La tirosina quinasa C-Abl potencia la inmunidad antiviral mediada por interferón mediante la fosforilación de STAT1

RESUMEN

La activación inducida por interferón (IFN) del transductor de señal y activador de la familia de transcripción (STAT) es un evento importante en la inmunidad antiviral. Aquí, mostramos que las quinasas no receptoras c-Abl y Arg interactúan directamente con STAT1 y potencian la fosforilación de STAT1 en Y701. c-Abl/Arg podría mediar la fosforilación de STAT1 independientemente de las Janus quinasas en ausencia de IFNg y potenciar la fosforilación de STAT1 mediada por IFNg. Además, la dimerización de STAT1, la translocación nuclear y la transcripción de genes posteriores están reguladas por c-Abl/Arg. La deficiencia de c-Abl/Arg (abl1/abl2) suprime significativamente las respuestas antivirales en las células infectadas por el virus de la estomatitis vesicular. En comparación con el vehículo, la administración del inhibidor selectivo de c-Abl/Arg AMN107 dio como resultado un aumento significativo de la mortalidad en ratones infectados con el virus de la influenza humana. Nuestro estudio demuestra que c-Abl desempeña un papel esencial en la vía de señalización de activación de STAT1 y proporciona un enfoque importante para la regulación de la inmunidad antiviral.

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INTRODUCCIÓN

Los interferones (IFN) desempeñan funciones clave en la inmunidad innata contra la infección viral y la vigilancia inmunitaria al regular la activación de las Janus quinasas (JAK) y el transductor de señales y activador de la transcripción (STAT) y al reprogramar la expresión de genes celulares (Stark y Darnell, 2012). La unión de IFN a sus respectivos receptores da como resultado la fosforilación cruzada de tres JAK asociadas (JAK1, JAK2 y TYK2) y el reclutamiento de STAT, lo que permite que las JAK fosforilen residuos de tirosina individuales cerca de los extremos C-terminales de estos STAT. (Platanias, 2005). Las STAT activadas luego se dimerizan, migran al núcleo y se unen a los promotores de genes que responden a IFN para inducir su transcripción. La fosforilación de tirosina de STAT es un paso esencial en la vía JAK-STAT de señalización de IFN y está involucrada en la dimerización de STAT, la translocación nuclear y la unión al ADN (Stark y Darnell, 2012). Por tanto, la fosforilación de tirosina funciona como un interruptor de activación STAT. La evidencia obtenida mediante la alteración dirigida de los genes JAK en ratones sugiere que las JAK son las tirosina quinasas STAT más importantes (Villarino et al., 2017). Sin embargo, también se ha demostrado que los residuos de tirosina en STAT1, STAT3 y STAT5 están fosforilados en células con deficiencia de JAK por el factor de crecimiento epidérmico y los receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas con actividad tirosina quinasa intrínseca (Leaman et al., 1996; Vignais et al. ., 1996). Además, se ha observado activación constitutiva de STAT en células transformadas que expresan tirosina quinasas oncogénicas como v-Src, v-Abl y BCR-Abl, pero aún está por determinar si las STAT son los sustratos directos de estas quinasas (Danial y Rothman , 2000; Reddy et al., 2000). La quinasa Abelson c-Abl de mamífero codificada por el gen c-abl (abl1) y la proteína del gen relacionado con Abl Arg codificada por el gen arg (abl2) son miembros de una familia de tirosina quinasas intracelulares no receptoras que se requieren para múltiples procesos celulares. incluyendo proliferación, apoptosis, adhesión, migración celular y respuestas al estrés (Bradley y Koleske, 2009; Colicelli, 2010; Greuber et al., 2013; Pendergast, 2002). La actividad quinasa de c-Abl está estrechamente regulada en condiciones fisiológicas normales. Los eventos de transducción retroviral y translocación cromosómica dan lugar a la expresión de v-Abl o BCR-Abl, una forma oncogénica de Abl, respectivamente (Advani y Pendergast, 2002). Además, la eliminación dirigida del gen c-abl en ratones produce fenotipos pleiotrópicos asociados con disfunción inmune, incluyendo alta letalidad perinatal, atrofia esplénica y tímica, linfopenia y mayor susceptibilidad a la infección (Schwartzberg et al., 1991). Además, el tratamiento de la leucemia mieloide crónica (LMC) positiva para BCR-Abl con los inhibidores de Abl STI571 (imatinib) y AMN107 (nilotinib) se asocia con inmunosupresión en un subconjunto de pacientes (Dietz et al., 2004; Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi et al., 2003). Estudios anteriores han demostrado que cAbl desempeña un papel en la regulación de la transducción de señales, el desarrollo, la proliferación y la producción de citocinas mediadas por TCR (receptor de células T) y BCR (receptor de células B) (Gu et al., 2009; Pendergast, 2002). ; Silberman et al., 2008). Los ratones con deficiencia de Abl también exhiben un número reducido de células T/B (Gu et al., 2009; Liberatore y Goff, 2009; Schwartzberg et al., 1991). Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la inmunidad deteriorada que surge en ausencia o inhibición de c-Abl siguen siendo difíciles de alcanzar. Se ha informado ampliamente que la vía de señalización JAK-STAT es esencial para la transformación inducida por BCR-Abl (Carlesso et al., 1996; Danial et al., 1998; de Groot et al., 1999). Por lo tanto, vale la pena investigar si JAK-STAT también puede contribuir a la inmunidad innata involucrada con c-Abl. Aquí, informamos que STAT1 interactúa con c-Abl y es fosforilado por él de una manera independiente de JAK, mediante la cual se regulan la dimerización, la localización nuclear y la transcripción genética de STAT1. Estos hallazgos revelaron que, además de la quinasa JAK, c-Abl es indispensable para la activación completa de STAT1 y las respuestas antivirales mediadas por IFN posteriores.

