MiR-199-3p mejora la regeneración muscular y mejora los músculos envejecidos y la distrofia muscular

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Los experimentos de parabiosis sugieren que en la sangre circulan factores moleculares relacionados con el rejuvenecimiento y el envejecimiento. Aquí mostramos que miR-199-3p, que circula en la sangre como un miARN libre de células, está significativamente reducido en la sangre de ratones viejos en comparación con ratones jóvenes; y miR-199-3p tiene la capacidad para mejorar la diferenciación miogénica y la regeneración muscular. La administración de imitadores de miR-199, que suministran miR-199-3p, a ratones de edad avanzada provocó una hipertrofia de las fibras musculares y una pérdida retardada de la fuerza muscular. La administración sistémica de imitadores de miR-199 a ratones mdx, un modelo animal bien conocido de distrofia muscular de Duchenne (DMD), mejoró notablemente la fuerza muscular de los ratones. En conjunto, el miR-199-3p libre de células en la sangre puede tener un efecto antienvejecimiento, como un efecto hipertrófico en las fibras musculares envejecidas, y podría tener potencial como un nuevo ARN terapéutico para la DMD, así como para enfermedades relacionadas con la edad. Los hallazgos nos brindan nuevos conocimientos sobre los miARN que circulan en la sangre como moléculas relacionadas con la edad.

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Las funciones vitales, como la fuerza muscular, el funcionamiento del sistema nervioso, la función respiratoria, la defensa contra infecciones y la resistencia contra enfermedades, disminuyen con el envejecimiento. Las enfermedades y disfunciones asociadas con dicho declive funcional están aumentando y convirtiéndose en problemas importantes en las sociedades que envejecen. Varios cambios, como cambios en la regulación metabólica y genética, ocurren en el cuerpo con el envejecimientol-3; y el estudio de tales cambios puede ayudar a comprender el envejecimiento y proporcionar estrategias para abordar los problemas que enfrentan las sociedades que envejecen. Se han identificado biomoléculas (incluidos los genes) relacionadas con el envejecimiento y pueden ser útiles en la investigación del envejecimiento; por ejemplo, la expresión de -galactosidasa y plolnk4a está asociada con la senescencia celular4-6, y un modelo de ratón que carece del gen klotho se conoce como un modelo de envejecimiento con varios fenotipos, que se asemejan al envejecimiento prematuro humano.

La parabiosis es la unión entre dos individuos que comparten un sistema vascular común, y puede generarse experimentalmente mediante cirugía8. Los experimentos con parabiosis, en los que se juntaron roedores jóvenes y viejos para compartir un sistema vascular común, demostraron que el proceso de envejecimiento en animales jóvenes se aceleraba, mientras que los animales viejos se rejuvenecían9-12. Los hallazgos sugieren fuertemente que ciertos factores relacionados con el rejuvenecimiento y el envejecimiento están presentes y circulan con la sangre en el sistema vascular; sin embargo, dichos factores circulantes aún no se conocen por completo.

Cistanche puede antienvejecimiento

Los microARN (miARN) son pequeños ARN no codificantes de 21-23-nucleótidos de longitud, que se procesan a partir de transcritos más largos (miARN primarios) mediante digestión, con un complejo de microprocesador en el núcleo y Dicer en el citoplasma, y ​​se incorporan a el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC)14,15. El miARN en RISC funciona como un mediador en el silenciamiento génico, donde se inhibe la traducción de los ARN mensajeros (ARNm) que tienen una complementariedad parcial con el miARN o se inhiben los ARNm que llevan secuencias casi complementarias al miARN. digeridol4,15.Extracto de Cistanche Anti RadiaciónPor lo tanto, los miARN juegan un papel importante en la regulación génica mediante la supresión de la expresión de su gen objetivo. Se han encontrado miles de genes de miARN en animales y plantas [consulte la base de datos de microARN (miRBase): http://www.mirbase.org/index.shtml]. Se ha examinado el perfil de expresión de los miARN y se ha detectado la expresión de miARN asociada a la enfermedad y la expresión específica de la etapa de desarrollo y del tejidol6-21. La regulación génica que involucra a los miARN está estrechamente relacionada con varias funciones vitales y fenómenos de la vida, incluidas las enfermedades14,16,21-24

