La prevalencia mundial de la enfermedad renal crónica (ERC) está aumentando con el envejecimiento de la población

Póngase en contacto con oscar.xiao@wecistanche.com para obtener más información.

Fondo:La fibrosis es una de las características patológicas más comunes del proceso de envejecimiento del riñón, y la fibrosis en los riñones que envejecen también agrava el proceso de la enfermedad renal crónica (ERC). Corallodiscus flabellata BLBurtt (C.flabellata, CF) es una droga botánica de uso común en el folclore chino. Sin embargo, pocos estudios han reportado sus efectos farmacológicos. Este estudio tuvo como objetivo explorar el efecto del extracto de etanol CF sobre la fibrosis renal en ratones SAMP8 e identificar compuestos potencialmente activos.

Métodos:Se utilizaron 8 ratones propensos a la senescencia acelerada (SAMP8) como modelos animales y se administraron diferentes dosis de CF por sonda durante un mes. Observar el grado de envejecimiento renal en ratones mediante tinción con -galactosidasa. La tinción de Masson y los niveles de expresión de Col-lI, a-SMA y FN se utilizaron para evaluar la fibrosis renal en ratones. Se midieron los niveles de expresión de proteínas de la vía Nrf2 y la vía Wnt/ -catenina/RAS en el riñón. Y -galactosidasa ( -gal) indujo células NRK-52E como modelo in vitro para detectar los componentes activos de la FQ.

Por favor haga clic aquí para saber más

Resultados:El extracto de etanol CF inhibió significativamente la actividad de la -galactosidasa renal y los niveles de expresión de los ratones Coll, a-SMA y FNin SAMP8, y mejoró la tinción de Masson en los ratones SAMP8. CF redujo notablemente la proteína urinaria, la creatinina, el nitrógeno ureico y los niveles séricos de TNF-a e IL-1 en ratones SAMP8 y aumentó significativamente los niveles de SOD y GSH-Px. Además, CF activó la vía Nrf2 y bloqueó la vía Wnt/ -catenina/RAS en los riñones de los ratones. Además,3,4-dihidroxi fenil etanol (SDC-0-14,16) y (3,4-dihidroxi fenil etanol-8-O-[4-O-trans -caffeoyl- -D-apiofuranosy-(1→3)- -D-glucopiranosil (1→6)]- -D-glucopiranósido (SDC-1-8)fueron aislados de FQ , que redujo la senescencia de las células NRK-52E, y quizás los ingredientes activos de la FQ desempeñan el papel antienvejecimiento.

Conclusiones:Nuestros experimentos revelaron que el extracto de etanol CF puede mejorar la fibrosis renal en ratones SAMP8 a través de la vía Wnt/-catenina/RAS. Y SDC-0-14,16 y SDC-1-8 pueden ser la base material para que la FQ ejerza efectos antirrenales relacionados con la senescencia.

Palabras clave:Envejecimiento, Corallodiscus flabellata, Riñón, Fibrosis renal, SAMP8, Senescencia, Wnt/ -catenina/RAS

Introducción

La prevalencia mundial de la enfermedad renal crónica (ERC) está aumentando con el envejecimiento de la población y representa una carga importante para la sociedad [1-3]. La manifestación patológica más común de la ERC es alguna forma de fibrosis renal[4]. Asimismo, la fibrosis renal también es uno de los signos del envejecimiento renal [2]. Los estudios han demostrado que el estrés oxidativo, la inflamación, la Wnt/-catenina, el sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAS) y la señalización de la rapamicina (mTOR) están todos relacionados con la ERC inducida por la senescencia [5]. La fibrosis renal en los riñones que envejecen está estrechamente relacionada con la activación de la vía de señalización Wnt/-catenina y RAS [6]. Tras la activación de Wnts, la -catenina en el citoplasma se transloca al núcleo, donde se une al factor de unión al potenciador linfoide (LEF)/la familia de factores de transcripción del factor de células T (TCF) e inicia la transcripción de los genes diana aguas abajo. Curiosamente, la región promotora del gen RAS también contiene sitios de unión LEF/TCF, lo que permite que -catenina promueva la unión de LEF-1 a estos sitios[7].colesterol cistanche,Por lo tanto, apuntar a la vía de señalización Wnt/ -catenina/RAS podría ser una estrategia terapéutica potencial para la fibrosis renal [8,9]. En los últimos años, la terapia de reemplazo de la fibrosis renal con productos naturales ha atraído la atención de muchos académicos [10]. . Xiaoyan Shen et al. encontraron que el ginsenósido Rgl mejoró la fibrosis glomerular durante el envejecimiento renal al inhibir la activación del inflamasoma NLRP3 en ratones SAMP8 [11]. Este estudio exploró el efecto del extracto de C. flabellate (CF) sobre la fibrosis renal en ratones SAMP8 de la vía Wnt/-catenina/RAS.

