, el 20 por ciento de los pacientes requirió terapia de reemplazo renal. La mortalidad intrahospitalaria fue del 10 por ciento. Tras el alta hospitalaria, el 90 por ciento de los pacientes no se recuperaron de V-AKI. A seis pacientes se les midió la Scr el día 28 después de la lesión y a cuatro el día 90. Para el día 28, dos de seis (33 por ciento) pacientes tenían AKD pero ninguno de los cuatro pacientes restantes tenía AKD para el día 90.Riñónse realizaron biopsias en el 20 por ciento de los casos de LRA-V (Tabla 2).

Las 12 muestras que se calificaron para análisis después de imponer el filtro para hacer coincidir los péptidos con sus espectros afines contenían un total de 2009 proteínas. Estas proteínas se analizaron más. Primero, se realizó un análisis de coordenadas principales (PCoA) para comparar el proteoma general de cada muestra. Este análisis reveló una separación significativa (valor p de PERMANOVA=0.037) entre AKI y las muestras de control (Figura 4), recapitulando el fenotipo a nivel sistémico también a nivel de proteína del exosoma, aumentando así nuestra confianza en estos conjuntos de datos. . La fuerza de la asociación entre cada proteína y el estado de V-AKI se clasificó utilizando la métrica del valor pi, que combina la importancia del valor p con el cambio de veces [12].

Figura 4. La composición del proteoma distingue los exosomas urinarios de los pacientes y controles con V-AKI. (A) Análisis de coordenadas principales de proteomas de muestra. Se utilizó la métrica de distancia de Bray-Curtis para calcular las diferencias entre el proteoma de la muestra y se muestra una gráfica de coordenadas principales. Se observó separación a lo largo de los ejes 1 y 3 entre las muestras AKI (rojo) y las muestras de control (azul). (B) Diagrama de caja que resume la distancia de Bray-Curtis entre las muestras de control y AKI. La separación estadística entre AKI y las muestras de control que se muestra en (A) se probó usando una prueba de análisis permutacional de varianza (PERMANOVA). Se muestran diagramas de caja que resumen los resultados al comparar distancias de muestras de control o AKI con muestras de control.

A continuación, las comparaciones binarias entre V-AKI y las muestras de control arrojaron 42 proteínas significativamente asociadas con el fenotipo AKI y 26 proteínas asociadas con el fenotipo de control (puntuación Pi > 1) (Tabla complementaria S1). En la Figura 5A se muestra un diagrama de volcán que ilustra la importancia y el cambio de pliegue asociado con cada proteína. Las principales proteínas discriminatorias para los casos de LRA-V fueron el fibrinógeno, el complemento C3, el complemento C4, la proteína de unión a galectina-3-, la macroglobulina alfa-2, la mu constante pesada de inmunoglobulina y la serotransferrina (Figura 5B). Se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes entre proteínas significativas para identificar categorías de proteínas alteradas en pacientes con LRA-V y los resultados se resumen en la Tabla complementaria S1. Se demostró que varias proteínas que estaban asociadas con el fenotipo AKI tenían funciones vinculadas a la inflamación y/o mediación del fenotipo inflamatorio. Para probar si estos cambios en las proteínas podrían estar relacionados con cambios en la señalización de citoquinas subyacente, se realizó una inferencia de citoquinas, que indicó una fuerte relación entre las proteínas asociadas a AKI y las citoquinas IL10, IL6 y TNF. Estas citocinas contenían 2,8, 2,3 y 2.1- veces más conexiones con proteínas asociadas a AKI que con proteínas asociadas al control, respectivamente, como se resume en la Figura 5C. Las redes de interacción proteína-proteína de las proteínas asociadas a AKI y las citoquinas inferidas mostraron conexiones predominantemente proinflamatorias entre las proteínas asociadas a AKI, como se resume en la Figura 5D.

