La construcción de la vacuna recombinante Lactobacillus Casei de PEDV y sus respuestas inmunes en ratones

Abstracto

Fondo: La diarrea epidémica porcina (PED) es una enfermedad intestinal contagiosa causada por el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) caracterizada por vómitos, diarrea, anorexia y deshidratación, que han causado enormes pérdidas económicas en todo el mundo. En la actualidad, la inmunidad vacunal sigue siendo el método más eficaz para controlar la propagación de las PED. En este estudio, hemos construido una nueva cepa recombinante de L. casei-OMP16-PEDVS que expresa la proteína PEDVS de PEDV y la proteína OMP16 de la cepa Brucella abortus. Para conocer la inmunogenicidad de la vacuna candidata recombinante L. casei-OMP16-PEDVS, se comparó con BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{ 9}} PEDVS y proteína recombinante BL21-PEDVS.

Resultados: Los resultados mostraron que pudimos detectar niveles más altos de IgG, anticuerpos neutralizantes, IL-4, IL-10 e INF- en suero e IgA en heces de L. casei-OMP16- Ratones inmunizados con PEDVS, lo que indicó que la vacuna candidata L. casei-OMP16-PEDVS podría inducir niveles más altos de inmunidad humoral, inmunidad celular e inmunidad mucosa.

Conclusión: Por lo tanto, L. casei-OMP16-PEDVS es una vacuna candidata prometedora para la profilaxis de la infección por PEDV.

Palabras clave: PEDV, vacuna contra Lactobacillus casei, proteína S de PEDV, OMP16, respuestas inmunes

Beneficios de cistanche para hombres: fortalece el sistema inmunológico.

Introducción

La diarrea epidémica porcina (PED) es causada por el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) y sus síntomas incluyen diarrea, vómitos, anorexia, deshidratación y pérdida de peso en los lechones [1, 2]. Los cerdos de todas las edades pueden infectarse con diferentes síntomas y la tasa de mortalidad en los lechones llega al 100% [3], lo que ha provocado enormes pérdidas económicas en todo el mundo. Para controlar la propagación del PEDV, se fabrican la mayoría de los tipos de vacunas, como la vacuna inactivada con adyuvante de hidróxido de aluminio, la vacuna bivalente inactiva contra el virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV), la vacuna PEDV y la vacuna PEDV atenuada [4]. Aunque estas vacunas desempeñan un papel importante en el control de las PED, todas tienen sus defectos. Las vacunas inactivadas no pueden activar las respuestas inmunitarias celulares, las vacunas atenuadas no son muy seguras y no pueden inducir una producción suficiente de anticuerpos IgA específicos del virus de las respuestas inmunitarias de las mucosas. Por tanto, es necesario y urgente desarrollar una nueva vacuna para controlar las PED.

A menudo se considera que Lactobacillus casei es un tipo de sistema vectorial seguro para la administración dirigida de antígenos en la inmunización oral, con efectos beneficiosos para la salud de humanos y animales [5]. Mientras tanto, puede utilizarse como sistema de administración para regular la respuesta de las células T colaboradoras y estimular la secreción de IgA específicas para la inmunidad de las mucosas [6]. Por otro lado, la vacuna recombinante de Lactobacillus casei es más fácil de administrar, tiene menos posibilidades de sufrir una reacción de hipersensibilidad y es más rentable en comparación con las vacunas tradicionales. Según los informes, las vacunas recombinantes de Lactobacillus casei se han utilizado con éxito en la prevención y el control del virus del papiloma humano, Streptococcus pneumonia y Escherichia coli [7–9]. También hay algunos intentos similares de diseñar vacunas para DEP. Los investigadores descubrieron que una cepa recombinante de Lactococcus lactis que expresa una variante del gen S1 del virus de la diarrea epidémica porcina podría inducir niveles elevados de IL-4 e IFN- en ratones inmunizados [10]. La vacuna anti-PEDV basada en Lactobacillus casei que expresa el péptido Co1 dirigido a células en micropliegues fusionado con el antígeno COE de PEDV también podría inducir una respuesta inmune eficaz [11]. Mejorar la eficacia de la vacuna PEDV. En este estudio, construimos una nueva vacuna recombinante de Lactobacillus casei contra la DEP, que puede estimular respuestas inmunes mucosas, humorales y celulares más fuertes contra la infección por PEDV mediante administración oral. PEDV, un miembro de la familia coronaviridae, consta de cuatro proteínas estructurales que contienen la proteína de pico glicosilada (S) de 150 a 220 kDa, la proteína de membrana (M) de 20 a 30 kDa, la proteína de envoltura (E) de 7 kDa y la proteína de membrana (M) de 20 a 30 kDa. proteína de la nucleocápside (N) [12]. Allí, la proteína S se puede dividir en los dominios S1 (1–735 aminoácidos) y S2 (736-último aminoácido) [13], y la proteína S1 incluye la región de unión al receptor y los principales epítopos neutralizantes [ 14]. El adyuvante de la vacuna actúa como inmunomodulador y puede inducir y mejorar las respuestas inmunitarias contra los antígenos administrados conjuntamente. Se verificó que la proteína OMP16 de la cepa Brucella abortus activa las células dendríticas in vivo, induce una respuesta inmune th1 y era una vacuna autoadyuvante prometedora [15-17]. Por lo tanto, en nuestro estudio se insertó la proteína OMP16 en la vacuna recombinante del caso Lacto bacillus. Hasta el momento, se han informado pocos estudios sobre la vacuna recombinante de PEDV contra Lactobacillus casei. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo construir una nueva vacuna oral candidata a Lactobacillus casei, que pueda proporcionar una mejor inmunidad humoral, inmunidad celular e inmunidad de las mucosas para prevenir la propagación de la DEP.