Cistanche puede antienvejecimiento

La FQ como planta medicinal en China se registró por primera vez en el "Dian Nan Ben Cao". La planta entera se usa comúnmente para tratar la disentería, la eyaculación precoz, la enfermedad de las vesículas seminales y la enfermedad renal en áreas de minorías étnicas de China [12]. En la actualidad , hay pocos informes sobre la FQ en la investigación moderna. Los estudios farmacológicos en nuestro laboratorio encontraron que el extracto de FQ tenía efectos diuréticos y mejoró la insuficiencia hepática y el daño cerebral inducidos por lipopolisacáridos/D-galactosamina en ratas [13, 14]. reveló que los glucósidos de feniletanoide y los flavonoides eran los principales componentes químicos de la FQ [15,16].El objetivo de este estudio fue investigar el efecto del extracto de FQ sobre la fibrosis renal en ratones SAMP8 y dilucidar su posible mecanismo, a fin de proporcionar evidencia experimental para el tratamiento de la enfermedad renal con FQ descrita en libros antiguos.

materiales y métodos

Recolección y extracción del material vegetal

La "Medicina herbaria china de Yunnan" registra que la FQ se puede cosechar durante todo el año. Las plantas CF utilizadas en este experimento se cosecharon en el condado de Xixia, provincia de Henan, China, en septiembre. Fue identificado por el profesor Suiqing Chen de la Universidad de Medicina China de Henan, y las muestras se almacenaron en la biblioteca de muestras del laboratorio.efectos secundarios de la cistanche deserticolaLas plantas (1 kg) se sometieron a reflujo con etanol al 50 por ciento (3 x 12 L, cada 1 hora) y la mezcla se filtró con 16 capas de gasa. Los filtrados combinados se secaron por evaporación rotatoria utilizando un secador por congelación. Finalmente, el rendimiento porcentual del extracto crudo de CF en etanol al 50 por ciento fue del 15,5 por ciento. El extracto seco se mantuvo en refrigeración hasta su uso posterior. Los materiales complementarios enumeran los datos relevantes sobre la designación de ingredientes del extracto CF.

En este estudio se utilizó otro proceso de separación informado anteriormente para obtener la fracción de elución con agua, la fracción de elución con etanol al 20 %, la fracción de elución con etanol al 30 % y la fracción de elución con etanol al 40 % de CF [13]. La fracción de etanol al 40 por ciento se separó utilizando Sephadex LH-20 y una columna de gel de sílice y se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) semipreparativa para obtener finalmente compuestos como SDC-0-14,16, SDC{ {10}}, SDC-0-60(alcohol p-hidroxibencílico).