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RESULTADOS

La transcripción de la secuencia de genes activada por interferón gamma está regulada por la quinasa Abl

Our previous study suggested that c-Abl widely participates in the regulation of gene transcription (Dong et al., 2017). To illustrate the role of c-Abl in gene expression, the transcription of approximately 22,000 genes in wild-type (WT) and c-abl / arg / MEFs (mouse embryonic fibroblasts) was detected using Affymetrix GeneChips (Mouse Genome 430 2.0) (GEO accession: GSE154568). A total of 1,744 differentially expressed genes (DEGs) with fold changes >Se identificaron 4 en c-abl/arg double-knockout (DKO) y WT MEF, de los cuales 960 estaban regulados al alza y 784 a la baja (Figura 1A, izquierda). Para investigar más a fondo las posibles funciones celulares y las vías asociadas de estos DEG, realizamos un análisis de ontología genética (GO) (para términos del proceso biológico, función molecular y componente celular) (Figura S1A). Los genes regulados negativamente por c-Abl y Arg se asociaron principalmente con respuestas de defensa contra virus (GO: 0009615, GO: 0051607 y GO: 0045071) y respuestas inmunes (GO: 0002376, GO: 0045087). Un análisis más detallado mostró que los genes específicos de IFN (Liu et al., 2012) se enriquecieron entre los genes regulados negativamente (Figuras 1A, derecha y S1B). Para validar los perfiles de expresión diferencial, los niveles de transcripción de genes antivirales, incluidos cxcl10, psmb9, tap1 e isg15, se determinaron mediante ensayos cuantitativos de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) en tiempo real y se normalizaron a los niveles de psma5. , que no está altamente regulado por c-Abl. En comparación con los MEF WT, los c-abl/arg/MEF exhibieron niveles de transcripción significativamente más bajos de estos genes, pero las reducciones inducidas por DKO se revirtieron completamente mediante el rescate de c-Abl de una manera dependiente de la dosis (Figuras 1B y S1C). Estos datos sugirieron que un panel de genes inducidos por IFN estaba regulado por c-Abl y Arg. Para investigar los elementos transcripcionales clave regulados por las Abl quinasas en respuesta al IFN, se construyó un sistema indicador de luciferasa basado en el promotor bidireccional compartido tap1/psmb9 regulado por IFNg (Figura 1C). Como se esperaba, el inhibidor selectivo de c-Abl/Arg AMN107 inhibió significativamente la actividad transcripcional del promotor tap1 (rojo) (Figura 1D). En particular, a diferencia de la eliminación de los elementos que actúan sobre NFkB (azul) o de la secuencia consenso de IFN (amarillo), el tratamiento con AMN107 tuvo poco o ningún efecto sobre la actividad del promotor tap1 cuando se eliminó el elemento de la secuencia activada por gamma (GAS) (verde) (Figura 1D ). Estos hallazgos indican que el elemento cis GAS dirigido a STAT1-está involucrado en la transcripción tap1 regulada por c-Abl, lo que sugiere fuertemente que STAT1 es responsable de la regulación mediada por c-Abl de la expresión génica que responde a IFN.