Figura 5. Asociaciones de nivel de proteína con V-AKI. (A) Gráfica de volcán que muestra el cambio de veces y la importancia de la prueba t de cada proteína para el estado de V-AKI. Las 10 proteínas principales asociadas con AKI y el estado de control se muestran en azul y rojo respectivamente. Otras proteínas asociadas basadas en una puntuación Pi > 1 se muestran en amarillo. (B) Se calculó una puntuación Pi, que representa tanto el cambio de pliegue como la significancia de la prueba t para cada proteína y se representan gráficamente las proteínas con las asociaciones más fuertes. (C) Topcitocinas asociadas con AKI o proteínas de control. Se tomó un enfoque de inferencia de citocinas basado en redes y se muestran las citocinas que muestran las puntuaciones de enriquecimiento más fuertes hacia AKI o proteínas asociadas de control. Las barras rojas representan citoquinas relacionadas con proteínas asociadas a AKI, las barras azules representan citoquinas relacionadas con proteínas asociadas al control. (D) Red de interacción proteína-proteína de proteínas asociadas a AKI y citoquinas inferidas enriquecidas con AKI. El borde exterior de los nódulos de proteína está coloreado dependiendo de las asociaciones con citocinas pro o antiinflamatorias. El tamaño de cada nodo representa la fuerza de la asociación estadística de cada proteína con el estado de AKI.

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3. Discusión

Presentamos un enfoque novedoso para utilizar exosomas urinarios para informar los mecanismos fisiopatológicos involucrados en la inducción de fármacos.riñónlesiónusando vancomicina como el tóxico renal prototípico. Una de las fortalezas de este estudio es la incorporación de datos bien caracterizados a nivel de paciente del estudio DIRECT [10] desarrollado para dilucidar los mecanismos, incluida la genómica de la inducción de fármacos.riñónlesión. Los sujetos con LRA en estadio 2 o superior estuvieron expuestos a factores de riesgo convencionales al inicio del estudio. Todos los sujetos del estudio tenían concentraciones mínimas plasmáticas significativamente elevadas de vancomicina a pesar de recibir dosis diarias inferiores al umbral de nefrotoxicidad generalmente aceptado de 4 g por día [13]. Muchos sujetos no se recuperaron por completo de V-AKI en el momento del alta hospitalaria y tuvieron enfermedad renal aguda durante el mes siguiente a la lesión. Como era de esperar, pocos pacientes recibieron una biopsia renal.

La proteómica del exosoma urinario/vesícula extracelular (EV) demostró que las proteínas discriminatorias específicas para los casos de LRA-V incluían complemento C3, complemento C4, proteína de unión a galectina-3-, fibrinógeno, macroglobulina alfa-2, mu constante pesada de inmunoglobulina y serotransferrina. Estos hallazgos de exosomas informan los mecanismos de lesión a nivel subcelular/supramolecular para V-AKI y potencialmente sirven como biomarcadores a lo largo del proceso continuo de la enfermedad inducida por fármacos.

Los exosomas, presentes en la sangre y la orina, tienen funciones importantes en la comunicación intercelular, la coagulación y la gestión de desechos [14]. Después de la aguda relacionada con la toxinariñónlesión, los exosomas liberados de las células epiteliales tubulares pueden comunicar señales de lesión para reclutar la infiltración de macrófagos y promover la inflamación tubulointersticial [15]. Razonamos que el contenido de proteínas de los exosomas diferiría entre los casos de V-AKI y los controles sanos. Doscientas cincuenta y una proteínas estaban desreguladas en V-AKI, y parecían estar predominantemente involucradas en las vías inflamatorias y de coagulación. Entre estas 251 proteínas, nuestro análisis demostró que el complemento C3, el complemento C4, la proteína de unión a galectina-3-, el fibrinógeno, la macroglobulina alfa-2, la mu constante pesada de inmunoglobulina y la serotransferrina se asociaron significativamente con los casos de LRA-V.