animales y administracion

En este estudio se utilizaron ratones SAMP8 machos de seis meses de edad y ratones 1 (SAMR1) resistentes a ratones acelerados por senescencia del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina Tradicional China de Tianjin (Tianjin, China). Los animales se alojaron bajo condiciones de luz controlada (ciclo de luz/oscuridad de 12-h), temperatura (23-25 grados C) y humedad (45-55 por ciento) y recibieron una dieta estándar y agua ad libitum. Un total de 48 ratones SAMP8 se dividieron en cuatro grupos experimentales (n=12/grupo): ratones modelo SAMP8 (M), ratones SAMP8 tratados con extracto de etanol CF en dosis baja (CF-L, 387,5 mg/kg, intragástricamente), ratones SAMP8 tratados con extracto de etanol CF en dosis media (CF-M, 775 mg/kg, por vía intragástrica) y ratones SAMP8 tratados con extracto de etanol CF en dosis alta (CF-H, 1550 mg/ kg, por vía intragástrica). Los ratones en los grupos de control SAMRI (Con, n=10) y modelo SAMP8 (M) se trataron con solución salina fisiológica (0,9 por ciento). Todos los ratones fueron tratados por vía oral durante 1 mes. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Medicina China de Henan y se realizaron según las pautas institucionales (Número de aprobación de Henan, China: HACTCM-2018009060-19). Durante el experimento, hubo una muerte de ratón en cada uno de los grupos Con y M, y dos ratones murieron en el grupo CF-H.

Coleccion de muestra

Al final del experimento, los ratones se alojaron individualmente en jaulas metabólicas durante 12- horas de recolección de orina. A continuación, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se recogieron muestras de sangre mediante sangrado retroorbitario. A continuación, se extirparon quirúrgicamente los riñones de cada ratón y se mantuvieron a 80 grados C hasta los análisis.

Cultivo celular y estudio in vitro

Se cultivaron células NRK-52E adquiridas del Banco de células de la Academia de Ciencias de China (Shanghai, China) para investigar el efecto del extracto de CF en el envejecimiento celular causado por la D-galactosa (D-gal, S11050, Yuanye, Shanghai, China). Las células NRK-52E se cultivaron en la modificación de Dulbecco del medio de Eagle Dulbecco (DMEM, 12,100,046, Thermo Fisher, Massachusetts, EE. UU.) suministrado con suero bovino fetal al 10 por ciento en una incubadora a 37 grados C y en presencia de por ciento, CO. Las células se cultivaron en 96-placas de pocillos o 6-placas de pocillos hasta 80-85 por ciento de confluencia y luego se trataron con medios de cultivo que contenían diferentes combinaciones de fármacos: Medios más D-gal ( 20 mg/mL）, Media más D-gal más CF（10, 25,50, 100 ug/mL）o Media más D-gal más compuesto monomérico（10 μM） respectivamente durante 48 h. Posteriormente, el metil tiazolil tetrazolio ( MTT) para detectar la viabilidad celular, y se usó la tinción de -galactosidasa para observar la senescencia celular.

Tinción de galactosidasa asociada a la senescencia

Riñones congelados de ratones cortados en secciones de 10-μm de espesor y células NRK-52E se tiñeron con -galactosidasa asociada a la senescencia (SA- -gal, C0602, Beyotime Biotechnology, Shanghái, China) siguiendo los protocolos del fabricante.

Análisis histológico

Las secciones de riñón se fijaron con paraformaldehído tamponado al 4 por ciento y las secciones incrustadas en parafina de 10- μm de espesor se tiñeron con tricrómico de Masson (G1006, Service, Wuhan, China) y se observaron al microscopio. Las áreas de color azul en las secciones teñidas con tricrómico de Masson se midieron cuantitativamente de seis campos seleccionados al azar y se analizaron con el software Image-Pro Plus 6.0.

Mediciones bioquímicas

Las muestras de homogeneizado de riñón y suero se descongelaron a temperatura ambiente y los niveles de superóxido dismutasa (SOD, CSB-E08556m, Wuhan Huamei, Wuhan, China), glutatión peroxidasa (GSH-Px, A005-1-2, Nanjing Jiancheng, Nanjing, China), interleucina-1 (IL-1 , RK00006, ABclonal, Wuhan, China), factor de necrosis tumoral (TNF- , RK00027, ABclonal, Wuhan, China), nitrógeno ureico (C{ {10}}, Nanjing Jiancheng, Nanjing, China), creatinina (Cr, C011-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing, China) en suero de ratón, proteína urinaria total (C035-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing , China) en orina de ratón y los niveles de expresión de colágeno tipo I (Col-I, MU30364, Bio-Swamp, Wuhan, China), -actina de músculo liso (-SMA, MU30359, Bio-Swamp, Wuhan, China), fibronectina (FN, MU30179, Bio-Swamp, Wuhan, China) en tejidos de riñón de ratón se midieron secuencialmente según el protocolo del fabricante del kit de ensayo.