Los miARN están presentes tanto en el exterior como en el interior de las células25. Por ejemplo, los miARN están presentes en la sangre como nucleótidos libres de células y circulan en el sistema vascular2627. Dichos miARN libres de células (cf-miARN) se incorporan en pequeñas vesículas llamadas vesículas extracelulares o se asocian con proteínas, lo que les protege de las nucleasas extracelulares25,28. La presencia de algunos cf-miRNA puede ser significativa; por ejemplo, se han detectado asociaciones significativas entre cf-miRNAs y ciertas enfermedades26,27,29-31. Los miRNAs cf pueden reflejar cambios en la condición física; por lo tanto, dichos miARN pueden ser biomarcadores potenciales para monitorear los sistemas de mantenimiento de la vida, así como las enfermedades.

El presente estudio se realizó para examinar las asociaciones entre los cf-miRNA y el envejecimiento, y se investigaron los cf-miRNA en la sangre de ratones jóvenes y ancianos. Los resultados revelaron cambios en los cf-miRNA entre sangre de ratón joven y envejecida. Entre tales miARN, miR-199-3p se redujo notablemente en la sangre envejecida en comparación con la sangre joven. Curiosamente, miR-19-3p tiene la capacidad de mejorar la diferenciación y regeneración muscular, y su administración a ratones de edad avanzada resultó en la expansión de la fibra muscular. Cuando se introdujo miR-199-3p en ratones mdx, un modelo animal de distrofia muscular de Duchenne (DMD), la fuerza muscular de los ratones mejoró notablemente. El presente estudio proporciona nuevos conocimientos sobre los cf-miRNA que circulan en la sangre en términos de envejecimiento, capacidad latente y aplicaciones médicas.

Resultados

Cell-free miRNAs in the blood of young and aged mice. We investigated cf-miRNAs in the blood of young (6-week-old) and aged (>Ratones C57BL/6J de 23-mes de edad, utilizando microarrays de ADN para identificar las diferencias relacionadas con la edad. El perfil de cf-miRNA exhibió marcadas diferencias entre ratones jóvenes y viejos, es decir, se detectaron cf-miRNA que están sesgados hacia la sangre de ratón joven y viejo (Tabla 1). De tales miARN, los miARN miogénicos (p. ej., miR-1 y miR-133)1833 estaban presentes en el grupo de miARN que abunda en la sangre joven; en otras palabras, los miARN miogénicos fueron notablemente menores en sangre envejecida (Tabla 1).hierba de cistancheLa diferencia en los miARN entre sangre joven y envejecida se confirmó mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR; Fig. la), y se reprodujo aún más utilizando fuentes de ARN extraídas de pequeñas vesículas, denominadas exosomas, aisladas del plasma ( Figura complementaria 1).

Los experimentos de cultivo celular, por otro lado, revelaron que el suero de ratón joven tenía la capacidad de inducir la diferenciación miogénica, y la capacidad era más fuerte que la de los ratones viejos (Fig. 1b). Se examinó el factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I), que es un factor principal capaz de inducir la diferenciación miogénica en la sangre34,35; sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre sangre joven y envejecida (Fig. lc). Por lo tanto, factores distintos al IGF-I en sangre joven pueden estar implicados en la diferenciación miogénica.

miR-199-3p es capaz de inducir fuertemente la diferenciación miogénica. Investigamos los efectos de los miARN abundantes en sangre joven sobre la diferenciación miogénica. Se introdujeron miméticos sintéticos de miARN en células C2C12, una línea celular de mioblastos de ratón, y se examinó la expresión de marcadores de diferenciación miogénicos, los genes de miogenina (Myog) y cadena pesada de miosina 1 (Myh1). Los resultados fueron inesperados y atrajeron nuestro interés: miR-199-3p, que se predijo como un miARN negativo debido a la poca información sobre la diferenciación miogénica, indujo notablemente la expresión de Myog y Myh1 (Fig. 2a, b). Además, la inducción de miR-199-3p fue más fuerte que la de los miARN miogénicos convencionales: la expresión de la cadena pesada de miosina en presencia de miR-199-3p fue particularmente notable (Fig. 2b, c).