En base a nuestros resultados de que C3 y C4 se encontraban entre las principales proteínas de exosomas V-AKI discriminatorias, proponemos que la activación de un sistema del complemento está involucrada en la lesión tubular renal inducida por vancomicina. Esto también está de acuerdo con la literatura publicada de que la activación del sistema del complemento juega un papel en la glomerulonefritis por complejos inmunes y una amplia gama de enfermedades renales [16]. El daño renal mediado por la activación del complemento en la LRA debido a isquemia o exposición a nefrotoxinas se ha relacionado con eventos inflamatorios sistémicos que desencadenan y contribuyen a la lesión de órganos remotos y la mortalidad del paciente [17]. En modelos de lesión por isquemia-reperfusión (IR), la hipoxia, el agotamiento de ATP y el daño mitocondrial dan como resultado la generación de radicales libres de oxígeno tras la reperfusión [18]. Las citocinas, las quimiocinas y la activación del complemento amplifican la inflamación y provocan una lesión tubular aguda. Además, los ratones deficientes en los receptores C3a y C5a están protegidos de la lesión por IR [19,20]. Se ha demostrado que la lesión por RI aumenta la producción local de componentes del complemento alriñóncélulas endoteliales y tubulares [16,21]. Varios estudios en modelos animales y sujetos humanos han identificado una mayor deposición de productos de proteínas del complemento como C3 y C4 a lo largo de la membrana basal tubular después de un trauma o lesión en elriñón. No se ha encontrado que estos niveles aumentados de depósitos estén presentes de manera significativa en la región peritubular o de los glomérulos, pero se concentran en gran medida en la membrana tubular, como se observa en biopsias de humanos y modelos de riñones en animales [17]. Los exosomas y los vehículos eléctricos pueden transportar componentes circulatorios del complemento cuando la activación del complemento está desregulada [22,23]. Varios experimentos celulares y observaciones clínicas han confirmado que los vehículos eléctricos liberados transportan y modulan las proteínas del complemento y, simultáneamente, su producción en condiciones inflamatorias también puede influir en el número de vesículas circulatorias [23]. Esta interdependencia de los dos procesos lleva a la conclusión de que los EV exhiben el potencial de ser fuentes de biomarcadores, dianas y agentes de administración terapéutica hacia el complemento y los compuestos inmunomoduladores que son muy relevantes en el ámbito de los mecanismos inflamatorios de la LRA. Nuestro hallazgo de que las muestras de V-AKI en comparación con los controles sanos demuestra el papel de las respuestas inmunitarias a la toxicidad directa de la vancomicina en las células tubulares renales. Además de todo el contenido proteico anterior, los exosomas/EV derivados de la orina también representan biomarcadores no invasivos potenciales como alternativas a la biopsia renal para detectar e informar sobre el papel del sistema del complemento en la enfermedad inducida por fármacos.riñónlesión.

Aunque muchos estudios anteriores (consulte las siguientes oraciones para referencias específicas) se han centrado en el papel de la galectina-3 (Gal-3) enriñónlesión, hay pocos datos sobre la proteína de unión a galectina-3 (Gal-3-bp). Gal-3 se expresa en los túbulos colectores del riñón y funciona para promover la nefrogénesis, modular las interacciones célula-célula y célula-matriz, y regular la inflamación [24–26]. Henderson et al. revisó el papel de Gal-3 en la inflamación y encontró que Gal-3 es un componente clave en la inflamación crónica y si la lesión tisular se vuelve recurrente. Facilita el "bloqueo" de la lesión tisular, retrasando la propagación de la lesión [27]. Además, Nishiyama et al. demostraron en ratas con LRA isquémica que el ARNm de Gal-3 estaba regulado al alza, y la siguiente reperfusión, la inmunohistoquímica reveló un aumento de Gal-3 en los segmentos de la nefrona [25]. Tsuchiyama et al. encontró que la administración de Gal-3 en ratas con nefritis sérica nefrotóxica condujo a una reducción en la excreción urinaria de proteínas, formación de medias lunas y disminución de la infiltración de macrófagos en los glomérulos [28]. Esto sugiere que después de una lesión isquémica o inmunomediada, Gal-3 juega un papel en la regeneración. Como socio afín de Gal-3, el papel fundamental de Gal-3-bp, y la razón de su regulación positiva en la lesión nefrotóxica debido a la vancomicina y otros agentes, sería un enfoque imperativo en futuras investigaciones.

