El alto contenido de ácido ent-11 -hidroxi-15-oxo-kaur-16-en-19-oico en extracto de hoja de Adenostemma Lavenia (L.) O. Kuntze: con ensayo preliminar in vivo

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Akie Hamamoto, Ryosuke Isogai, Miwa Maeda, Masumi Hayazaki, Eito Horiyama, Shigeo Takashima, Mamoru Koketsu y Hiroshi Takemori *

Resumen:Antecedentes: Ent-ácido 11 -hidroxi-15-oxo-kaur-16-en-19-oico(11 OH-KA) es un bioquímico multifuncional que se encuentra en algunos helechos, Pteris semipinnata, y sus especies congéneres. Aunque se han propuesto varias aplicaciones terapéuticas de la 11 OH-KA (p. ej., anticancerígena, antiinflamatoria yblanqueamiento de la piel), el contenido de 11 OH-KA en estos helechos no es alto. Adenostemma lavenia (L.)O. También se ha informado que Kuntze, una Asteraceae, contiene 11 OH-KA. La decocción (extracto de agua caliente) de plantas enteras de A. Lavenia se usa como remedio popular para los trastornos inflamatorios, como la ashepatitis y la neumonía, lo que sugiere que el 11 OH-KA puede ser el ingrediente responsable de las propiedades medicinales de esta planta. Métodos: Las actividades antimelanogénicas de los extractos acuosos de A. Se compararon hojas de Lavenia y Pteris dispar Kunze (un cognado de P. semipinnata) en células de melanoma B16F10 de ratón. La cantidad de11 OH-KAse midió usando espectrometría de cromatografía líquida. Se trataron ratones C57BL/6J con extracto acuoso de hoja de A. Lavenia y se midió la concentración en sangre de 11 OH-KA. La eficacia in vivo del extracto acuoso de A. Lavenialeaf se evaluó en función de su actividad antimelanogénica mediante el control del color del cabello. Resultados:Aunque ambos extractos (A. Lavenia y P. dispar Kunze) mostraron altas actividades antimelanogénicas, solo A. Lavenia contenía una alta cantidad de 11 OH-KA, aproximadamente el 2,5 por ciento del peso seco de la hoja.11 OH-KA se puede purificar a partir de hojas de A. Lavenia en dos pasos: extracción de agua seguida de distribución de cloroformo. El tratamiento de ratones con el extracto acuoso de la hoja de A. Lavenia suprime la pigmentación de sus pelos. Conclusiones: A pesar del pequeño número de ratones examinados, el presente resultado preliminar de la supresión de la pigmentación del cabello sugiere que el extracto acuoso de la hoja de A. Lavenia y el ingrediente que posiblemente sea responsable de esto, 11 OH-KA, son nuevos materiales para cosméticos orales. los resultados también pueden ser útiles en el desarrollo futuro de alimentos funcionales y métodos para tratar a pacientes que sufren trastornos de hiperpigmentación, como el melasma.

Palabras clave: 11 -hidroxi-15-oxo-kaur-16-en-19-ácido oico; anti-melanogénesis; blanqueamiento de la piel;comida funcional; planta medicinal; Adenostemma Lavenia; Pteris dispar Kunze;tirosinasa; Melanoma B16F10

Cistanche inhibe la actividad de la tirosinasa

1. Introducción

Estudios sobre reactivos antimelanogénicos parablanqueamiento de la piely el antienvejecimiento se han vuelto más frecuentes, especialmente para los ingredientes de los alimentos (frutas, verduras y hierbas medicinales) [1]. Se han desarrollado y comercializado varios polifenoles y terpenos y sus fuentes como alimentos funcionales y suplementos.

El diterpeno/kaureno ent-11 -hidroxi-15-oxo-kaur-16-en-19-ácido oico (11 OH-KA), que se encuentra en las hojas de los helechos (Pteris semipinnata [2– 5], Pteris livida [6]) y Compositae (Gochnatia decora [7]), también es un candidato atractivo para los reactivos antimelanogénicos [5]. A pesar de sus amplias actividades fisiológicas (p. ej., anticancerígenas y antiinflamatorias) [8–11], solo hay unos pocos registros sobre la eficacia in vivo de 11 OH-KA, incluido su potencial antimelanogénico, probablemente debido a su rareza. y número restringido de fuentes.

Los estudios de relación estructura-actividad, tanto in vitro como en células cultivadas, han identificado los restos en 11 OH-KA importantes para ejercer sus actividades funcionales (Figura 1). Sustitución del grupo carboxi en la posición 19 en11 OH-KApor grupos metilo o hidroxi convierte este compuesto en un compuesto con altas actividades anticancerígenas, lo que indica que el 19-grupo carboxilo debilita la toxicidad celular de este compuesto [5,10,12]. Por el contrario, el grupo alqueno en la posición 16, el grupo cetona en la posición 15 y el grupo hidroxi en la posición 11 mejoran las actividades apoptóticas al activar la vía de señalización de Caspasa [10,12]. Sin embargo, estos restos no son indispensables para las señales de muerte celular de los kaurenos. Los requisitos estructurales para la actividad antiinflamatoria son similares a los de la actividad anticancerígena, lo que sugiere una diafonía a través de dianas celulares comunes, como el factor nuclear kappa B (NF-κB) [12].

tirosinasaes una enzima limitante de la velocidad en la síntesis de melanina [13,14]. La enzima cataliza reacciones secuenciales: la conversión de tirosina a l-3,4-dihidroxifenilalanina, l-dopa y luego a dopaquinona. Hemos informado que el 11 OH-KA inhibe la expresión del gen de la tirosinasa, que resulta en una supresión demelanogénesisen células de melanoma de ratón B16F10 [5]. Los restos de 11 -hidroxi,15-oxo y 16-en en 11 OH-KA son indispensables para suanti-melanogénesisactividad, que es una característica diferente de los requisitos estructurales de 11 OH-KA en comparación con otras actividades, tales como actividades anticancerígenas o antiinflamatorias.