Planta de hierba china cistanche-Antitumoral

Materiales y métodos

Cepas bacterianas, virus, condiciones de cultivo, plásmidos y cebadores.

polvo de cistanche

Las cepas bacterianas, plásmidos y cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1. La cepa de referencia estándar de Lactobacillus casei ATCC 393 se cultivó en caldo de Man Rogosa y Sharpe (MRS) a 37 grados [18]. BL21 (DE3) y DH5 se cultivaron en medio Luria-Bertani (LB) a 37 grados [19]. Las cepas recombinantes de Lactobacil lus casei, BL21 (DE3) y DH5 se cultivaron en el medio correspondiente con los antibióticos adecuados, respectivamente. Brucella abortus se cultivó en medio de caldo de soja tríptico (TSB) o agar de soja tríptico (TSA) (Difco Laboratories, Detroit, MI, EE. UU.) a 37 grados. Las células Vero infectadas con cepas de PEDV se cultivaron en DMEM (Gibco, Langley, VA, EE. UU.) suplementado con 10 ug/ml de tripsina (Gibco, Langley, VA, EE. UU.) [20]. Los plásmidos pVE5523 y pET28a (+) fueron vectores de expresión de Lactobacillus casei y Escherichia coli, respectivamente.

Tabla 1 Características de las cepas bacterianas, plásmidos y cebadores utilizados en este estudio.

La construcción de cepas recombinantes de Lactobacillus casei y BL21.

Los plásmidos de expresión recombinantes se construyeron basándose en los plásmidos y cebadores de la Tabla 1. Al principio, la secuencia parcial del gen PEDV S (493–708 aminoácidos), la secuencia parcial del gen PEDV S' (493–708 aminoácidos), y la secuencia parcial del gen OMP16 de Brucella abortus (26–168 aminoácidos) se amplificaron utilizando los pares de cebadores PEDVS-F1/R1, PEDVS-F2/R2 y OMP16-F/R, respectivamente. Posteriormente, se utilizó el método de extensión de superposición en los fragmentos de OMP16 y PEDVS para construir un nuevo fragmento OMP16-PEDVS con el polipéptido conector (GGGGSGGGGGGGGGS) pegado en el medio. Luego, los fragmentos PEDVS se insertaron en el plásmido pET28a con enzimas de restricción EcoRI/XbaI para generar el plásmido recombinante pET28a-PEDVS, y los nuevos fragmentos OMP16-PEDVS se insertaron en los plásmidos pET28a y pVE5523 con EcoRI/XbaI y SalI/EcoRV. enzimas de restricción para generar el plásmido recombinante pET28a-OMP16-PEDVS y pVE5523-OMP16-PEDVS, respectivamente. Los plásmidos recombinantes (pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS y pVE5523-OMP16-PEDVS) se transformaron en BL21 (DE3) o Lactobacillus casei ATCC393 mediante transformación o electroporación basada en el artículo informado [21].

Análisis de expresión de proteínas mediante Western blot.

Se determinó la expresión proteica de las cepas BL21-pET28a-PEDVS, BL21- pET28a-OMP16-PEDVS y L. casei-pVE5523-OMP16- PEDVS. detectado según el método informado con alguna modificación [21-23]. Las cepas recombinantes BL21-pET28a-PEDVS y BL21-pET28a OMP16-PEDVS se cultivaron en caldo LB y se utilizó IPTG para cosechar pET28a-PEDVS y pET28a-OMP{{22} } Proteínas PEDVS. El vector en blanco se utilizó como control negativo. Después de la lisis celular y la centrifugación, se recogieron el sobrenadante y el sedimento. Luego, las proteínas diana se purificaron utilizando la columna de cromatografía de afinidad de níquel basada en el estudio anterior [24]. Mientras tanto, el sobrenadante cultural de la cepa recombinante pVE5523-OMP16-PEDVS de L. casei también se recogió mediante centrifugación a 9000 xg durante 10 minutos a 4 grados. Después de lo cual, las muestras con tampón de carga de dodecilsulfato de sodio (SDS) se hirvieron durante 10 minutos. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 12% (SDS-PAGE) y luego se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Mississauga, ON, Canadá). Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% durante 2 h a 37 grados y luego se incubaron con anticuerpo monoclonal murino de proteína S durante la noche a 4 grados e IgG anti-ratón de cabra conjugada con HRP (ABclonal, Wuhan, China) durante 2 h a 37 grados. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando el sustrato de transferencia Clarity™ Western ECL (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.).