Nuestro estudio también encontró que las tres subunidades de fibrinógeno están desreguladas, lo cual está de acuerdo con los datos publicados anteriormente. El fibrinógeno es una molécula plasmática dimérica soluble y cada dímero está compuesto por tres polipéptidos: alfa, beta y gamma [29]. Desempeña un papel clave en la hemostasia y la coagulación, pero también se ha demostrado que es importante en la regulación de afecciones mediadas por inflamación [30–32]. Ajay et al. mostró que la disponibilidad de fibrinógeno es importante para la función renal, la inflamación y la supervivencia [33]. Además, el fibrinógeno podría tener un efecto antiadhesivo en las células epiteliales del riñón que podría ser beneficioso al ayudar a prevenir la obstrucción tubular [34]. El fibrinógeno aumenta significativamente y se regula positivamente en la LRA y se ha evaluado previamente como un biomarcador potencial para la detección temprana de la LRA [29]. Hoffman et al., estudiaron el cambio en el fibrinógeno después de la isquemia/reperfusión y la administración de cisplatino en ratas, y el ARNm aumentó 30 min después de la lesión por RI bilateral y alcanzó un pico a las 48-72 h, mientras que en la administración de cisplatino, la expresión del fibrinógeno en el ARNm fue menor. detectado a las 24 h [29]. El fibrinógeno urinario se detectó tan pronto como 3 h después de la lesión por reperfusión isquémica y 24 h después de la administración de cisplatino, lo que corresponde a grandes aumentos enriñónlesiónmolécula 1 (KIM-1) [29].

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Históricamente, se han aceptado generalmente dos mecanismos fisiopatológicos diferentes para la LRA-V, la necrosis tubular aguda por efectos tóxicos directos y la nefritis intersticial aguda. El epitelio tubular proximal renal sufre pérdida de integridad del citoesqueleto, necrosis y apoptosis en la necrosis tubular aguda [35]. Las células necróticas liberan moléculas que regulan al alza el sistema inmunitario innato, lo que induce inflamación y acelera la lesión tubular [35]. En el estudio actual, demostramos marcadores inflamatorios en las EV urinarias de pacientes con V-AKI. Además, encontramos una relación proinflamatoria entre las citocinas IL10, IL6 y TNF y nuestras principales proteínas discriminatorias de AKI. En conjunto, estos datos sugieren que la fisiopatología de la LRA-V es de toxicidad tubular con aumento de la inflamación durante el período de 24 a 72 horas posteriores a la lesión.

Existen varias limitaciones de nuestro estudio. El pequeño tamaño de la muestra de 22 pacientes que eran hombres y predominantemente caucásicos limita la generalización de nuestros hallazgos a otros géneros, razas y etnias. Una segunda limitación de nuestro estudio fue que la muestra de exosoma urinario de cada paciente tenía cantidades variables de proteína total, lo que dificultaba la medición de proteínas específicas, especialmente para aquellas con cantidades absolutas más bajas. Si bien esta no es necesariamente la limitación de este estudio per se, ya que la capacidad de cada individuo para empaquetar proteínas en sus exosomas de orina es naturalmente variable, las cantidades más bajas de proteínas en algunos individuos limitan nuestra capacidad para realizar análisis adicionales y sacar conclusiones significativas que se puedan generalizar a poblaciones más grandes. Una tercera limitación es la muestra de punto de tiempo único que limita nuestra comprensión de los cambios celulares que ocurren en diferentes fases del continuo AKI, por ejemplo, fase de lesión inmediata, fase de reparación, etc. El muestreo secuencial mejorará nuestra comprensión del curso temporal del contenido de exosomas. cambios, estrés oxidativo inducido por la acumulación de fármacos y regulación positiva de las vías inmunitarias en reparación. El estudio actual incluyó pacientes definidos por los umbrales de Scr. La creatinina sérica es un biomarcador funcional renal imperfecto ya que las elevaciones en Scr a menudo se retrasan con respecto a la lesión [36]. Esto limita la sensibilidad y especificidad de Scr para detectar tempranamenteriñónlesión[36], y han surgido estudios que identificanriñónlesiónbiomarcadores comoriñón lesiónmolécula 1 (KIM1) y lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) para la detección temprana de nefrotoxicidad [37,38]. Como se informó anteriormente, los biomarcadores tienen el potencial de detectar niveles manifiestos y subclínicos deriñónlesión[39,40].