c-Abl interactúa directamente con STAT1

La expresión de TAP1 inducida por IFN está regulada por c-Abl, posiblemente a través de STAT1, lo que sugiere que STAT1 puede estar asociado con c-Abl. Para confirmar esta hipótesis, los lisados ​​de células MCF-7 se sometieron a inmunoprecipitación anti-c-Abl seguida de inmunotransferencia con un anticuerpo anti-STAT1. STAT1 estaba presente en anti-c-Abl pero no en inmunoprecipitados de IgG (Figura 2A). A continuación, se cotransfectaron células 293T con Myc-cAbl y Flag-STAT1 o Flag-Vector como control. La presencia de Myc-c-Abl en inmunoprecipitados anti-Flag preparados a partir de células que coexpresan Flag-STAT1 pero no Flag-Vector mostró una asociación entre Myc-c-Abl expresado ectópicamente y Flag-STAT1 (Figura 2B, izquierda). También se obtuvo un resultado similar en un experimento recíproco (Figura 2B, derecha). Además, el otro miembro de la familia Abl, Arg (Abl2), que es altamente homólogo a c-Abl en su dominio N-terminal (NTD), también interactuó con STAT1 (Figura S2A).

Figura 1. c-Abl regula los promotores de genes que responden a IFN a través de elementos GAS

A continuación, los lisados ​​preparados a partir de células 293T que expresan Flag-c-Abl se incubaron con GST-STAT1 conjugado con agarosa o GST solo, y se detectó Flag-c-Abl en GST-STAT1 pero no en los adsorbatos de GST (Figura 2C). Para descartar la unión indirecta mediada por otros componentes en los lisados ​​celulares, los inmunoprecipitados anti-Flag preparados a partir de células 293T que expresan Flag-c-Abl se sometieron a SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio) y las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno) y luego se secó con GST-STAT1 o GST soluble (como control). Los resultados mostraron que GST-STAT1, pero no GST, se unía a c-Abl directamente in vitro (Figura 2D). Para definir el dominio de unión a c-Abl, se incubaron STAT1 de longitud completa o truncado conjugados con agarosa y fusionados con GST (Figura 2E, panel superior) con los lisados ​​de células 293T que expresan Flag-c-Abl. El análisis de los adsorbatos mediante inmunotransferencia con un anticuerpo anti-Flag demostró que los aminoácidos 577–750 de STAT1, que componen una región que contiene el dominio SH2 y el dominio de transactivación, fueron responsables de la interacción c-Abl (Figura 2E, panel inferior) . De manera similar, Flag-STAT1 inmunoprecipitado por el anticuerpo anti-Flag se fraccionó mediante SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de PVDF. Luego, la membrana se secó con GST-c-Abl SH3 o GST-c-Abl SH2 soluble y solo GST. El resultado mostró que el dominio c-Abl SH3 era el principal dominio responsable de la asociación STAT1 (Figura 2F). Además, la interacción in situ de c-Abl endógeno con STAT1 se evaluó mediante el ensayo de ligadura de proximidad Duolink (PLA). Los complejos STAT1:c-Abl se observaron principalmente en el citoplasma, y ​​la formación de estos complejos se potenció sustancialmente mediante la estimulación con IFNg (Figura 2G). En conjunto, estos hallazgos demuestran una asociación directa entre c-Abl y STAT1 tanto in vitro como in vivo.