Para aclarar la relación entre miR-199-3p y la diferenciación miogénica, investigamos miR-199-3p celular y extracelular (exosomal) durante la diferenciación miogénica, y también los efectos de los inhibidores de miR-199-3p sobre la diferenciación. La expresión de miR-199-3p endógeno (celular) aumentó después del inicio de la diferenciación. El miR-19-3p exosómico aumentó una vez y luego disminuyó (Fig. 2a complementaria). El tratamiento con inhibidores suprimió la expresión de marcadores de diferenciación miogénicos, Myog, Myh1 y creatina quinasa (Ckm) (Fig. 2b complementaria).crecimiento del pene cistanchePor lo tanto, los hallazgos sugieren que miR-199-3p participa en la diferenciación miogénica.

Diseño de mímicas miR-199. Diseñamos miR-199 miméticos de tal manera que los miméticos puedan producir miR-199-3p de manera eficiente como un mediador funcional (cadena guía) en el silenciamiento de genes. Los imitadores de miARN diseñados se seleccionaron y se seleccionó miR199#4 como imitador de miR-199 competente (Fig. 3 complementaria). Posteriormente, se utilizó miR199#4 en experimentos tanto in vivo como in vitro.

Genes diana de miR-199-3p en la diferenciación miogénica. Para identificar genes objetivo para miR-199-3p bajo diferenciación miogénica, buscamos genes candidatos de la base de datos TargetScan y nos enfocamos en los genes Lin28b y Suz12, los cuales se expresan en mioblastos C2C12. Lin28b y Suz12 poseen supuestas secuencias de unión a miR-199-3p en su región 3' no traducida (UTR; Fig. 3a). Demostramos que las supuestas secuencias son sitios de unión auténticos para miR-19-3p, utilizando los genes indicadores de luciferasa que llevan las secuencias de unión y las correspondientes secuencias no coincidentes (Fig. 3a, b). Los genes de luciferasa que portaban las supuestas secuencias de unión fueron significativamente suprimidos por miR-199-3p [pLin28b-(81), pLin28-(983) y pSuz12-(973)], mientras que el las secuencias no coincidentes, que poseen mutaciones de sustitución de base en la semilla [pLin28b-(81)mut, región, anularon su efecto de supresión [pSuz12-(973)mut]. pLin28-(983)mut, y Cuando se introdujeron miméticos miR-199 en las células C2Cl2, la expresión de Lin28b y Suz12 se suprimió constantemente (Fig. 3c). Para evaluar si la supresión de Lin28b y/o o Suz12 contribuye directamente a la diferenciación miogénica, la inhibición específica de Lin28b y Suz12 se llevó a cabo mediante silenciamiento génico, utilizando ARN de interferencia (ARNi; Fig. 3d, e). Como se esperaba, la expresión de marcadores de diferenciación miogénicos, como Ckm, Myh1 y Myog, se reguló al alza bajo el silenciamiento de los genes Lin28b y Suz12 (Fig. 3f, g).

Dado que Lin28b es una proteína de unión al ARN involucrada en el procesamiento de miRNAs3637, investigamos los efectos de miR-19 miméticos a través de Lin28b en el procesamiento de miARN miogénico. Se examinó el nivel de miR-1, un miARN miogénico principal, porque Lin28b37 regula el procesamiento de su precursor. El miR-1 maduro aumentó significativamente con el tratamiento mimético de miR-199 (Fig. 3h), lo que sugiere que miR-199-3p puede regular la expresión funcional de miR-1 a través de la supresión de su objetivo Lin28b. En conjunto, los hallazgos sugieren que miR-199-3p está involucrado en la diferenciación miogénica a través de la supresión de sus genes diana, Lin28b y Suz12.