4. Materiales y Métodos

4.1. Selección de pacientes

Se incluyeron en el análisis muestras de orina de 10 pacientes con V-AKI, que se inscribieron en el estudio DIRECT [10] y 12 muestras de orina de control sanas del Biorepositorio del UAB-UCSD O'Brien Center. Los sujetos de control se emparejaron por género, raza y década de edad con los sujetos del estudio y no tenían exposición a la vancomicina oriñónlesión. El estudio DIRECT es un estudio internacional que examina los predictores farmacogenéticos de lariñónlesiónutilizando un estudio de asociación de todo el genoma de casos y controles basados ​​en la población [10]. El estudio DIRECTO fue aprobado por la junta de investigación institucional (IRB #121651) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de la inscripción, que incluía la disposición de utilizar muestras almacenadas para análisis futuros. La LRA se definió en DIRECT como una reducción abrupta de la función renal demostrada por cualquiera de los siguientes criterios: (1) aumento absoluto de la creatinina sérica (Scr) (mayor o igual a 0,3 mg/dl o mayor o igual a 26,4 µmol/ L) (dentro de 48-h ventana de tiempo) desde el valor de Scr de referencia, (2) porcentaje de aumento en Scr mayor o igual al 50 por ciento (1,5 veces desde la referencia) dentro de los siete días, (3) reducción en la orina de salida (oliguria documentada de<0.5 ml/kg/h="" for="">6 h) a pesar de la reanimación adecuada con líquidos cuando corresponda, (4) disminución absoluta en Scr de Mayor o igual a 0.3 mg/dL o Mayor o igual a 26.4 µmol/L (dentro de 48- h ventana de tiempo) desde la referencia Scr, y (5) disminución relativa en Scr mayor o igual al 50 por ciento (1,5 veces desde la referencia) dentro de los siete días. Se incluyeron en el estudio pacientes con LRA en estadio 2 o superior después de la exposición a vancomicina. Los datos clínicos, incluidos datos demográficos, historial médico, hallazgos del examen físico, signos vitales, química sanguínea y urinaria, resultados de biopsias y datos de dosificación de medicamentos, se recopilaron en los siguientes momentos: (1) ingreso hospitalario, (2) inicio de vancomicina, ( 3) pico de lesión, (4) suspensión del fármaco o reducción de dosis, (5) resolución de la lesión, (6) alta hospitalaria, (7) 28 días y (8) 90 días después de la lesión. Un episodio de dosificación de vancomicina se definió como un cambio en la dosis o la frecuencia. La enfermedad renal aguda (AKD, por sus siglas en inglés) se define como la persistencia de la LRA en estadio 1 o superior mayor o igual a 7 días después de la exposición [41]. Los pacientes se clasificaron con AKD en el momento del alta hospitalaria si persistía la etapa 1 o mayor de AKI y el tiempo desde la exposición hasta el alta hospitalaria era superior a siete días. Se obtuvieron muestras de orina y sangre entera de todos los participantes. Todos los casos de LRA-V fueron adjudicados por dos nefrólogos independientes (EM, JC, RL) para determinar la causalidad. Una descripción completa de los métodos ha sido publicada previamente [10].