Figura 2. c-Abl interactúa con STAT1

c-Abl media la fosforilación de STAT1 independiente de JAK

Para investigar si STAT1 es un sustrato de c-Abl, se incubó STAT1 purificado marcado con His con c-Abl recombinante (que contiene el dominio catalítico en los aminoácidos 237–643) en presencia de ATP para un ensayo de quinasa in vitro. La inmunotransferencia del producto de reacción con anti-fosfo-tirosina y anti-fosfo-STAT1 Y701 demostró que STAT1 fue fosforilado directamente por c-Abl en los residuos de tirosina, incluido Y701, in vitro (Figura 3A). A continuación, encontramos que Flag-STAT1 expresado en células 293T estaba fosforilado en tirosina, especialmente en el residuo Y701, por Myc-c-Abl pero no por el mutante inactivo de quinasa Myc-c-Abl (K290R). Además, tras el tratamiento con el inhibidor selectivo de c-Abl/Arg AMN107, la fosforilación de STAT1 mediada por c-Abl casi se eliminó, lo que indica que la fosforilación de tirosina de STAT1 depende de la actividad de la quinasa c-Abl (Figura 3B). La fosforilación de STAT1 mediada por c-Abl se vio sustancialmente afectada cuando STAT1 Y701 se sustituyó con fenilalanina, lo que indica que Y701 es el fosfosito principal de Abl (Figura 3C). Además, STAT1 también fue fosforilado por Arg (Figura S2B). Para delinear aún más los residuos STAT1 específicos fosforilados por c-Abl, Flag-STAT1 coexpresado con Myc-c-Abl se sometió a cromatografía líquida junto con análisis de espectrometría de masas en tándem. Además del fosfosito STAT1 Y701, bien definido y funcionalmente importante (Schindler et al., 1992; Shuai et al., 1993), también se identificaron otros dos fosfositos, Y106 e Y665 (Figura S4A). En comparación con WT STAT1, los mutantes Y106F y Y701F mostraron una fosforilación de tirosina comprometida (Figura 3C). Sin embargo, la fosforilación de STAT1 Y701 no se vio afectada considerablemente por la fosforilación de Y106 e Y665, lo que indica que Y106 e Y665 pueden desempeñar funciones distintas (Figura S4B). En conjunto, estos hallazgos indican que los residuos de tirosina de STAT1, incluido el residuo Y701 informado anteriormente, pueden ser fosforilados por quinasas de la familia Abl.

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Las JAK son las principales responsables de la fosforilación de STAT1 Y701 inducida por IFN (Villarino et al., 2017). Como se esperaba, la fosforilación de STAT1 Y701 fue inducida por IFNg y fue inhibida significativamente por ruxolitinib, un inhibidor biespecífico de JAK1 y JAK2 (Figura 3D). En particular, también se observó una fosforilación de Y701 comprometida tras la inhibición de Abl (Figura 3D, carril 4), lo que indica que c-Abl contribuye parcialmente a la activación de STAT1 inducida por IFNg. Además, la fosforilación de STAT1 Y701 también fue inducida por DPH, un activador de c-Abl permeable a las células, en menor medida que por IFNg, que podría revertirse por completo con AMN107 (Figura 3E). Para confirmar la activación de Abl inducida por DPH, también se detectó la fosforilación de c-Abl Y412, un indicador de la activación de Abl (Figura 3E). Se ha demostrado que la activación de JAK2 ocurre primero y es necesaria para la posterior activación de JAK1 (Briscoe et al., 1996). Para excluir el efecto de JAK2 en la activación de STAT1, establecimos una línea celular jak2-KO MCF-7 mediante CRISPR. Se observó una fosforilación de STAT1 Y701 disminuida pero detectable en células jak2-KO MCF-7 en comparación con la de las células MCF-7 parentales, que podría potenciarse de manera similar en presencia de Myc-c-Abl. pero no Myc-c-Abl (K290R) (Figura 3F) y disminuyó aún más después del tratamiento con AMN107. En células c-abl/arg/, la fosforilación de STAT1 inducida por IFNg en Y701 se vio muy comprometida de una manera dependiente del tiempo y la dosis (Figura 3G). Todas estas observaciones demuestran que la quinasa c-Abl podría fosforilar y activar directamente STAT1 independientemente de la vía de señalización IFNg-JAK y que, lo que es más importante, estas dos quinasas pueden tener efectos sinérgicos sobre la fosforilación de STAT1 en Y701.