Mejora de la regeneración muscular por miR199#4 en ratones con lesiones musculares.beneficios de la salsa cistancheExaminamos los efectos de un imitador de miR-199 (miR199#4) in vivo utilizando modelos de lesiones musculares (Fig. 4a, b). A ratones C57BL/6J de ocho semanas de edad se les inyectó BaClz en el tibial anterior (TA) para inducir lesiones musculares, y se administró miR19#4 en los sitios dañados 24 horas después. Dos días después de la administración de miR199#4, se examinó la expresión de genes marcadores miogénicos. La expresión de Myog aumentó significativamente y la diferenciación miogénica 1 (Myod1) y el factor miogénico 5 (Myf5) también aumentaron mediante la administración de miR199 # 4 (Fig. 4c). Los datos son consistentes con los resultados in vitro descritos anteriormente (Fig. 2).

El análisis inmunohistoquímico de los músculos en regeneración se realizó 9 días después de la administración de miR199#4. Se examinaron las áreas transversales de las fibras musculares en regeneración (miofibras), caracterizadas por núcleos centrales (Fig. 4b). El área transversal media de las miofibras en regeneración tratadas con miR199#4 fue mayor que la de las miofibras de control tratadas con un dúplex de ARN de control sin silenciamiento (nsCont; Fig. 4d), y la diferencia se acercó a la significación estadística. Además del área transversal media, el histograma dividido por tamaño del área transversal mostró un aumento en las miofibras agrandadas en presencia de miR199#4 (Fig. 4e).

Efecto hipertrófico de miR199#4 sobre fibras musculares envejecidas. Examinamos los efectos de miR199#4 en ratones envejecidos (~24 meses de edad). Los ratones envejecidos exhibieron una disminución significativa en el miR-199-3p muscular (Fig. 5a), como en el cf-miR-19-3p que circula en la sangre, en comparación con los ratones jóvenes. Administramos miR199 # 4 a los músculos TA de ratones envejecidos, y 2 días después, los músculos TA se examinaron mediante análisis inmunohistoquímico (Fig. 5b). El área transversal media de las miofibras tratadas con miR199#4 fue significativamente mayor que la de las miofibras de control tratadas con nsCont (Fig. 5c). De acuerdo con esto, el análisis de histograma dividido por tamaño reveló un marcado aumento en las miofibras agrandadas en presencia de miR199 # 4 (Fig. 5d).

Dado que el cf-miR-199-3p que circula en la sangre se reduce en ratones de edad avanzada, introdujimos miR199#4 en la sangre circulante de ratones de edad avanzada a través de la vena de la cola. Después de la administración intravenosa de miR19#4, se examinó y analizó el área transversal de las miofibras, como se describió anteriormente. Los resultados, como se muestra en la Fig. 5e, son consistentes con los resultados de la administración local de miR199#4 a músculos envejecidos (Fig. 5c, d).

Cabe señalar que existe una diferencia en las fibras musculares agrandadas entre el modelo de lesión muscular y los ratones envejecidos. Los núcleos centrales se ven en las fibras musculares en regeneración (Fig. 4b), pero tales miofibras apenas se detectaron en ratones viejos tratados con miR199 # 4 (Fig. 5b). Esto sugiere que las fibras musculares preexistentes pueden agrandarse en ratones de edad avanzada después del tratamiento con miR199#4. Presumimos que otro mecanismo diferente de la regeneración muscular podría estar involucrado en el agrandamiento de las miofibras en ratones de edad avanzada y propusimos la participación de la vía de la atrofia muscular.dosis de cistanche tubulosa redditLos genes Atroginl y MuRFI están estrechamente relacionados con la atrofia muscular38, y sus niveles de expresión son significativamente elevados en los músculos envejecidos en comparación con los músculos jóvenes (Fig. 6a). Examinamos el nivel de Atroginl y MuRFI en músculos de ratones de edad avanzada después de la administración sistémica de miR199#4. Atroginl y MuRFI se redujeron notablemente en varios músculos por la administración de miR19 # 4 (Fig. 6b), lo que sugiere que la supresión de la vía de atrofia muscular por miR199 # 4 puede causar la expansión de las miofibras en ratones de edad avanzada.