4.2. Preparación de exosomas y recopilación de datos proteómicos

Se recolectaron muestras de orina y sangre de los participantes del estudio DIRECT y las muestras se congelaron a -80 ◦C antes de la preparación del exosoma. Las muestras de orina utilizadas en este análisis se seleccionaron del período de tiempo más cercano al daño renal que va de 24 a 72 h despuésriñónlesión. Los exosomas se extrajeron de muestras de orina de AKI congeladas utilizando un protocolo interno desarrollado en base al principio de exclusión de solventes utilizando precipitación inducida por polietilenglicol (PEG), como se describe en Rao et al. La página de publicación reciente [42] de las proteínas exosómicas se realizó antes de la tripsinización del gel utilizando geles de 12 pocillos de acrilamida al 10 % NuPAGE bisTris para resolver 40 µl de proteína de los exosomas de las muestras de orina de control y LRA.

Los extractos de gel se combinaron con un tampón para evitar la proteólisis que contenía NaCl 75 mM (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.), dodecilsulfato de sodio al 3 % (SDS, Fischer, Arnold AFB, Tullahoma, TN, EE. UU.), NaF 1 mM (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.), beta glicerofosfato 1 mM (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.), beta-glicerofosfato 1 mM (Sigma, Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.), sodio 1 mM ortovanadato (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.), pirofosfato de sodio 10 mM (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.), fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF, Sigma) y 1 × Mini EDTA completo comprimido de inhibidor de proteasa libre todo en HEPES 50 mM (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.), pH 8,5. Para desnaturalizar las proteínas, se añadió un volumen igual de urea 8 M en HEPES 50 mM, pH 8,5, y se realizó la sonicación de la sonda utilizando intervalos de dos 10- s al 25 por ciento de amplitud. Las proteínas se redujeron, alquilaron y extinguieron utilizando ditiotreitol y yodoacetamida, como se describió anteriormente [43]. Las proteínas se precipitaron mediante la adición de ácido tricloroacético (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) a las muestras en hielo y la sedimentación de las proteínas mediante centrifugación a 4 ◦C. Los sedimentos de proteína se lavaron dos veces con acetona helada. Los gránulos de proteína se secaron a 56 ◦C durante 30 min, luego se resuspendieron en urea 1 M en HEPES 50 mM y luego se digirieron durante la noche a temperatura ambiente con 6 µg de LysC (Wako, Richmond, Commonwealth of Virginia, EE. UU.) seguido de {{27} }h digestión con tripsina grado secuenciación (Promega, Fitchburg, WI, USA) a 37 ◦C. Las muestras se desalinizaron a través de C18 Sep-Paks y se cuantificaron las proteínas [44]. Se analizó un total de 1,0 ug de proteína por muestra mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS [2]) utilizando un gradiente de cromatografía líquida de 85 min en un Easy-nLC 1000 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) conectado en línea a un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion (Thermo Fischer Scientific).

La cromatografía se realizó en una columna de 30 cm extraída y empaquetada en el hogar que se empaquetó tres veces con 0,5 cm, 0,5 cm y 30 cm de 5 µm C4, 3 µm C18 y 1,8 µm C18, respectivamente, y se calentaron a 60 ◦C. Los péptidos se cargaron primero a 500 bar, seguido de un gradiente de cromatografía que varió del 6 al 25 por ciento de acetonitrilo durante 70 minutos, seguido de un gradiente de 5- minutos al 100 por ciento de acetonitrilo, que se mantuvo durante 10 minutos. La ionización por electropulverización se realizó aplicando 2000 V a través de una unión en T de acero inoxidable que conectaba la columna analítica y el sistema Easy-nLC. A cada muestra le siguieron dos lavados comenzando con un gradiente de 3 a 100 por ciento de acetonitrilo durante 15 min con 10 min adicionales al 100 por ciento de acetonitrilo. Se escaneó un rango de masa a carga (m/z) de 375 a 1500 en busca de péptidos con estados de carga entre 2 y 6. Los datos del centroide se usaron para la cuantificación de los picos. La adquisición se realizó en un modo de iones positivos dependiente de los datos. Los espectros sin procesar se buscaron en Proteome Discoverer versión 2.1 contra la base de datos de referencia UniProt (www.uniprot.org (consultado el 5 de noviembre de 2017)) para Homo sapiens utilizando el algoritmo Sequest [18] junto con un enfoque de base de datos inversa utilizado para controlar péptidos y falsos descubrimientos (FDR) al 1 por ciento [17]. Digerido de tripsina in silico como se especifica en los parámetros de búsqueda junto con una longitud mínima de péptido de seis aminoácidos. La configuración de búsqueda también incluyó la modificación dinámica para la oxidación de metioninas y una modificación estática de la carbamidometilación de cisteínas. La tolerancia de masa de precursor se fijó en 50 ppm y la tolerancia de masa de fragmento de 0,6 Da.