Figura 3. STAT1 es fosforilado por c-Abl

Figura 4. c-Abl promueve la formación del dímero STAT1 y la importación nuclear

La fosforilación mediada por c-Abl regula la actividad de transactivación de STAT1

La fosforilación de tirosina de STAT es un paso esencial en la vía JAK-STAT de señalización de IFN y está implicada en la dimerización de STAT, la translocación nuclear y la unión al ADN. Para investigar si la fosforilación mediada por c-Abl regula la dimerización de STAT, se coexpresaron GFP-STAT1 y Flag-STAT1 en células 293T en presencia o ausencia de Myc-c-Abl. Se examinaron los niveles de GFP-STAT1 en inmunoprecipitados anti-Flag para indicar la dimerización de STAT1. Como se muestra en la Figura 4A, la coexpresión de c-Abl potenció la formación de homodímeros STAT1-STAT1. La microscopía de inmunofluorescencia de células MCF-7 demostró además que la ablación de c-abl/arg o el tratamiento con AMN107 alteraba significativamente la translocación nuclear de STAT1 inducida por IFNg (Figuras 4B y 4C).

Además, se emplearon ensayos de cambio de electromovilidad para analizar la actividad de unión al promotor de STAT1. Se utilizó como sonda de detección una región promotora de IRF1 marcada con biotina que contiene la secuencia consenso de unión a STAT1 (Aaronson y Horvath, 2002). Esta sonda se incubó con extractos nucleares de células 293T que expresaban exógenamente STAT1 con o sin c-Abl, que se equilibró según la Figura S5A. Como se muestra en la Figura 4D, se observaron numerosos complejos unidos a sonda IRF1 que contienen STAT1 en extractos nucleares (Figura 4D, carril 1). La formación de complejos aumentó ligeramente con el tratamiento con IFNg (Figura 4D, carril 2) y aumentó significativamente en células que expresan ectópicamente c-Abl (Figura 4D, carril 3). Sin embargo, en comparación con WT STAT1, c-Abl mostró poco o ningún efecto sobre la unión del promotor de STAT1 que alberga Y701F (Figura 4D, carriles 7 y 8), mientras que las mutaciones Y106F y Y665F casi no mostraron diferencias con WT STAT1. La especificidad de los complejos que contienen STAT1 y la sonda de detección se confirmó tras la adición de una sonda competidora sin etiquetar (Figura 4D, carril 9). Además, la adición de un anticuerpo anti STAT1 dio como resultado la formación de una banda superdesplazada (Figura 4D, carril 11). Cuando las sondas marcadas se incubaron con extractos nucleares de células 293T como control, no se observaron complejos (Figura 4D, carril 10). Estos resultados demuestran que la fosforilación de STAT1 Y701 mediada por c-Abl potencia la unión de STAT1 con sus promotores diana.