Vacunación y recogida de muestras.

La inmunogenicidad de la vacuna recombinante de Lactobacillus casei se evaluó utilizando ratones BALB/c hembra libres de patógenos específicos (SPF) de seis semanas de edad [10, 18], adquiridos en el centro de animales de la Universidad Agrícola de Shandong. Un total de 50 ratones se dividieron aleatoriamente en 5 grupos con 10 ratones en cada grupo. Los ratones fueron inmunizados con vacuna recombinante de Lactobacillus casei y proteína purificada (pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS+adyuvante completo de Freund), respectivamente. El protocolo de inmunización se realizó con base en la Tabla 2 y se administró una inmunización de refuerzo después de 13 días. Para el estudio serológico, se recogió suero los días 0, 14 y 28 después de la inmunización (dpi) mediante perforación en la vena de la cola y se almacenó a -20 grados hasta su uso. Las heces se recogieron 1 día antes de la vacunación y en cada momento de refuerzo. Para la detección de IgA, las heces se diluyeron (p/v) con EDTA sódico 0,05 M en proporciones de 1:4 justo después de la recolección y se incubaron durante 14 h a 4 grados después de una mezcla adecuada. El sobrenadante se recogió mediante centrifugación a 12,000 xg y se conservó a -20 grados hasta su uso. A 28 ppp; Se sacrificaron tres ratones de cada grupo y se procesó el intestino para la detección de IgA según lo descrito anteriormente por el autor [10, 18, 23].

Análisis de determinación de niveles de anticuerpos.

Los niveles de IgG en el suero y de IgA en las heces se midieron mediante métodos ELISA con algunas modificaciones [18, 23]. Los métodos fueron los siguientes: se recubrieron placas de microtitulación de poliestireno durante la noche a 4 grados con 100 μl de proteína PEDVS de 10 ug/ml, proteína OMP16-PEDVS o 100 μl de cepa recombinante de L. casei-OMP16-PEDVS. . Después de bloquear con leche desnatada al 5%, las muestras recolectadas se diluyeron en serie en PBS, se agregaron por triplicado y se incubaron a 37 grados durante 1 h. Luego, se añadió a cada pocillo (1:5000) un anticuerpo IgG o IgA anti-ratón de cabra conjugado con HRP (Invi trogen, EE. UU.) y se incubó durante 1 hora a 37 grados. Las placas de microtitulación de poliestireno se lavaron 5 veces durante cada paso. Por último, se agregaron 100 μL de sustrato TMB (tetrametilbencidina y H2O2) a cada pocillo y se agregaron 50 μL de solución de parada después de 10 minutos. Los valores de DO a 630 nm se midieron utilizando un lector de placas multimodo (EnVision).

Ensayos de neutralización de virus.

Los títulos de anticuerpos neutralizantes de PEDV en sueros se examinaron según los métodos con algunas modificaciones [25, 26]. Brevemente, el suero murino se inactivó por calor (56 grados durante 30 minutos) y luego se diluyó en serie dos veces en placas de 96 pocillos (Corning, EE. UU.) con triplicados de cada muestra. Luego, se añadió un volumen igual de 200 cepas TCID50/50 μL de PEDV a placas de 96 pocillos y se incubaron durante 1 hora a 37 grados. La mezcla se añadió a nuevas placas de 96 pocillos recubiertas con monocapas de células Vero y se incubó durante 1 hora a 37 grados. Luego las células se lavaron y se incubaron en el medio de mantenimiento a 37 grados en CO2 al 5%. Después de 2 días, se observó el efecto citopático (CPE) utilizando un microscopio invertido y la concentración de tamaño neutro se definió como la concentración más baja de anticuerpos en el suero.

Tabla 2 El protocolo inmunológico de ratones BALB/c

Detección de citocinas

Para detectar la secreción de citocinas, se obtuvieron sobrenadantes de los ratones de laboratorio (0, 14 y 28 días). Los niveles de IL-4, IL-10 e IFN- secretados se determinaron utilizando kits ELISA comerciales (Elabscience Biotechnology Co., Ltd., Wuhan) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, respectivamente. Las citocinas se cuantificaron a partir de las diferentes curvas estándar preparadas a partir de reactivos estándar proporcionados por los kits, respectivamente, y el valor de la densidad óptica (OD) se detectó a 450 nm de cada placa utilizando un lector de placas multimodo (EnVision) [23, 27].

análisis estadístico

Todos los datos se obtuvieron de al menos tres experimentos independientes y los resultados se presentaron como medias ± desviación estándar (DE). El análisis estadístico se realizó mediante pruebas t de dos colas y análisis unidireccional en Graph Pad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., EE. UU.). La diferencia significativa se definió como ∗ p < 0.05, y los distintos grados de diferencia significativa se designaron como ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗ y p < 0,001, respectivamente.