MiR199#4 retrasa la pérdida de fuerza muscular en ratones de edad avanzada. El efecto de miR199#4 sobre la función muscular en ratones de edad avanzada es de interés. La prueba de fuerza de agarre se realizó en ratones de edad avanzada antes y después de la administración sistémica de miR199#4. El experimento se realizó de manera doble ciego; la inyección de ARN y la prueba de agarre del 100 por ciento fueron realizadas por diferentes experimentadores sin compartir información. A los ratones macho C57BL/6 (80-semanas de edad) se les hizo una prueba de agarre, luego, 1 semana más tarde, se les inyectó por vía intravenosa miR199#4 y nsCont, y se les hizo una prueba de agarre nuevamente. El cambio en la fuerza muscular después de la inyección de miR199#4 fue que MiR199#4 mejora la fuerza muscular de los ratones mdx. Dado que miR199#4 tiene un impacto positivo en los músculos, llevamos a cabo un experimento para evaluar el efecto de la administración de miR199#4 en ratones mdx, un modelo animal bien conocido de DMD32. A ratones mdx de ocho semanas de edad se les inyectó por vía intravenosa miR199#4 (1,6 mg/kg) dos veces (intervalo de 1 semana), y la prueba de agarre se llevó a cabo 1 semana después de la última administración. El experimento se realizó de manera doble ciego como se muestra en la Fig.7. Los resultados (Fig. 8a) muestran una mejora significativa en la fuerza muscular en ratones mdx tratados con miR199#4 en comparación con ratones mdx tratados con nsCont. Además, se observaron disminuciones significativas en la actividad de la creatina quinasa (CK) y miR libre de células-1 en la sangre de ratones mdx tratados con miR199#4 (Fig. 8b, c), que son posibles signos de la enfermedad. mejora.

Como reactivo de administración de fármacos, el atelocolágeno es viscoso y difícil de manejar, y los ratones tratados con atelocolágeno parecían sufrir efectos negativos debido al vehículo. Por lo tanto, buscamos alternativas al atelocolágeno para mejorar nuestro sistema de administración de fármacos (DDS) y encontramos liposomas catiónicos DC-CHOL/DOPE como un nuevo reactivo DDS que es igual o superior al atelocolágeno (Fig. 4 complementaria). La distribución del fármaco de miR199#4 con los liposomas catiónicos mostró que el miR19#4 administrado se administró al músculo y se absorbió consistentemente en grandes cantidades en el hígado (Figura 5 complementaria). El miR199#4 extracelular administrado al músculo puede funcionar como un mediador en el silenciamiento de genes y contribuir a la regulación de genes involucrada en la mejora de la fuerza muscular.

Intentamos identificar biomoléculas relacionadas con la mejora después de la administración de miR199#4. Se examinaron varios polipéptidos relacionados con DMD mediante transferencia de Western; sin embargo, en este estudio no se detectaron señales distintas relacionadas con la mejora (Fig. 6 complementaria). Hablaremos más sobre este punto en la siguiente sección.

Discusión

Las biomoléculas cambian cualitativa y cuantitativamente con el envejecimiento--3. Captar tales cambios y estudiarlos es vital para comprender el envejecimiento y puede revelar estrategias para abordar los problemas de las sociedades que envejecen. Los estudios de parabiosis en los que se unen animales jóvenes y viejos para compartir un sistema vascular común han proporcionado información importante sobre el envejecimiento y el rejuvenecimiento9-l2. Los hallazgos sugieren fuertemente que existen factores de rejuvenecimiento y envejecimiento en la sangre circulante joven y envejecida, respectivamente. Estudios previos reportaron varias moléculas como candidatas relacionadas con el rejuvenecimiento y el envejecimiento, pero los resultados son controvertidos3.