Análisis inmunohistoquímico

El análisis inmunohistoquímico se realizó utilizando el método de rutina [17]. Los anticuerpos utilizados incluyeron los siguientes: Wnt4 (14371-1-AP, Proteintech, Chicago, EE. UU.), -catenina (17565-1-AP, Proteintech, Chicago, EE. UU.), receptores de angiotensina II tipo 1 (AGTR1,{{ 7}}AP, Proteintech, Chicago, EE. UU.), factor p-nuclear eritroide 2-factor relacionado 2 (p-Nrf2, ab76026, Abcam, Cambridge, Reino Unido), pc-Fos (ab27793, Abcam, Cambridge, Reino Unido) ), factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF, GB11078, Service, Wuhan, China). Las secciones se observaron bajo un microscopio (Olympus, Tokio, Japón).dosis de cistanche redditMida el área y la densidad óptica integrada (IOD) del área con expresión de bronceado usando el software Image-Pro Plus 6.0 y calcule la densidad óptica media (MOD, MOD=IOD/área) para semi -análisis cuantitativo.

Análisis de Western Blot

Western blot ensayo se realizó como se describe en un estudio anterior [18]. Brevemente, los tejidos renales se homogeneizaron en tampón de lisis y se cuantificaron utilizando un kit de ensayo de proteínas de Bradford (AR0197, Boster Biological Technology, Wuhan, China). A continuación, los homogeneizados se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico, se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno y se bloquearon en tampón de bloqueo (leche desnatada en polvo al 4 %) durante 90 min. Luego se incubaron con anticuerpos primarios (Wnt4; renina; AGTR1; p-Nrf2; pc-Fos; proteína 1 asociada a ECH similar a Kelch (Keapl, GB11847, Service-bio, Wuhan, China); -actina (AC026, Abclonal, Wuhan, China); y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, AC033, Abclonal, Wuhan, China)) durante la noche a 4 grados, seguido de incubación con un anticuerpo secundario conjugado en presencia de fluo apropiado durante 1 hora a temperatura ambiente . Las proteínas de interés se escanearon con un escáner IR Odyssey (LI-COR Biosciences, Nebraska, EE. UU.) y las intensidades de las señales se cuantificaron con el software Image Studio. Los niveles de proteína se normalizaron frente a la -actina o GAPDH.

Análisis UPLC-Q-TOF-MS para muestras de riñón

Los tejidos renales se pesaron y homogeneizaron en solución salina fisiológica helada (p/v=1:1). Luego, se agregó 1 mL de acetonitrilo a 200 μL de muestras de tejido homogeneizado, seguido de extracción ultrasónica durante 30 min. El extracto se centrifugó a 12,000 gy 4 grados durante 10 min. El sobrenadante se llevó al vial para su análisis. La separación cromatográfica se llevó a cabo en cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) (Sistema Dionex UltiMate 3000, Thermo Scientific, Massachusetts, EE. UU.), con el sistema LC que comprende una columna Acclaim RSLC 120 C18 (2,2 μm, 2,1 × 100 mm); Thermo Scientific).beneficios del extracto de cistancheLa fase móvil consistía en el solvente A (acetonitrilo) y agua con {{0}}.1 por ciento de ácido fórmico (B). La separación se realizó mediante elución en gradiente de la siguiente manera:10-70 porcentaje de A de 0 a 3 min,70-78 porcentaje de A de 4 a 13 min,78-90 porcentaje de A de 14 a 15 min, 90 por ciento -10 por ciento A de 15 a 16 min, y 10 por ciento A de 16 a 20 min. El volumen de inyección de la muestra de prueba fue de 2 μL. El análisis de espectrometría de masas (MS) se realizó utilizando una fuente ESI en las siguientes condiciones: el voltaje capilar en el modo positivo fue de 3,5 kV y el voltaje capilar en el modo negativo fue de 3,2 kV. La presión del nebulizador era de 2,0 bares, la temperatura del gas seco era de 230 grados y el caudal era de 8 l/min.