Resultados

La verificación de cepas recombinantes de Lactobacillus casei y BL21.

Para verificar los plásmidos recombinantes construidos, los plásmidos de expresión recombinantes pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS y pVE5523-OMP16-PEDVS se digirieron usando enzimas de restricción NcoI/XhoI, y los Los resultados de la digestión enzimática se muestran en la Fig. 1. Los tamaños de las bandas diana en los electroforetogramas fueron los mismos que los resultados esperados y los resultados de la secuenciación indicaron que los plásmidos de expresión recombinantes no exhibieron mutación. Estos resultados indicaron la construcción exitosa de los plásmidos recombinantes pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS y pVE5523-OMP16-PEDVS. Los resultados de la transferencia Western mostraron que las proteínas recombinantes pET28a-OMP16-PEDVS y pET28a-PEDVS se expresaron en el sobrenadante de BL21-pET28a OMP16-PEDVS y BL21- Cepas pET28a-PEDVS, respectivamente. La proteína pVE5523-OMP16-PEDVS también se verificó en el sobrenadante de cultivo de la cepa L. casei-pVE5523-OMP16-PEDVS. Las bandas específicas de la Fig. 2 mostraron que las proteínas recombinantes pET28a-OMP16- PEDVS, pVE5523-OMP16-PEDVS y pET28a-PEDVS se recolectaron con éxito (Fig. 2).

Fig. 1 Los resultados de la digestión enzimática de plásmidos recombinantes. R: Los resultados de la digestión enzimática del plásmido pVE5523-OMP16-PEDVS. M: Marcador de escalera de ADN D8000; 1: plásmido pVE5523-OMP16-PEDVS. B: Los resultados de la digestión enzimática del plásmido pet28a-OMP16-PEDVS y pET28a-PEDVS. M: Marcador de escalera de ADN D8000; 1: plásmido pet28a-OMP16-PEDVS; 2: plásmido pET28a-PEDVS

Los niveles de anticuerpos IgG en el suero de ratones inmunizados con vacunas candidatas

Para evaluar la inmunogenicidad específica de las vacunas candidatas generadas, se seleccionaron ratones BALB/c y se dividieron en 5 grupos. Luego, se midieron los niveles de IgG en suero e IgA en heces con kits ELISA comerciales. Los resultados revelaron que no hubo diferencias sustanciales en los niveles de IgG entre los grupos vacunados y casi no se encontraron anticuerpos IgG en todos los ratones antes de la inmunización. Sin embargo, posteriormente se encontraron diferencias sustanciales después de la primera vacunación y los niveles de anticuerpos IgG en suero a los 28 días eran más altos que a los 14 días. Entre los ratones del 5 grupo, los ratones inmunizados con L. casei-OMP16- PEDVS y BL21-OMP16-PEDVS-F mostraron una inmunogenicidad similar y más alta. Por lo tanto, L. casei-OMP16- PEDVS y BL21-OMP16-PEDVS-F podrían producir la mayor inmunogenicidad, seguidos de BL21-OMP16- PEDVS. y BL21-PEDVS (Fig. 3).

Beneficios del suplemento cistanche: aumentar la inmunidad.

Haga clic aquí para ver los productos Cistanche Enhance Immunity

【Pregunte por más】 Correo electrónico:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Los niveles de anticuerpos IgA en heces de ratones inmunizados con vacunas candidatas

Para evaluar la inmunogenicidad específica de las vacunas candidatas generadas, también se evaluaron los niveles de anticuerpos IgA en las heces de ratones. Los resultados mostraron que no existía ningún anticuerpo IgA anti-PEDVS especial antes de la inmunización. Sin embargo, se encontraron grandes cantidades de anticuerpos IgA en las heces de ratones inmunizados con L. casei-OMP16-PEDVS BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{7} Ratones del grupo }PEDVS y BL21-PEDVS 14 días después de la inmunización. 28 días después de la inmunización, los niveles de anticuerpos IgA de los ratones inmunizados con L. casei-OMP16-PEDVS alcanzaron su máximo máximo. Mientras tanto, los niveles de anticuerpos IgA en los otros tres grupos no presentaron un aumento evidente. Por lo tanto, la vacuna candidata L. casei OMP16-PEDVS podría estimular niveles más altos de anticuerpos en ratones inmunizados en comparación con BL21- OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{ Ratones inmunizados con {18}}PEDVS y BL21- PEDVS (Fig. 4).

Fig. 2 La verificación de proteínas de expresión recombinantes. M: marcador proteico; 1: la proteína secretora de la cepa recombinante pVE5523-OMP16-PEDVS de L. casei; 2: la proteína purificada de la cepa BL21-pET28a-OMP16-PEDVS; 3: la proteína purificada de la cepa BL21-pET28a-PEDVS

Los niveles de anticuerpos neutralizantes del suero en ratones inmunizados.