Nuestros experimentos de cultivos celulares in vitro que utilizan sueros jóvenes y envejecidos son similares a los experimentos de parabiosis (Fig. lb), y encontramos miR-199-3p, que cambia con la edad, en la sangre circulante; Se identificó que el miARN disminuyó significativamente en la sangre envejecida (Tabla 1 y Fig. la). Además, la expresión de miR-199-3p muscular (celular) disminuye notablemente en los músculos envejecidos en comparación con los músculos jóvenes (Fig. 5a); por lo tanto, cf-miR-199-3p en la sangre puede correlacionarse con miR-199-3p muscular. La disminución de la expresión de miR-199-3p con el envejecimiento también se observa en las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea del macaco rhesus39. Por lo tanto, la expresión de miR-19-3p celular puede estar bajo control relacionado con la edad. A diferencia de miR-19-3p, la expresión de miARN miogénicos celulares, como miR-1 y miR-133, permanece sin cambios en los músculos jóvenes y envejecidos (Fig. 5a), pero el nivel de sus miARN extracelulares en la sangre se reduce notablemente en ratones de edad avanzada (Fig. la). La diferencia entre miR-199-3p y los miARN miogénicos (miR-1 y-133) puede reflejar la diferencia en el procesamiento de cf-miRNA y/o en el control relacionado con la edad de los cf-miRNA entre ellos . Para dilucidar esta diferencia, es necesario realizar más estudios en el futuro.

Estudios anteriores sugirieron que miR-199-3p participa en varias funciones celulares y fenómenos vitales a través de la supresión de sus genes diana; por ejemplo, el miRNA puede promover la proliferación y la migración de las células de la punta endotelial y modular el inicio de la pubertad, respectivamente, a través de la regulación a la baja del gen-3A de la semaforina objetivo40 y a través de la supresión de los genes diana (Cdc42, Map3k2, Map3k4 y Taok1) implicada en la vía p38MAPK41. El presente estudio ha encontrado que miR-19-3p está involucrado en la diferenciación miogénica a través de la supresión de sus genes diana, Lin28b y Suz12 (Fig. 3). Lin28b es una proteína de unión al ARN e inhibe la maduración de los miARN, incluido miR-1, que es un miARN específico del músculo y promueve la miogénesis37. La supresión de Lin28b por miR-19-3p provoca un aumento en miR maduro-1 (Fig. 3), lo que puede permitir que prosiga la diferenciación miogénica.

Suzl2 es una subunidad central del complejo represivo 2 de Polycomb (PRC2), que participa en la represión de la cromatina42. La regulación génica de PRC2 está involucrada en el mantenimiento de las células madre, el desarrollo embrionario, la proliferación y diferenciación celular, incluida la diferenciación miogénica42. PRC2 está presente en loci silenciosos específicos del músculo, como Myog y la creatina quinasa muscular (MCK) en mioblastos indiferenciados, pero está disociado de tales loci en miotubos diferenciados43. El silenciamiento de genes contra Suz12 por RNAi provoca la mejora de la expresión de genes miogénicos (Fig. 3). La supresión del potenciador de la proteína homóloga 2 de zeste (Ezh2), otra subunidad central de PRC2, también provoca la diferenciación miogénica44. Estos hallazgos sugieren que la inhibición de la formación de PRC2 debido a la supresión de sus subunidades centrales puede desencadenar la creación de un estado genómico para la diferenciación muscular. Por lo tanto, la supresión de Suz12 por miR-199-3p puede inducir la diferenciación miogénica. En conjunto, miR-19-3p puede desempeñar un papel importante en la diferenciación miogénica a través de la inhibición de dos vías independientes que involucran a Lin28b y Suzl2, cada una de las cuales está involucrada en el mantenimiento del estado indiferenciado de los mioblastos.

