El estado actual de la neuroprotección en las cardiopatías congénitas, parte 2

Luego, las imágenes microscópicas se sometieron a cálculo de imágenes utilizando el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.). La señal de Hsp60 se multiplicó por "x".

Hsp60 es una molécula proteica importante que desempeña un papel biológico importante en el cuerpo humano. Las investigaciones de los últimos años han demostrado que la presencia de Hsp60 está estrechamente relacionada con la memoria humana.

Hsp60 es una proteína chaperona molecular que participa principalmente en el plegamiento, despliegue, estabilización y degradación de proteínas. Estos procesos son muy importantes para el metabolismo normal y la función celular del cuerpo humano. Al mismo tiempo, la Hsp60 también tiene efectos antioxidantes, antiinflamatorios e inmunomoduladores y desempeña un papel importante en el mantenimiento de la salud humana y el equilibrio del sistema inmunológico.

Las investigaciones han descubierto que la Hsp60 desempeña un papel crucial en la formación y el mantenimiento de la memoria. Durante el proceso de aprendizaje y memoria, las células cerebrales producen una gran cantidad de moléculas de Hsp60. Estas moléculas pueden proteger a las células de interferencias y daños del entorno externo para garantizar el buen progreso del aprendizaje y la memoria. Además, la Hsp60 también puede afectar el pensamiento y el comportamiento humanos al cambiar la transducción de señales de las células cerebrales y el desarrollo de las neuronas y tiene un impacto positivo en la cognición y la resistencia al estrés.

Aunque el papel de la Hsp60 ha demostrado efectos positivos en el cuerpo humano, las personas también deben darse cuenta de que tanto el exceso como la deficiencia de Hsp60 pueden tener efectos negativos en la salud humana. Por lo tanto, debemos explorar y estudiar activamente el mecanismo de la Hsp60 en diversas condiciones fisiológicas y patológicas del cuerpo humano para comprender mejor la posición y el papel de la Hsp60 en la salud humana. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria, porque Cistanche deserticola tiene efectos antioxidantes, antiinflamatorios y antienvejecimiento, que pueden ayudar a reducir la oxidación y las reacciones inflamatorias en el cerebro, protegiendo así la salud del sistema nervioso. Además, Cistanche deserticola también puede promover el crecimiento y la reparación de las células nerviosas, mejorando así la conectividad y la función de las redes neuronales. Estos efectos pueden ayudar a mejorar la memoria, la capacidad de aprendizaje y la velocidad del pensamiento, y también pueden prevenir el desarrollo de disfunciones cognitivas y enfermedades neurodegenerativas.

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El valor "x" se determinó de la siguiente manera: restar la señal de Hsp60 plegada en "x" de la señal del ADN mitocondrial en el grupo de control hizo que el valor del ADN mitocondrial fuera menor o igual a cero. La señal de la histona H2B se multiplicó por "y".

El valor "y" se determinó de la siguiente manera: restar la señal de histona H2B plegada en "y" de la señal de ADN nuclear en el grupo de control hizo que el valor de ADN nuclear fuera menor o igual a cero. Si la señal de fondo aumenta debido a la multiplicación, el contraste de la imagen multiplicada se puede ajustar para las mismas condiciones en todas las muestras.

La imagen de tinción de ADNds, menos la imagen ajustada de Hsp60 multiplicada y la histona H2B, se utilizó para el análisis posterior. Usando la función "Ajustar-Umbral", estas imágenes fueron binarizadas. Seleccionamos puntos de ADNds con tamaños de 2 a 2 0 µm2 (circularidad 0,1–1,0) y se contaron utilizando la función "Analizar-Analizar partículas".

2.3. Microscopio de electrones

Un día antes de la transfección, las células HeLa se sembraron en placas a una densidad de 600 células/μL. La expresión de genes de interés se silenció en células HeLa usando ARNip Stealth RNAi (Thermo Fisher Scientific) en reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) de acuerdo con el instrucciones del fabricante (con una concentración final de ARN de 10 nM).

Cuatro días después de la eliminación del ARNip, las células se sometieron a fijación. Las muestras de cultivo celular se fijaron con PFA al 2% y glutaraldehído al 2% en tampón fosfato 0.1 M, pH 7,4, a 37 ◦C, luego se colocaron en un recipiente de 4 ◦C refrigerador durante 30 min. Las muestras se fijaron en glutaraldehído al 2% en tampón fosfato 0.1 M durante la noche a 4 ◦C. Las muestras se lavaron tres veces con tampón fosfato 0.1 M durante 30 min y se fijaron posteriormente con tetróxido de osmio al 2 % en tampón fosfato 0,1 M a 4 ◦C durante 1 h.

Las muestras se deshidrataron en soluciones de etanol graduadas, se transfirieron a resina (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokio, Japón) y se polimerizaron a 60 ◦C durante 48 h. Las resinas polimerizadas se cortaron en secciones 70- ultrafinas con una cuchilla de diamante utilizando un ultramicrótomo (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) y luego se montaron sobre rejillas de cobre.