Evaluar el efecto protector de las vacunas candidatas de L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS y BL21-PEDVS en ratones, se midieron los niveles de anticuerpos neutralizantes. Los resultados mostraron que no se detectó ningún anticuerpo neutralizante antes de la inmunización. El anticuerpo neutralizante se detectó a los 14 días después de la inmunización y aumentó a los 14 días después de la inmunización de refuerzo. La respuesta de anticuerpos en ratones que recibieron L. casei-OMP16-PEDVS poseía una actividad neutralizante anti-PEDV más fuerte que la de ratones a los que se administró por vía oral BL21-OMP16-PEDVS-F, BL 21-OMP16-PEDVS y BL21-PEDVS. Por lo tanto, la vacuna candidata L. casei OMP16-PEDVS podría estimular el nivel más alto de anticuerpos neutralizantes, seguida de BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP{{ 24}}PEDVS y BL21-PEDVS (Fig. 5).

Niveles de citoquinas

Para comparar el nivel de respuesta inmune celular de L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS, y ratones inmunizados con BL21-PEDVS, IL- 4, IL-10 e IFN-, respectivamente. Los resultados mostraron que los niveles de citoquinas IL-4, IL-10 e IFN- en el suero de los ratones eran todos muy bajos y no tenían diferencias significativas antes de la inmunización. Mientras que se observaron cambios similares en los resultados de IL-4, IL-10 e IFN-. 14 días después de la inmunización, el nivel de IL-4, IL-10 e IFN- en ratones inmunizados con L. casei-OMP16-PEDVS fue mayor que el de BL21- Ratones inmunizados con OMP16-PEDVS F, BL21-OMP16-PEDVS y BL21-PEDVS. 14 días después de la inmunización de refuerzo, se detectó un nivel más alto de IL-4, IL-10 e IFN- en ratones inmunizados con L. casei-OMP16- PEDVS en comparación con los de otros tres grupos. Por lo tanto, la vacuna candidata L. casei-OMP16-PEDVS podría estimular los niveles más altos de IL-4, IL-10 e IFN-, seguida de BL21-OMP{{ 40}} PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS y BL21-PEDVS (Fig. 6).

Fig. 3 Niveles de anticuerpos IgG de vacunas candidatas en el suero de ratones inmunizados. Se recogió suero los días 0, 14 y 28 días antes o después de la inmunización, se examinó mediante kits ELISA comerciales y se midió a una absorbancia de 450 nm. Las barras representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * p < 0.05, ** p < 0,01 y **** p < 0,0001 representan grados crecientes de diferencias significativas, respectivamente, y ns significa que no hay diferencias significativas