análisis estadístico

The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}}.05; se utilizó el análisis de varianza de una vía para la comparación entre los grupos. Se consideró estadísticamente significativo un valor de AP inferior a 0,05.

Resultados

CF mejoró el envejecimiento y la fibrosis de los riñones en ratones SAMP8

Para investigar el efecto de CF en los riñones de ratones SAMP8, se midió la actividad de SA- -gal en los riñones. En la Fig. la, la actividad de SA- -gal en los tejidos renales aumentó significativamente en el grupo M (realce azul). La administración de CF-L y CF-M inhibió significativamente la actividad de -galactosidasa en los riñones de ratones SAMP8 mientras que la mejora por CF-H no fue significativa. Además, el índice renal del grupo modelo fue significativamente más bajo que el del grupo control (Fig. 1b, P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>

CF mejoró la función renal, el estrés oxidativo y los niveles de inflamación en ratones SAMP8

Además, se probaron los indicadores de la función renal de cada grupo de ratones, que incluyeron el volumen de orina en los ratones durante 12 h, los niveles de Cr y nitrógeno ureico en el suero y los niveles de proteína en la orina. Como se muestra en la Fig. 2a-d, los niveles de proteína en orina, Cr sérica y nitrógeno ureico sérico del grupo modelo fueron significativamente más altos que los del grupo control (Fig. 2a, P<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">cistanche genghis khanA continuación, se exploró si la FQ modulaba de manera beneficiosa el estrés oxidativo y la inflamación en los riñones de ratones que envejecían rápidamente. Como se muestra en la Fig. 2e-h, los niveles de SOD y GSH-Pxin en los riñones del grupo M fueron significativamente más bajos que los del grupo Con, y los niveles de IL-1 fueron significativamente más altos que los del grupo Con. el grupo Con. Después del tratamiento con CF, los indicadores anteriores han mejorado, especialmente el efecto de mejora de CF-L y CF-M es mejor.

CF activó la vía Nrf2 en el riñón de ratones SAMP8

El nivel de expresión de p-Nrf2 se midió en tejidos renales para investigar si la vía de Nrf2 estaba involucrada en el efecto protector de la FQ (Fig. 3a-c) en el presente estudio. El nivel de expresión de p-Nrf2 disminuyó significativamente en el grupo SAMP8 solo (P<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">

CF atenuó la activación de señalización de Wnt/-catenina/RAS en el riñón de ratones SAMP8

Con el fin de explorar más a fondo el mecanismo potencial de la FQ que ejerce el efecto antifibrosis. La localización de la proteína se realizó mediante inmunohistoquímica. Como se muestra en la Fig. 4a, el nivel de expresión de Wnt4 y

-catenina se indujo predominantemente en las células tubulares renales. Se observaron resultados similares cuando se evaluaron AGTR1, los objetivos de la vía descendente de la señalización de Wnt (Fig. 4a). Después de eso, se cuantificó el nivel de expresión de la proteína y los resultados mostraron que las proteínas Wnt4, -catenina, renina y AGTR1 se acumularon en el tejido renal de los ratones en el grupo modelo, mientras que CF inhibió significativamente esas alteraciones (Fig. 4b-f ). Además, también se localizó y analizó cuantitativamente el nivel de expresión de CTGF. De acuerdo con los resultados antes mencionados, CTGF se expresó principalmente en los túbulos renales, y CF inhibió notablemente la actividad de CTGF (Fig. 4d g).