Figura 5. c-Abl regula la expresión génica relacionada con IFN

Luego, se evaluó la transactivación inducida por IFNg de los principales genes regulados por STAT1-, incluidos ccl5, cxcl10, cxcl11, gbp2, ido1, ifi35, irf1, isg15, oasl, psmb9 y tap1 en WT o c-abl/ arg DKO MCF-7 células mediante RT-PCR. Como se esperaba, la transcripción genética se vio significativamente afectada por el agotamiento de c-abl/arg (Figura 5A). Además, los genes típicamente inducidos por IFNg e IFNa no lograron ser estimulados por IFN en presencia de AMN107 (Figuras 5B y 5C). Estos hallazgos demuestran que la actividad de transactivación de STAT1 está regulada positivamente por c-Abl.

c-Abl promueve efectos antivirales dependientes de IFN

TAP1 y PSMB9 participan en la producción y presentación de péptidos en la vía de procesamiento del antígeno MHC de clase I (Ghannam et al., 2014; Vitale et al., 1998). De acuerdo con hallazgos anteriores, AMN107 suprimió significativamente la presentación del antígeno de ovoalbúmina por parte de las células JAWS II a las células B3Z debido a la producción reducida de IL2 (Figura 6A). Para evaluar más a fondo las consecuencias biológicas antivirales de la regulación de STAT1 por c-Abl, WT y c-abl/arg/MEF pretratados con o sin IFNg diluido en serie se infectaron con el virus de la estomatitis vesicular (VSV). La infección por VSV causó una muerte celular más grave en c-abl/arg/MEF y células WT tratadas con AMN107 que en WT MEF tratadas con vehículos (Figura 6B). El tratamiento con IFNg disminuyó notablemente la muerte celular inducida por una infección viral, pero tuvo un efecto mucho menos pronunciado en presencia de AMN107. De acuerdo con este hallazgo, la ablación con c-abl/arg en MEF resultó en insensibilidad a la estimulación con IFN, pero este efecto se revirtió notablemente con el rescate con c-Abl (Figura 6B). A continuación, las células A549 tratadas con o sin AMN107 se infectaron con el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) que expresa GFP, y los resultados revelaron que la replicación viral también fue potenciada por el tratamiento con AMN107 pero suprimida por la expresión de c-Abl (Figura 6C). De acuerdo con el hallazgo de que la transfección de ADN conduce a la activación de la respuesta endógena de IFN (Park et al., 2003), la transfección con el vector pcDNA inhibió la proliferación viral. En particular, la transfección con Flag-c-Abl resultó en un efecto inhibidor más pronunciado sobre la proliferación viral que la transfección con un vector vacío (Figura 6C). Además, el tratamiento con IFNg tuvo poco o ningún efecto sobre la infección viral en presencia del inhibidor selectivo de c-Abl AMN107 (Figura 6D). Estos datos sugieren que c-Abl desempeña un papel importante en los efectos antivirales mediados por STAT1-. A continuación, investigamos las funciones de c-Abl en la infección viral en ratones call/fl, Lck-Cre (c-abl-knockout condicional, c-abl-cKO), en los que c-abl fue eliminado específicamente en timocitos (Figura S7A ) ya que la desactivación de la línea germinal del gen c-abl provoca huida y muerte dentro de las dos primeras semanas después del nacimiento (Koleske et al., 1998; Schwartzberg et al., 1991). Luego, los ratones WT y c-abl-cKO se infectaron por vía intranasal con el virus de la influenza A (IAV). Se observó una mayor mortalidad estadísticamente no significativa entre los ratones c-abl-cKO que entre los ratones WT. Los ratones WT a los que se administró continuamente AMN107, que suprime sistemáticamente las quinasas c-Abl/Arg en todos los tejidos, demostraron una sensibilidad significativamente mayor al IAV (Figura 6E). En conjunto, estos hallazgos indican que c-Abl es necesario para la inmunidad antiviral en animales.