Discusión

En octubre de 2010 se produjo un brote a gran escala de PED causado por variantes del PEDV, que ha provocado enormes pérdidas económicas en China y en todo el mundo [1]. Sin embargo, todas las vacunas tradicionales están diseñadas en base a la cepa clásica CV777, que no puede proporcionar suficiente protección a la variante PEDV [4]. Para controlar la propagación del PEDV y reducir las pérdidas económicas, también se diseñan nuevas vacunas de cepas variantes del PEDV. En la actualidad, la vacuna inactivada de PEDV y la vacuna atenuada de cepas variantes de PEDV están aprobadas por el gobierno chino y todas ellas muestran perspectivas prometedoras en el control de PED. Pero también existen defectos en los dos tipos de nuevas vacunas. PEDV infecta a los cerdos a través del tracto digestivo y tiene tropismo en el tejido intestinal. Por lo tanto, la inmunidad de las mucosas es más eficaz que la inmunidad sistémica para prevenir la entrada del PEDV en las células epiteliales intestinales, y las vacunas deben proporcionar una protección de las mucosas eficaz en el tracto intestinal. Entonces, en este estudio, construimos un nuevo tipo de vacuna que puede estimular anticuerpos IgG e IgA específicos contra PEDV más potentes. Lactobacillus casei tiene posibles propiedades inmunomoduladoras como vehículo de administración de vacunas y la expresión de compuestos bioactivos en la pared celular de esta bacteria puede estimular respuestas inmunes apropiadas [28, 29]. Se utiliza ampliamente para expresar varios antígenos heterólogos del virus del papiloma humano, Streptococcus pneumonia y Escherichia coli como vacunas en modelos animales, y todos mostraron una excelente inmunogenicidad [7-9]. En comparación con la vacuna inactivada y la vacuna atenuada, la vacuna de vector Lactobacillus casei también puede estimular niveles más altos de IgA y una respuesta inmune celular. Los estudios han demostrado que la primera línea de defensa de la IgA en el intestino sería mejor que la IgG para proteger a los lechones de la infección por PEDV [10, 30]. Por lo tanto, es prometedor desarrollar un tipo de vacuna vectorial de Lactobacillus casei contra la DEP. Según los informes, la proteína S del PEDV se puede dividir en dominios S1 (1–735 aminoácidos) y S2 (736-último aminoácido) [13], y la proteína S1 incluye la región de unión al receptor y la región de unión al receptor. principales epítopos neutralizantes [14]. El epítopo neutralizante central (COE) puede inducir fuertes anticuerpos neutralizantes contra PEDV [31, 32]. Combinado con el análisis de antigenicidad, se seleccionó una secuencia parcial del gen S1 (1477–2124 pb) para construir el plásmido recombinante. Se demostró que el pequeño fragmento seleccionado no sólo tiene una buena inmunogenicidad sino que también contribuye a la expresión secretada de Lactobacillus casei. Por otro lado, Pasquevich descubrió que la proteína 16 de la membrana externa de Brucella abortus podía activar las células dendríticas in vivo, inducir una respuesta inmune th1 y era una vacuna autoadyuvada prometedora contra la brucelosis adquirida sistémica y oral [15]. Investigaciones similares que demostraron que la proteína de membrana externa no lipidada omp16 de Brucella spp. También se demostró que un adyuvante nasal podría inducir una respuesta inmune th1 y modular la respuesta alérgica th2 a las proteínas de la leche de vaca [16]. Por lo tanto, se eligió una secuencia parcial del gen omp16 para construir un plásmido recombinante para mejorar la función inmune en nuestro estudio. Para saber si la nueva vacuna recomendada por Lactobacillus casei podría inducir respuestas inmunitarias humorales, se midieron los niveles de IgG, IgA y anticuerpos neutralizantes. El nivel de anticuerpos IgG de los ratones inmunizados con la vacuna recombinante L. casei-OMP16- PEDVS no tuvo diferencias significativas con los ratones inmunizados con la vacuna recombinante BL21-OMP16-PEDVS-F. Sin embargo, los niveles de IgA y anticuerpos neutralizantes fueron más altos que los de BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDV S y BL{{47 }}Ratones vacunados con PEDVS recombinante. Los resultados mostraron que L. casei-OMP16-PEDVS podría inducir respuestas inmunes humorales más fuertes, especialmente niveles de anticuerpos IgA. Los estudios han demostrado que la IgA es la primera línea de defensa en el intestino y sería mejor que la IgG para proteger a los lechones de la infección por PEDV [30]. La investigación también verificó el resultado de que la vacuna recombinante L. casei-OMP16-PEDVS podría proporcionar una mejor protección inmunológica contra PEDV. Para explorar el tipo de respuesta inmune inducida por L. casei-OMP16-PEDVS recombinante, se detectaron los niveles de IL-4, IL-10 e IFN- para evaluar la actividad de T linfocitos. Según el informe, el IFN- juega un papel importante en la respuesta inmune celular causada cuando los patógenos invaden el cuerpo, la IL-4 juega un papel importante en la respuesta inmune humoral y promueve la tolerancia inmune y la inmunidad de las mucosas [33], IL -10 desempeña funciones esenciales en la lucha contra la infección microbiana de las mucosas y en el mantenimiento de la integridad de la barrera mucosa dentro del intestino [34]. Mientras tanto, los resultados de la detección de citocinas mostraron que los ratones inmunizados con la vacuna recombinante L. casei-OMP16-PEDVS podrían inducir una expresión más fuerte de IL-4, IL-10 e IFN-, que respaldaron los resultados de que la vacuna recombinante L. casei-OMP16-PEDVS podría inducir una respuesta inmune humoral, un nivel de anticuerpos IgA y una respuesta inmune celular más fuertes, respectivamente.

Fig. 5 Los niveles de anticuerpos neutralizantes de las vacunas candidatas en el suero de ratones inmunizados. Se recogió suero los días 0, 14 y 28 días antes o después de la inmunización y se examinó mediante una prueba de neutralización. Las barras representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * p < 0.05, ** p < 0.01 y **** p < 0,0001 representan grados crecientes de diferencias significativas, respectivamente, y ns significa no significativo diferencia

Fig. 6 Detección de niveles de citoquinas del suero de ratones inmunizados. Se recogió suero los días 0, 14 y 28 días antes o después de la inmunización y se examinó mediante kits ELISA comerciales. El valor de absorbancia se midió a una absorbancia de 450 nm para IL-4 (a), IL-10 (b) e IFN- (c), respectivamente. Las barras representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * p < {{10}}.05, ** p < 0,01 y **** p < 0,0001 representan grados crecientes de diferencias significativas, respectivamente

Conclusión

En resumen, L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16- PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS y BL{{7 }}En este estudio se construyeron vacunas candidatas a PEDVS. Mientras tanto, se evaluaron los niveles de respuesta inmune humoral y celular de estas vacunas candidatas en ratones. Los resultados mostraron que los ratones inmunizados con L. casei-OMP16-PEDVS podrían producir niveles más altos de IgG, IgA, anticuerpos neutralizantes, IL-4, IL- 10 e INF- en comparación con los ratones inmunizados con BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS y BL21-PEDVS. Por lo tanto, la vacuna candidata recombinante OMP16-PEDVS de L. casei puede sentar las bases para el desarrollo de una vacuna mucosa recombinante segura, eficaz y conveniente para la profilaxis de la infección por PEDV.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

Referencias

1. Wang D, Fang L, S X. Diarrea epidémica porcina en China. Resolución de virus. 2016; 226:7–13.

2. Sueyoshi M, Tsuda T, Yamazaki K, Yoshida K, Nakazawa M, Sato K, et al. Una investigación inmunohistoquímica de la diarrea epidémica porcina. J Comp Pathol. 1995;113(1):59–67.