CF y sus compuestos inhibieron la senescencia de las células NRK-52E inducida por D-gal

Las células NRK-52E inducidas por D-gal se usaron para seleccionar ciertos ingredientes activos en la FQ, para determinar la base material para el tratamiento de los riñones seniles con el extracto de FQ. Los resultados mostraron que la CF mejoró la viabilidad celular de una manera dependiente de la dosis y los compuestos

SDC-0-14,16 y SDC-1-8 aislados de CF tuvieron mejores efectos sobre la proliferación celular. Además, 25 ug/mL de CF y los compuestos SDC-0-14,16 y SDC-1-8 mostraron el efecto de inhibir la actividad de -galactosidasa (Fig. 5).

CF mejoró el análisis PCA del tejido renal en ratones SAMP8 Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para explorar los efectos de CF en ratones SAMP8. Como se muestra en la Fig. 6a, hubo una agrupación obvia entre los grupos de control y modelo (R2X=0.542; Q2=0.38), lo que sugiere que los metabolitos endógenos de los ratones SAMP8 eran diferentes de SAMR1 ratones, lo que hace que se desvíen del grupo SAMR1. Como se muestra en la Fig. 6b, los diferentes grupos de FQ también se agruparon en diferentes clases de los grupos de control y modelo, y los grupos de FQ se acercaron al grupo de control, lo que indica que el

Los metabolitos endógenos de los ratones SAMP8 intervenidos con CF fueron similares a los de los ratones SAMR1.

Discusión

El envejecimiento juega un papel importante en la progresión de la ERC [19]. A medida que avanza la fibrosis de la ERC, las células senescentes expresan y secretan factores profibróticos (TGF-, CTGF, etc.) y factores proinflamatorios (IL-1, IL-6, TNF-, etc. ), que son factores fenotípicos secretores asociados a la senescencia, acelerando así la fibrosis renal [20, 21]. En la actualidad, la medicina tradicional china ha logrado buenos resultados en el tratamiento de la fibrosis renal con menos efectos secundarios [22]. Este estudio exploró los efectos intervencionistas del extracto de CF sobre la fibrosis renal en ratones SAMP8. La cepa de ratón seleccionada para este estudio fue SAMP8, que se desarrolló en función de la vida útil, la senescencia y las puntuaciones de clasificación fenotípica patológica de los ratones AKR/ y fue un modelo de envejecimiento acelerado únicamente de origen genético [23,24]. Los estudios han demostrado que los cambios en la patología renal de los ratones SAMP8 (9 meses) incluyen fibrosis tubulointersticial y glomeruloesclerosis segmentaria focal [25]. Y se encontró que la fibrosis renal en ratones SAMP8 estaba relacionada con la edad [6]. Por lo tanto, probamos la actividad de -galactosidasa y

el nivel de fibrosis renal en ratones SAMP8 y encontró que CF-L y CF-M mejoraron la fibrosis renal y la actividad de -galactosidasa en ratones SAMP8 (Fig. 1). Y también probamos la producción de orina de los ratones. De acuerdo con estudios publicados previamente que indicaban que la CF obtenida mediante dos procesos diferentes tenía efectos diuréticos [13], el extracto aumentó significativamente el volumen de orina de los ratones SAMP8. Además, el presente estudio mostró que la suplementación con CF mejoró la función renal, la actividad de las enzimas antioxidantes y los niveles de factores inflamatorios en ratones SAMP8 (Fig. 2).