Figura 6. c-Abl promueve efectos antivirales dependientes de IFN

DISCUSIÓN

IFNg es una de las citocinas inmunomoduladoras más importantes y desempeña un papel vital en la inmunidad innata contra la infección viral. En la señalización canónica de IFNg, tras la estimulación con IFNg, JAK1 y JAK2 se reclutan en las colas citoplasmáticas de los receptores de IFNg agregados (IFNGR) y se activan mediante eventos secuenciales de autofosforilación y transfosforilación (Stark, 2007; Villarino et al., 2017). Luego, STAT1 se acopla a IFNGR mediante la asociación de su dominio SH2 con una secuencia de reconocimiento en IFNGR (Y440DKPH444), dentro de la cual Y440 es fosforilado por JAK (Greenlund et al., 1995). Después de su fosforilación en Y701 por JAK, STAT1 se dimeriza y se transloca al núcleo, donde promueve la transcripción de una serie de genes que responden a IFNg (Aaronson y Horvath, 2002; Stark y Darnell, 2012). La ablación de Stat1 en ratones da como resultado una ausencia de respuestas transcripcionales al IFN y una falta de actividades antimicrobianas y antivirales inducidas por IFN en las células (Meraz et al., 1996). Los ratones Stat1/también demuestran una mayor susceptibilidad al desarrollo de tumores espontáneos y químicos inducidos por (3-metilcolantreno) (Kaplan et al., 1998) e hipersensibilidad a ciertas patologías inflamatorias (Bettelli et al., 2004; Villarino et al. ., 2010). Además, la señalización STAT1 protege a las células T de la citotoxicidad mediada por células asesinas naturales (Kang et al., 2019).Estos hallazgos sugieren que STAT1 media la activación inmune innata y la inmunidad tumoral.

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Schlatterer et al. informaron que c-Abl, pero no Arg, podría inducir la pérdida neuronal al provocar la activación de STAT1 y la producción de interferón. Sin embargo, no se ha dilucidado el mecanismo exacto responsable de la activación de STAT1 dependiente de c-Abl (Schlatterer et al., 2012). Aquí, mostramos que c-Abl se une y fosforila a STAT1 e interactúa con STAT2 directamente in vitro (Figuras 2 y 3, S8A, S9A y S10A). STAT1 Y701 está fosforilado exclusivamente por las quinasas JAK, que regulan la formación del dímero STAT1 (Schindler et al., 1992; Shuai et al., 1993) y el transporte nucleocitoplasmático durante la señalización de IFNg (Mao et al., 2005; Mertens et al., 2006; Zhong et al., 2005). Nuestro estudio encontró inesperadamente que c-Abl, otra quinasa distinta de las JAK, también contribuye a la fosforilación de STAT1 Y701 de forma independiente (Figura 3). Aunque la fosforilación de Y701 mediada por c-Abl no es tan poderosa como la de las JAK, parece ser necesario que Y701 alcance la fosforilación máxima ya que se observó una fosforilación de Y701 gravemente alterada en células c-abl/arg/tras el estímulo de IFNg, y IFNg- La fosforilación inducida de STAT1 Y701 fue inhibida por AMN107, de 1,25 mM a 5 mM, de una manera dependiente de la dosis (Figuras 3G y S11A). Sin embargo, la fosforilación de Y701 no se ve muy afectada por el estado de fosforilación de Y106 e Y665, los otros dos fosfositos de c-Abl, lo que indica que la fosforilación potenciada de STAT1 Y701 no resulta de la fosforilación de sitios múltiples de STAT1 mediada por c-Abl, pero posiblemente sea atribuido a una mayor actividad de JAK. Estudios anteriores han demostrado que se ha observado la activación constitutiva de JAK1 y la activación variable de JAK2 en células que expresan BCR-Abl (Chai et al., 1997; Henderson et al., 1997; Shuai et al., 1996). Además, se ha demostrado que BCR-Abl activa modestamente STAT1 y STAT2 mediante la fosforilación de tirosina de JAK1, JAK2 y JAK3 (Henderson et al., 1997). La evidencia actual respalda que Abl y JAK pueden tener efectos sinérgicos pronunciados sobre la fosforilación de STAT1 en Y701 (Figura 3E).