3. Sun RQ, Cai RJ, Chen YQ, Liang PS, Song CXJEID. El brote de diarrea epidémica porcina en lechones lactantes, China. Enfermedad infecciosa emergente. 2012; 18(1):161–3.

4. Tong YE, Feng L, Li W. Desarrollo de una vacuna atenuada bicombinada contra el virus de la gastroenteritis transmisible y el virus de la diarrea epidémica porcina. Chin J Prev Vet Med. 1999;21(6):35–9.

5. Pouwels PH, Leer RJ, Boersma WJ. El potencial de Lactobacillus como portador de inmunización oral: desarrollo y caracterización preliminar de sistemas de vectores para la administración dirigida de antígenos. J Biotecnología. 1996;44(1–3):183.

6. Tsai YT, Cheng PC, Pan TM. Biotecnología: Los efectos inmunomoduladores de las bacterias del ácido láctico para mejorar las funciones y beneficios inmunológicos. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;96(4):853–62.

7. Adachi K, Kawana K, Yokoyama T, Fujii T, Tomio A, Miura S, et al. La inmunización oral con una vacuna de Lactobacillus casei que expresa el virus del papiloma humano (VPH) tipo 16 E7 es una estrategia eficaz para inducir linfocitos citotóxicos de las mucosas contra el VPH16 E7. Vacuna. 2010;28(16):2810–7.

8. Campos IB, Darrieux M, Ferreira DM, Miyaji EN, Silva DA, Arêas APM, et al. Inmunización nasal de ratones con Lactobacillus casei que expresa la proteína de superficie neumocócica A: inducción de anticuerpos, depósito de complemento y protección parcial contra la exposición a Streptococcus pneumoniae. Los microbios infectan. 2008;10(5):481–8.

9. Wen LJ, Hou XL, Wang GH, Yu LY, Wei XM, Liu JK, et al. La inmunización con cepas recombinantes de Lactobacillus casei que producen proteínas fimbriales K99 y K88 protege a los ratones contra Escherichia coli enterotoxigénica. Vacuna. 2012;30(22): 3339–49.

10. Guo M, Yi S, Guo Y, Zhang S, Niu J, Wang K, et al. Construcción de una cepa recombinante de Lactococcus lactis que expresa una variante del gen S1 del virus de la diarrea epidémica porcina y su análisis de inmunogenicidad en ratones. Inmunol viral. 2019;32(3):144–50.

11. Wang X, Wang L, Zheng D. Inmunización oral con una vacuna contra el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) basada en Lactobacillus casei que expresa el péptido Co1 microfold dirigido a células fusionado con el antígeno COE de PEDV. J Appl Microbiol. 2017;124(2):368–78.

12. Duarte M, Tobler K, Bridgen A, Rasschaert D, Ackermann M, H L. El análisis de secuencia del genoma del virus de la diarrea epidémica porcina entre los genes de la nucleocápside y la proteína de pico revela un ORF polimórfico. Virología. 1994;198(2):466.

13. Lee DK, Park CK, Kim SH, Lee C. Heterogeneidad en los genes de la proteína de pico de los virus de la diarrea epidémica porcina aislados en Corea. Resolución de virus. 2010;149(2): 175–82.

14. Sun DB, Feng L, Shi HY, Chen JF, Liu SW, Chen HY, et al. La región de la proteína de pico (aa 636789) del virus de la diarrea epidémica porcina es esencial para la inducción de anticuerpos neutralizantes. Acta Virol. 2007;51(3):149–56.

15. Pasquevich KA, García Samartino C, Coria LM, Estein SM, Zwerdling A, Ibáñez AE, et al. El resto proteico de la proteína 16 de la membrana externa de Brucella abortus es un nuevo patrón molecular asociado a patógenos bacterianos que activa las células dendríticas in vivo, induce una respuesta inmune Th1 y es una vacuna autoadyuvante prometedora contra la brucelosis adquirida sistémica y oral. J Inmunol. 2010;184(9):5200.

16. Ibáñez AE, Smaldini P, Coria LM, Delpino MV, Pacífico LGG, Oliveira SC, et al. Proteína de membrana externa no liquidada Omp16 (U-Omp16) de Brucella spp. como adyuvante nasal induce una respuesta inmune Th1 y modula la respuesta alérgica Th2 a las proteínas de la leche de vaca. Más uno. 2013;8(7):e69438.

17. Pasquevich KA, Estein SM, Samartino CG, Zwerdling A, Coria LM, Barrionuevo P, et al. Inmunidad: La inmunización con la proteína recombinante de la membrana externa de la especie Brucella Omp16 u Omp19 en adyuvante induce células T CD4+ y CD8+ específicas, así como protección sistémica y oral contra la infección por Brucella abortus. Infectar inmune. 2009;77(1):436–45.