El sistema Keap1-Nrf2 llamó la atención de muchos académicos en los últimos años debido a sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. Su potencial farmacológico en el tratamiento de enfermedades renales se ha estudiado ampliamente en estudios clínicos y no clínicos [26]. Nrf2 es un regulador transcripcional maestro para genes relacionados con el estado redox y los efectos antioxidantes [27]. Los estudios han demostrado que la fosforilación es necesaria para la activación de Nrf2 y la inducción del gen objetivo [28]. La activación de Nrf2 mejoró la progresión de la ERC al prevenir el estrés oxidativo y mantener la homeostasis redox celular [29]. Como factor de transcripción clave, Nrf2 desempeña un papel crucial en la defensa contra el estrés oxidativo al regular sus antioxidantes y enzimas de desintoxicación aguas abajo [30]. Kim et al. informó que el resveratrol, como un potente activador de Nrf2, mejoró la lesión renal progresiva relacionada con el envejecimiento [31]. En el presente estudio, CF mejoró la atenuación de Nrf2 en el riñón de ratones SAMP8 sin afectar el nivel de expresión de Keapl, lo que sugiere que el extracto crudo de CF podría mejorar el daño oxidativo en los riñones al activar la vía Nrf2 (Fig. 3).

La fibrosis renal se caracteriza por un depósito excesivo de matriz extracelular (MEC) que conduce a la formación de cicatrices en el parénquima renal [32]. Se cree que el factor de crecimiento transformante (TGF-) es una citocina clave en la sobreactivación de fibroblastos [33, 34]. Por supuesto, apuntar solo a la vía de señalización de TGF- es insuficiente para reducir la fibrosis renal. Algunos estudios indicaron que CTGF, Wnt/-catenina, el sistema renina-angiotensina, el estrés oxidativo, etc., estaban implicados en la fibrosis renal [35-37]. Wnt/-catenina es una vía de señalización conservada evolutivamente involucrada en la regulación de la homeostasis tisular, el desarrollo de órganos y la reparación de lesiones[38]. Cisternas et al. discutió el efecto profibrótico de la señalización de Wnt tanto en el músculo esquelético como en el riñón [39]. La creciente evidencia estableció que la vía de señalización Wnt/-catenina juega un papel crucial en la regulación del desarrollo y la progresión de las lesiones fibróticas renales después de una lesión [40-42]. La señal de Wnt/-catenina es relativamente silenciosa en los riñones de adultos sanos y se activa una vez que los riñones están sujetos a varios tipos de daño [43].

En los mamíferos, la familia Wnt tiene al menos 19 miembros críticos para el desarrollo renal. Y al menos 15 de estos miembros de la familia están regulados positivamente de manera diferencial en el riñón envejecido, incluido Wnt4 [6]. Los resultados del presente estudio mostraron que el nivel de expresión de la proteína Wnt4 en los riñones de los ratones SAMP8 fue significativamente más alto que el de los ratones SAMR1, lo cual se verificó tanto por Western blot como por análisis inmunohistoquímicos (Fig. 4a, d y f). Coincidentemente, el nivel de expresión de la proteína -catenina también aumentó. Además, tanto Wnt4 como -catenina se expresaron en células epiteliales tubulares renales, según lo revelado por el análisis inmunohistoquímico (Fig. 4a yf). La Wnt/-catenina provocó fibrosis renal al inducir múltiples genes fibrogénicos como componentes RAS, metaloproteinasa de matriz-7 (MMP-7), inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI-1) y Snail [37 ]. Zhou et al. describió Wnt/-catenina como el principal regulador aguas arriba, que controla la expresión de todos los componentes RAS probados en los riñones [44]. Zhou et al.usaron un modelo de rata con nefrectomía 5/6 (5/6 NX) para mostrar los niveles de expresión de los componentes principales de RAS en el cerebro y los riñones, como el angiotensinógeno, la enzima convertidora de angiotensina y la angiotensina II AT{{25 }}receptor se reguló significativamente. El nivel de expresión regulado al alza fue inhibido por un bloqueador central de Wnt, que era un vector de virus adenoasociado que sobreexpresaba el gen DKK1 [45]. De manera similar, el presente estudio encontró que AGTR1 todavía se expresaba en el epitelio tubular renal, y los niveles de expresión de renina y AGTR1 en los tejidos renales de los ratones SAMP8 eran significativamente mayores que los de los ratones SAMR1 (Fig. 4a y dg). Estos resultados indicaron que la vía de señalización Wnt/ -catenina/RAS se activó en los riñones de los ratones SAMP8, y el CF inhibió de manera eficaz la activación de esta vía.