El efecto de miR-199-3p en la diferenciación miogénica también se ha demostrado in vivo (Fig. 4). El daño muscular desencadena la proliferación y diferenciación celular debido a la regeneración muscular. La introducción de miR199#4, que suministra miR-199-3p, a los sitios dañados mejoró la regeneración muscular y expandió las miofibras regeneradoras (Fig. 4). La expresión de genes miogénicos se reguló constantemente bajo el tratamiento con miR199 # 4 (Fig. 4). Desde un punto de vista práctico, miR199#4 podría ser efectivo y útil para tratamientos quirúrgicos.

Cuando se administró miR199#4 a ratones de edad avanzada que carecían de miR-199-3p circulante en la sangre, los ratones exhibieron miofibras marcadamente expandidas (Fig. 5) y una pérdida retardada de la fuerza muscular con el envejecimiento (Fig. 7). Las miofibras expandidas en ratones envejecidos difieren de las miofibras en regeneración, que se agrandan en presencia de miR199#4; el primero se deriva de miofibras preexistentes, y el segundo es de neo-miofibras (miofibras recién nacidas). Por lo tanto, existen diferentes mecanismos independientes en los agrandamientos de las fibras musculares. Nuestro estudio sugiere que (i) en el primer caso, la inhibición de la atrofia muscular debido a la supresión de Atroginl y MuRFI por el tratamiento con miR199#4 provoca el agrandamiento de las miofibras envejecidas, y (ii) en el último caso, la supresión de los genes diana, Lin28b y Suz12, provoca el agrandamiento de las miofibras en regeneración. En conjunto, diferentes (múltiples) genes regulados por miR-19-3p pueden estar involucrados en la hipertrofia muscular en diferentes situaciones. Los hallazgos también sugieren que miR-199-3p puede tener al menos un efecto antienvejecimiento en el músculo, y que miR199#4 que suministra miR-199-3p puede tener potencial como un nuevo medicamento de ARN para enfermedades musculares relacionadas con la edad. como la sarcopenia.

Basándonos en la alta eficacia de miR199#4 en los músculos, administramos miR199#4 a ratones mdx, un modelo DMD bien conocido, y obtuvimos resultados notables: la administración sistémica de miR199#4 mejoró la fuerza muscular en los ratones en ~20 por ciento ( Figura 8a). Para comprender el mecanismo de recuperación de la fuerza muscular, intentamos identificar biomoléculas que fueron mejoradas (o influenciadas) por miR-199-3p. Sin embargo, con la excepción de las mejoras de CK en sangre y cf-miR-1 (Fig. 8b, c), no pudimos detectar dichas mejoras a nivel molecular. Esta dificultad en la detección puede deberse a la compleja población celular, que consiste en una mezcla de células musculares en regeneración y alteración en ratones mdx. Incluso si miR199#4 da como resultado la mejora, el alto ruido de fondo causado por la población celular compleja enmascararía la evidencia de la mejora. Para resolver este problema, es necesario realizar estudios más extensos que utilicen una población de células musculares homogéneas derivadas de ratones mdx o que se centren en varios tejidos, incluido el músculo.

Aunque el mecanismo molecular de la recuperación de la fuerza muscular por miR199#4 sigue siendo desconocido, la dosis de miR19#4 para mejorar la fuerza muscular es digna de mención. La administración dos veces de ~1,6 mg/kg de miR199#4 mejoró la fuerza muscular en ratones mdx. La dosis efectiva parece ser más baja que la de los oligonucleótidos antisentido para la omisión de exón contra genes mutantes de distrofina in vivo45-47. La razón por la que miR199#4 es capaz de mejorar la fuerza muscular en dosis tan bajas puede deberse a su diferente mecanismo de acción en comparación con los oligonucleótidos antisentido. El mecanismo de acción de miR19#4 es el silenciamiento génico catalítico. Por el contrario, el mecanismo de los oligonucleótidos antisentido se basa en la hibridación física. Por lo tanto, las diferencias en las dosis apropiadas para demostrar la eficacia del fármaco pueden atribuirse a los diferentes mecanismos de acción.