18. Ma S, Wang L, Huang X, Wang X, Chen S, Shi W, et al. Vacuna oral recombinante de Lactobacillus dirigida a las células del micropliegue intestinal y las células dendríticas para administrar el epítopo neutralizante central del virus de la diarrea epidémica porcina. Fábricas de células microbianas. 2018;17(1):20.

19. Chu S, Zhang D, Wang D, Zhi Y, Zhou P. La expresión heteróloga y la caracterización bioquímica del nitrato asimilatorio y la nitrito reductasa revela la adaptación y el potencial de Bacillus megaterium NCT-2 en suelos de salinización secundaria. Int J Biol Macromol. 2017;101:1019.

20. Guo N, Zhang B, Hu H, Ye S, Chen F, Li Z, et al. Caerin1.1 suprime el crecimiento del virus de la diarrea epidémica porcina in vitro mediante unión directa al virus. Virus. 2018;10:9.

21. Chen Z, Lin J, Ma C, Zhao S, She Q, Liang Y. Biotecnología: caracterización de pMC11, un plásmido con orígenes duales de replicación aislado de Lactobacillus casei MCJ y construcción de vectores lanzadera con cada replicón. Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98(13):5977.

22. Xiaona W, Li W, Xuewei H, Sunting M, Meiling Y, Wen S, et al. Administración oral de probióticos que expresan un péptido dirigido a células dendríticas fusionados con el antígeno COE del virus de la diarrea epidémica porcina: una estrategia de vacuna prometedora contra el PEDV. Virus. 2017;9(11):312.

23. Bhuyan AA, Memon AM, Bhuiyan AA, Zhonghua L, Zhang B, Ye S, et al. La construcción de Lactobacillus casei recombinante que expresa la proteína BVDV E2 y su respuesta inmune en ratones. J Biotecnología. 2018;270:51–60.

24. Noi NV, Chung YCJB, Equipo B. Optimización de la expresión y purificación del dominio S1 recombinante de la proteína pico del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV-S1) en Escherichia coli. Biotecnología Equipos de biotecnología. 2017;31(2):1–11.

25. Li C, Li W, Esesarte E, Guo H, Elzen P, Aarts E, et al. Los dominios de unión celular de la proteína de pico del virus de la diarrea epidémica porcina son objetivos clave de los anticuerpos neutralizantes. J Virol. 2017;91(12):1–16.

26. Wen Z, Xu Z, Zhou Q, Li W, Wu Y, Du Y, et al. La administración oral de microesferas recubiertas cargadas con PEDV provocó inmunidad específica contra PEDV en lechones destetados. Vacuna. 2019;09(014):161–6.

27. Gao Q, Zhao S, Qin T, Yin Y, Yang Q. Efectos del virus de la diarrea epidémica porcina en células dendríticas derivadas de monocitos porcinos y células dendríticas intestinales. Microbiol veterinario. 2016;106:149–58.

28. Bonet MEB, Chaves AS, Mesón O. Actividad inmunomoduladora y antiinflamatoria inducida por la administración oral de una cepa probiótica de lactobacillus casei. Inflamación. 2006;4(1):31–41.

29. Grangette C, Müller-Alouf H, Geoffroy MC, Goudercourt D, Turner M, Mercenier A. Protección contra la toxina tetánica después de la administración intragástrica de dos bacterias de ácido láctico recombinantes: impacto de la viabilidad de la cepa y persistencia in vivo. Vacuna. 2002;20(27–28):3304–9.

30. Song DS, Oh JS, Kang BK, Yang JS, Moon HJ, Yoo HS, et al. Eficacia oral de la cepa DR13 del virus de la diarrea epidémica porcina atenuada con células Vero. Res Vet Sci. 2007;82(1):134–40.

31. Makadiya N, Brownlie R, Jan V, Berube N, Allan B, Gerdts V, et al. Dominio S1 de la proteína de pico del virus de la diarrea epidémica porcina como antígeno de vacuna. Virol J. 2016;13:1.

32. Chang SH, Bae JL, Kang TJ, Ju K, Chung GH, Lim CW, et al. Células: Identificación de la región del epítopo capaz de inducir anticuerpos neutralizantes contra el virus de la diarrea epidémica porcina. Celda Mol. 2002;14(2): 295–9.

33. Sumi T, Fukushima A, Fukuda K, Kumagai N, Nishida T, Yagita H, et al. Contribuciones diferenciales de B7–1 y B7–2 al desarrollo de la conjuntivitis alérgica experimental murina. Immunol Lett. 2007;108(1):62–7.

34. Xue M, Zhao J, Ying L, Fu F, Li L, Ma Y, et al. IL-22 suprime la infección de rotavirus y coronavirus entéricos porcinos activando la vía de señal STAT3. Res. Antivir. 2017;142:68–75.