CTGF ejerce múltiples funciones biológicas, incluida la promoción de la mitosis de las células quimiotácticas, la inducción de la adhesión y la promoción de la proliferación celular y la síntesis de ECM [35,46]. La señalización de Wnt modulada por CCN2 (CTGF) al unirse a la proteína 5/6 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP5/6) para mediar aún más la fibrosis [39, 47]. Otros estudios utilizaron el silenciamiento génico para descubrir y confirmar que Nrf2 regulaba la vía Wnt al regular el nivel de expresión de CTGF, lo que afectaba a la enfermedad intersticial renal. Además, Nrf2 regulaba el nivel de transcripción de CTGF principalmente a través del regulador transcripcional de CTGF c-Fos [48]. El análisis inmunohistoquímico reveló que CTGF y pc-Fos se expresaban principalmente en células epiteliales tubulares renales, y pc-Fos también se distribuía en glomérulos. El análisis cuantitativo mostró que los niveles de expresión de ambas proteínas fueron inhibidos por CF (Figs. 3b y e y 4a y c). Finalmente, el análisis de PCA se usó para verificar aún más que CF mejoraba el daño renal en ratones SAMP8 (Fig. 6). El presente estudio proporcionó evidencia de que la FQ no solo activó la señalización de Nrf2, sino que también se basó en Nrf2 para equilibrar el estrés oxidativo y la inflamación, inhibió la señalización de Wnt/-catenina/RAS y mejoró el envejecimiento renal y la fibrogénesis renal. Sin embargo, también encontramos una mejora inconsistente en el efecto de CF en la tinción de Masson y SA- -gal en este experimento. Se especula que esto puede deberse a la progresión inconsistente del envejecimiento renal y la fibrosis renal en ratones SAMP8. El grado de envejecimiento renal en los ratones de este experimento puede ser más grave que la fibrosis. Por lo tanto, el efecto de mejora de CF-H sobre el envejecimiento renal en ratones SAMP8 no fue tan evidente como el de la fibrosis renal.

Como monosacárido reductor, la D-galactosa se usa ampliamente en diversas enfermedades relacionadas con la edad in vivo e in vitro. Se descubrió que D-gal causa senescencia y lesiones en las células NRK-52E [49], induce la senescencia de las células epiteliales tubulares proximales de riñón humano (células HKC-8) y aumenta los niveles de expresión de dos células renales. proteínas marcadoras de fibrosis FN y a-SMA [6]. En este estudio, se utilizó D-gal para inducir células NRK-52E in vitro. Usando el ensayo MTT y la tinción de -galactosidasa para detectar los compuestos aislados de CF, se encontró que SDC-0-14,16 y SDC-1-8 mejoraron la viabilidad celular inducida por D-gal e inhibieron la inducida por D-gal. senescencia celular (Fig. 5). Estos sugirieron que SDC-0-14,16 y SDC-1-8 pueden ser la base material para que la FQ retrase el envejecimiento renal. SDC-1-8 es uno de los glucósidos feniletanoides. Se descubrió que los glucósidos feniletanoides prolongan la vida útil de Caenorhabditis Elegans [50], con efectos antienvejecimiento [51] y neuroprotectores [52-54]. Estos proporcionan una dirección para nuestro estudio de seguimiento sobre los efectos farmacológicos de la FQ.

Conclusiones

En conclusión, los estudios in vivo mostraron que la FQ redujo la fibrosis renal en ratones de edad avanzada. Algunos ingredientes activos potenciales se encontraron en experimentos in vitro. Estos hallazgos brindaron apoyo farmacológico para el tratamiento de la enfermedad renal con CF y una dirección para futuras investigaciones sobre los ingredientes activos de la CF.

Este artículo está extraído de Cao et al. BMC Medicina y Terapias Complementarias (2022) 22:52