Además de las coincidencias espectrales y las proteínas restringidas a<1% fdr,="" peptide="" matches="" were="" further="" screened="" to="" only="" include="" peptide="" spectral="" matches="" (psms)="" identified="" with="" high="" confidence.="" the="" summed="" abundance="" of="" the="" area="" under="" the="" curve="" of="" ms1="" peaks="" associated="" with="" psms="" was="" used="" to="" represent="" protein="" abundances.="" to="" help="" account="" for="" run-to-run="" variation="" in="" lc-ms2="" experiments,="" the="" raw="" protein="" abundances="" were="" next="" normalized="" by="" a="" two-step="" process.="" in="" the="" first="" step,="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" average="" abundance="" of="" a="" given="" protein="" throughout="" the="" experiment="" divided="" by="" the="" median="" of="" the="" protein="" averages="" observed="" throughout="" the="" experiment.="" in="" the="" second="" step,="" the="" adjusted="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundances="" observed="" within="" their="" respective="" samples="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundance="" observed="" in="" the="" entire="" experiment.="" records="" of="" the="" normalization="" and="" analysis="" of="" proteomics="" data="" are="" available="" in="" a="" jupyter="" notebook="" form="" at="">

4.3. Análisis de datos de proteómica

Los registros del análisis de datos proteómicos se cargaron en un formato de cuaderno jupyter en un repositorio de Github (consultado el 3 de marzo de 2021)). El análisis de coordenadas de principio (PCoA) se realizó utilizando Qiime2 (versión 2019-7) [45]. El comando de métricas centrales de diversidad de tiempo se usó para calcular las distancias entre muestras usando la métrica de Bray-Curtis y la visualización usando un PCoA. El análisis estadístico de las distancias entre las muestras de control y V-AKI se realizó utilizando una prueba PERMANOVA por pares a través del comando "importancia del grupo beta de la diversidad de qiime". Se creó una visualización de diagrama de caja de estos resultados a través del paquete seaborn (consultado el 3 de marzo de 2021)). Las comparaciones binarias de casos de LRA-VA y sujetos de control se realizaron con el paquete scipy ((consultado el 3 de marzo de 2021)) mediante una prueba t independiente con varianza desigual. La fuerza de la asociación entre cada proteína y el estado de V-AKI se clasificó utilizando la métrica de valor pi que combina la importancia del valor p con el cambio de veces [12]. Como se describió anteriormente [46], las asociaciones significativas mejor clasificadas se definieron como aquellas que tenían un valor de pi > |1|. Cada asociación de proteína con el estado de V-AKI se trazó en un gráfico de volcán para resaltar aún más la ubicación de las proteínas mejor clasificadas-10. El análisis de enriquecimiento del conjunto de genes se realizó utilizando el servidor DAVID [47], comparando proteínas significativas (valor pi > |1|) con un fondo de todas las proteínas identificadas en el conjunto de datos. Los grupos de enriquecimientos funcionales relacionados se informan en la Tabla complementaria S1.