Las secciones se tiñeron con acetato de uranilo al 2% a temperatura ambiente durante 15 minutos y se lavaron con agua destilada, seguido de una tinción secundaria con una solución de tinción con plomo (Sigma-Aldrich, Tokio, Japón) a temperatura ambiente durante 3 minutos.

Las rejillas se observaron bajo un microscopio electrónico de transmisión (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Tokio, Japón) a un voltaje de aceleración de 80 kV (cerebro de pez cebra) o 100 kV (célula), y las imágenes se registraron usando una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.) .

2.4. Microscopía inmunoelectrónica

Las muestras de los discos de oro se congelaron en propano líquido a -175 ◦C. Después de congelar las muestras, se substituyeron por congelación con ácido tánico al 1% en etanol y agua destilada al 2% a -80 ◦C durante 24 horas.

Luego, las muestras se mantuvieron a -20 ◦C durante 4 h, seguido de una incubación a 4 ◦C durante 1 h. A continuación, las muestras se deshidrataron en etanol anhidro 3 veces durante 30 min. cada vez, seguido de infiltración con una mezcla 50:50 de etanol y resina (LR white: London Resin Co. Ltd., Berkshire, Reino Unido) a 4 ◦C durante 1 hora. Las muestras se transfirieron a resina fresca 100% y se incubaron a 4 ◦C durante 30 min, y este proceso se repitió tres veces.

Las muestras se transfirieron a resina 100% fresca y se polimerizaron a 50 ◦CO/N. Las resinas polimerizadas se cortaron en secciones ultrafinas a 90 nm con una cuchilla de diamante utilizando un ultramicrótomo (Ultracut UCT; Leica), y las secciones se colocaron sobre rejillas de níquel. Las rejillas se incubaron con anticuerpo anti-ADNbc (ADN 35I9) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) en BSA al 1%/PBS a 4 ◦CO/N, seguido de tres enjuagues con 1% BSA/PBS durante 1 min cada uno.

Posteriormente se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con partículas de oro {{0}} nm (anticuerpo policlonal IgG anti-ratón de cabra) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de enjuagar con PBS, las rejillas se colocaron en tampón cacodilato 0,1 M de glutaraldehído al 2%.

Posteriormente, las rejillas se secaron y luego se tiñeron con acetato de uranilo al 2% durante 15 min y con una solución de tinción de plomo (Sigma-Aldrich) a temperatura ambiente durante 3 min. Las rejillas se observaron a través de un microscopio electrónico de transmisión (JEM-1400 plus; JEOLLtd.) a una tensión de aceleración de 100 kV. Las imágenes digitales se obtuvieron con una cámara CCD (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Resultados

3.1. La disminución de TFAM o GBA induce un aumento en el ADN mitocondrial ectópico

Primero, mostramos un ejemplo de la detección de ADN citoplasmático derivado de mitocondrias en células HeLa en las que la proteína TFAM fue eliminada por ARNip (Figura 1A). TFAM es un factor de transcripción mitocondrial clave y también funciona en la replicación y reparación del ADN mitocondrial [20] .

Se ha informado que los polimorfismos de secuencia en este gen están asociados con la enfermedad de Parkinson [21,22]. Después de 3 días de eliminación de la proteína TFAM, se detectaron muchos puntos de ADN de doble cadena en el citoplasma de las células HeLa.

Las histonas son marcadores positivos para el ADN de origen nuclear en el citoplasma y marcadores negativos para el ADN mitocondrial y el ADN de origen mitocondrial en el citoplasma [23]. Estos puntos no se co-localizaron con las histonas, lo que sugiere que no eran ADN de origen nuclear. Además, algunos de estos puntos de ADN ectópico citoplásmico no se co-localizaron con Hsp60, un marcador de la matriz mitocondrial, lo que indica que residían fuera de las mitocondrias (Figura 1B, C).

La microscopía electrónica también mostró que el ADN ectópico se filtró de las mitocondrias (Figura 2A, B). En resumen, el aumento de puntos de ADN ectópicos en el citoplasma por la eliminación de TFAM se debió a la fuga de ADN mitocondrial de las mitocondrias. En segundo lugar, mostramos otro ejemplo de la detección de ADN citoplasmático derivado de mitocondrias en células HeLa en las que la proteína GBA fue eliminada por ARNip. (Figura 1A).

GBA es el gen causante de la enfermedad de Gaucher, pero una mutación heterocigótica de GBA también es un factor de riesgo para la enfermedad de Parkinson [24]. Se detectaron muchos puntos de ADN bicatenario en el citoplasma de las células HeLa después de 3 días de eliminación de la proteína GBA. Algunos puntos de ADN estaban co-localizados con histonas, lo que sugiere que eran ADN de origen nuclear.

Otros puntos de ADN no estaban co-localizados con histonas, lo que sugiere que no eran ADN de origen nuclear sino ADN derivado de mitocondrias (Figura 1D). En resumen, el aumento de puntos de ADN ectópico en el citoplasma debido a la eliminación de GBA se debió, al menos en parte, a la fuga de ADN mitocondrial de las mitocondrias.

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