El mecanismo por el cual los órganos, tejidos o células liberan miARN en la sangre circulante aún no se comprende por completo, y la regulación relacionada con la edad sobre la liberación de dichos miARN tampoco está clara. El presente estudio mostró que los cf-miR-NA miogénicos, incluido el cf-miR-199-3p, circulan con la sangre en el sistema vascular y disminuyen con el envejecimiento. Dichos cf-miRNA pueden estar presentes en los exosomas, es decir, son miRNA exosómicos.

Los miARN miogénicos participan en la diferenciación miogénica, la regeneración muscular y el mantenimiento de la homeostasis muscular33. Estudios previos informaron que se observó que los miARN miogénicos, como miR-1 y miR-133, aumentan en la sangre en respuesta al ejercicio físico4849. Según estos informes, los ratones jóvenes activos pueden liberar más miARN miogénicos en la sangre que los ratones viejos de movimiento lento, y tales miARN extracelulares, incluido cf-miR-199-3p, pueden contribuir a mantener la homeostasis muscular en ratones jóvenes a través de la acción autocrina . Sin embargo, el nivel de miARN extracelular (exosomal) no siempre se correlaciona con el nivel de miARN celular, y se han observado diferencias en los miARN miogénicos y miR-199-3p entre ratones jóvenes y viejos (Figs. la y 5a) y durante diferenciación miogénica (Fig. 2a complementaria). Por lo tanto, como otra posibilidad, es concebible que la regulación de la formación de exosomas relacionada con la edad y la diferenciación pueda afectar la producción de cf-miRNA; específicamente, puede haber diferencias en la formación de exosomas entre ratones jóvenes y viejos. En el contexto de estas hipótesis, se necesitan más estudios para dilucidar la liberación de miARN miogénicos en la sangre relacionada con la edad.

Además del mecanismo de liberación, cuando los cf-miARN miogénicos jóvenes que contienen cf-miR-199-3p fluyen hacia el sistema de circulación sanguínea envejecido desde un sistema vascular joven por parabiosis, los cf-miARN podrían desencadenar la activación muscular y la inhibición de la actividad muscular. atrofia en el lado envejecido; este concepto está respaldado por la evidencia de ratones viejos inyectados por vía intravenosa con miR19#4 en este estudio (Figs. 5-7). Los miARN cf en la sangre pueden estar relacionados con la función homeostática relacionada con la edad y podrían representar una homeostasis alterada. Cuando dichos cf-miRNA están presentes ectópicamente, por ejemplo, cuando los cf-miRNA en sangre joven se transfieren al sistema circulatorio sanguíneo envejecido, algunos cf-miRNA pueden mostrar efectos rejuvenecedores en el lado envejecido, es decir, pueden producir efectos antienvejecimiento. Por el contrario, los cf-miRNA en sangre envejecida pueden representar una homeostasis alterada con el envejecimiento. Cuando tales cf-miRNA se transfieren al sistema de circulación sanguínea joven, algunos cf-miRNA pueden desencadenar un deterioro relacionado con el envejecimiento y pueden causar un envejecimiento prematuro en el lado joven. Los miARN cf que aumentan significativamente en la sangre envejecida representan candidatos que requerirán un análisis mecánico detallado para comprender y prevenir el envejecimiento.

En conclusión, nuestro estudio actual ha proporcionado nuevos conocimientos sobre los cf-miRNA como moléculas relacionadas con la edad y reveló una nueva dirección de investigación para aclarar la relación entre el envejecimiento y los RNA funcionales libres de células, incluidos los cf-miRNA.

Este artículo está extraído de BIOLOGÍA DE LAS COMUNICACIONES|(2021) 4:427|https://doi.org/10.1038/s42003-021-01952-2|www.nature.com/commsbio