To test for a relationship between V-AKI-associated proteins and inflflammatory cytokines, a recently developed network-based cytokine inference approach was utilized [48]. Briefly, a list of cytokines (TGFb, TNF, IFN, IL1-40, CXCL1-16, CCL1-27) was submitted alongside signifificantly altered proteins (pi-value > |1|) to the STRING-db tool [49]. Connections between proteins were determined using all interaction sources and a minimum interaction score >0.4. Primero se filtraron las citocinas para que tuvieran al menos cinco conexiones con proteínas significativamente alteradas. Luego, se comparó la proporción de conexiones entre cada citocina y proteínas asociadas a V-AKI o asociadas al control con el número total de conexiones entre proteínas asociadas a V-AKI o asociadas al control. Para tener en cuenta las diferencias en el número de conexiones que cada citocina tiene con otras proteínas, este valor se comparó a continuación con el número de conexiones que cada citocina tenía con todas las proteínas significativamente alteradas. Las puntuaciones de enriquecimiento para las citoquinas seleccionadas se representaron gráficamente para sus asociaciones con V-AKI o proteínas asociadas con el control. Finalmente, una búsqueda refinada de proteínas asociadas a V-AKI y las citocinas con conexiones enriquecidas a proteínas asociadas a V-AKI se visualizaron para sus interacciones usando Cytoscape versión 3.5.1 [50]. Las redes de interacción proteína-proteína se decoraron midiendo cada proteína asociada a V-AKI de acuerdo con su asociación de puntaje pi con el estado de V-AKI y se colorearon al tener una conexión inferida con las citoquinas enriquecidas con efectos pro o antiinflamatorios.

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5. Conclusiones

Buscamos comprender mejor el mecanismo de lesión para V-AKI de casos adjudicados clínicamente y, curiosamente, encontramos que el complemento, la proteína de unión a galectina-3 y el fibrinógeno estaban significativamente asociados con V-AKI. Los resultados de estudios previos y los nuestros sugieren un papel del sistema del complemento y las vías inflamatorias en V-AKI. Si bien se necesitan estudios más amplios para validar los procesos moleculares en el daño inducido por la vancomicina y las vías de reparación subsiguientes, los resultados indican que los exosomas urinarios pueden aportar información importante sobre los mecanismos fisiopatológicos y pueden servir como biomarcadores para el daño inducido por fármacos.riñónlesión.

Contribuciones de autor:

Conceptualización, LA y SPR, metodología, SV, SPR, DJG, RM; software, DJG, RHM, análisis formal, LA, AL, RHM; investigación, AL, JA, VJ, SB, MC-T., PN; redacción—preparación del borrador original, AL, JA, VJ, LA; redacción—revisión y edición, RHM, DJG, MC-T., AT, AA, JC, MSJ, EM, RM, PN; supervisión, SV, SPR; administración de proyectos, LA; adquisición de fondos, LA Todos los autores han leído y están de acuerdo con la versión publicada del manuscrito.

Fondos:

Esta investigación fue financiada por el Consorcio Internacional de Eventos Adversos Graves. MCT fue apoyado por T32 Training Grant DK007202.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional: El estudio se realizó de acuerdo con las pautas de la declaración de Helsinki y fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (o Comité de Ética) de la Universidad de California, Programa de Protección de la Investigación de Sujetos Humanos de San Diego (IRB#121651).

Declaración de consentimiento informado: Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos involucrados en el estudio.

Expresiones de gratitud:

Nos gustaría reconocer las contribuciones de los investigadores DIRECTOS: Dinna Cruz, Stuart Goldstein, Patrick Murray, Andrew Davenport, Andrew Lewington, DavidSelewski, Michael Zappitelli, Marlies Ostermann, Li Yang, Bhavna Pandya, Patrick Brophy, DanielaPonce, Julia Steinke, Josee Bouchard, Carlos Irarrazabal, David Askenazi, Nitin Kolhe, RolandoClaure-Del Granado, Nadine Benador, Clare Castledine, Jonathan Barratt, Sunil Bhandari, AlyssaRiley, Ayse Akcan-Arikan, TK Davis, Christopher Farmer, Mark Thomas, Fred Pang, Kar Hui Ng , Hansjoerg Rothe.

Conflictos de interés:

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

De: 'Los exosomas urinarios identifican las vías inflamatorias en la lesión renal aguda asociada a la vancomicina' por Linda Awdishu

---Int. J. Mol. ciencia 2021, 22, 2784