Además de Y701, se identificó simultáneamente la fosforilación de Y106 e Y665 (Figuras 3C y S4A). Estos fosfositos no participaron en la fosforilación de STAT1 Y701 ni en la homodimerización de STAT1 (Figuras S4B y S4C). Sin embargo, Murphy y sus colegas descubrieron que la interacción entre los NTD (dominio de interacción de proteínas N-terminal, aminoácidos 1 a 136) de los monómeros es necesaria para la dimerización de moléculas STAT de longitud completa no fosforiladas (Ota et al., 2004). Los mutantes STAT1 (F77A y/o L78A) no logran formar dímeros no fosforilados, y estos mutantes exhiben una fosforilación persistente en el fenotipo en células tratadas con IFN y resistencia a la desfosforilación mediada por TC45-in vitro (Mertens et al., 2006). Y106 en el NTD, que está cerca de F77 y L78, puede ser responsable de mantener STAT1 en un estado de dímero fosforilado y de mantener STAT1 en el núcleo bajo radiación ionizante (Figuras S6A y S6B). Además, el dominio SH2 interactúa con el dominio que contiene tirosina fosforilada cuando el IFN induce la formación de homodímeros fosforilados (Shuai et al., 1994). Y665, que se encuentra en el dominio SH2, puede afectar la dimerización. Las funciones de los sitios de fosforilación mediada por c-Abl (Y106 e Y665) requieren más investigación.

De manera similar a las JAK, la fosforilación mediada por c-Abl regula la formación del dímero STAT1 (incluido el homodímero STAT1- STAT1 y la formación del heterodímero STAT1-STAT2 (Figuras 4A, S12A y S12B)), la translocación nuclear y la unión al ADN. y transcripción de genes estimulados por IFN. La alteración de Abl contribuyó a una proliferación viral potenciada y a un aumento de la muerte celular inducida por virus (Figuras 6B, 6C y 6D). Además, encontramos que la radiación ionizante (IR) indujo la translocación nuclear de STAT1 en ausencia del inhibidor de c-Abl (Figuras S6A y S6B). IR activa c-Abl directamente (Pendergast, 2002) y posteriormente la señalización de IFNg dependiente de STAT1-, que puede proporcionar un mecanismo subyacente mediante el cual la radioterapia inicia un ataque inmunológico innato y adaptativo en cascada de IFN contra el tumor (Burnette et al. ., 2011) y ofrece un estado inmunológico innato más fuerte en respuesta a los estímulos IR. En comparación con los compañeros de camada WT, los ratones en los que c-abl fue eliminado condicionalmente en los timocitos mostraron una mortalidad mayor, pero no estadísticamente significativa. En particular, los ratones a los que se les administró sistemáticamente el inhibidor de c-Abl/Arg AMN107 tuvieron una mayor mortalidad (Figura 6E), lo que indica que la expresión de c-Abl en una variedad de tejidos contribuyó a la inmunidad antiviral en los animales. A partir de estos datos, sugerimos que el Abl endógeno ofrece una resistencia basal latente a la infección viral y que el Abl activado estimulado por radiación ionizante protege las células. Las abl quinasas se activan constitutivamente en la mayoría de los pacientes con leucemia mieloide crónica. Los inhibidores de la quinasa Abl STI571 y AMN107 representan el tratamiento de primera línea para la terapia de leucemia mieloide crónica. Sin embargo, se observan comúnmente infección del tracto respiratorio superior e inmunosupresión, que pueden ser causadas por la represión de la vía reguladora inmune mediada por STAT (Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi et al., 2003). Nuestros hallazgos agregaron una base teórica para optimizar la terapia.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

En resumen, se descubrió que la tirosina quinasa c-Abl se asocia con STAT1 in vivo e in vitro, promueve la fosforilación de STAT1 en Y701 independientemente de las JAK, potencia la transactivación y media las respuestas inmunes innatas contra la infección, particularmente en el contexto de c -Estrés relacionado con Abl. Nuestro hallazgo proporciona un enfoque complementario para la activación de STAT1, que contribuye al creciente conjunto de conocimientos sobre la regulación de la vía de señalización descendente del IFN.

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