Por lo tanto, en términos de su actividad antimelanogénica, el 11 OH-KA es un compuesto único entre los kaurenos. Desafortunadamente, Pteris dispar Kunze, nuestra fuente anterior de11 OH-KA, contenía solo una pequeña cantidad de este compuesto [5], y este helecho, así como P. semipinnata (un cognado) [4,15], no tiene registro de uso en sujetos humanos. Además, en todos los experimentos anteriores, se usaron solventes orgánicos (metil o alcohol etílico, cloroformo o hexano) para extraer 11 OH-KA, sin ningún registro del uso de extracción acuosa.

Hace casi 40 años, un grupo estadounidense descubrió el 11 OH-KA y sus derivados en AdenostemmaLavenia (L.) O. Kuntze (una Asteraceae) [16]. Aunque A. Lavenia no ha sido suficientemente estudiada con respecto al riesgo de posibles contaminantes (p. ej., contaminantes inorgánicos [17] y metabolitos secundarios producidos por hongos [18,19]) en hojas y otras partes, el polvo de toda la planta (llamado Ma Zhi Hu) se vende en los Estados Unidos con el permiso de médicos (los productos se pueden obtener de QualiHerb, Cerritos, CA, EE. UU.: Materiales complementarios Figura S1). Por lo tanto, en este estudio, al medir la11 OH-KAy evaluando la eficacia de sus actividades antimelanogénicas, examinamos el potencial de un extracto acuoso de la hoja de A. Lavenia para uso en cosmética interna, así como una nueva categoría de alimentos funcionales [20–22] que pueden usarse para tratar pacientes que padecen trastornos de hiperpigmentación tales como melasma. Hasta la fecha, sólo el ácido tranexámico (un fármaco hemostático) ha estado disponible como fármaco interno para los trastornos de hiperpigmentación [23,24].

Informamos aquí que las hojas de A. Lavenia contienen 11 OH-KA en niveles altos (aproximadamente 2.5 por ciento del peso seco de las hojas). El extracto acuoso de la hoja de A. Lavenia suprime eficazmentemelanogénesisen células B16F10, y11 OH-KApuede ser responsable del 50 por ciento de las actividades antimelanogénicas del extracto acuoso. El tratamiento oral de ratones con el extracto acuoso de la hoja de A. Lavenia da como resultado la supresión de la pigmentación de su cabello.

2. Materiales y métodos

2.1. Propagación de A. lavenia

Dado que A. lavenia figura como una especie en peligro de extinción en la mayoría de las áreas de Japón, cultivamos esta planta en un campo cerca de nuestro laboratorio. A. lavenia se propagó por división a partir de 10 plántulas, y en este estudio se utilizaron casi 100 g de hojas secas cosechadas entre junio y julio de 2019.

2.2. Purificación de 11 OH-KA a partir de extractos acuosos y su análisis

Se adquirió 11 -OH KA puro (auténtico) de BioBioPha (Shanghai, China). El polvo de hojas secas (100 mg) obtenido de las hojas de A. lavenia o P. dispar Kunze se remojó en 1 ml de agua destilada (para una extracción de 10-volumen) durante 12 h, y los residuos se eliminaron por centrifugación a 12, 000 rpm durante 10 min. Los extractos resultantes se analizaron mediante cromatografía líquida (LC) de alto rendimiento (HP) utilizando una columna C18 ODS (4,6 mm × 50 mm: RP-18 GP, Kanto Kagaku, Tokio, Japón) con un gradiente que va desde el 40 por ciento metanol/agua hasta 100 por ciento de metanol durante 10 min. La detección de 11 -OHKA se realizó determinando la absorción ultravioleta (UV) a 245 nm (A245). Para las extracciones de 20-,30- y 50-volumen, se extrajeron 50 mg, 33 mg y 20 mg de polvo de hojas secas con 1 ml de agua destilada.

Para confirmar la estructura de {{0}}OH KA en A. lavenia, se purificó ácido kaurenoico a una escala semigrande. Se extrajo un total de 100 g de hojas secas de A. lavenia dos veces de 20 volúmenes de agua, se añadió un volumen equivalente de CHCl3 al extracto acuoso de las hojas y se recuperó 11 -OH KA de la fase de CHCl3. Durante la evaporación de la fase de CHCl3 recuperada, se precipitó 11 -OH KA en forma de cristales blancos. Estos cristales fueron recuperados por un filtro de papel. Los cristales recuperados se analizaron por resonancia magnética nuclear (RMN) (1H-RMN (CDCl3) δ 0,95 (3H, s), 1,28 (3H, s), 1,05–2,22 (15H, m), 2,37 (1H, d, J { {27}},9 Hz), 3,06 (1H, s amplia), 4,06 (1H, d, J=4,6 Hz), 5,27 (1H, s) y 5,87 (1H, s)). El espectro de 1H-RMN del cristal coincidía con el auténtico espectro 11 -OH KA (consulte la Figura S2 de Materiales complementarios).

2.3. Análisis de 11 OH-KA en suero de ratón

Los métodos para los análisis de espectrometría de masas (MS) de ultra rendimiento LC (UPLC) se extrajeron de varios métodos utilizados en [25,26]. Brevemente, para tratar ratones (C57BL/6J), se extrajeron hojas de A. lavenia con 30 volúmenes de agua. Después de la esterilización a 120 ◦C durante 20 min, el extracto se diluyó adicionalmente con 2 volúmenes de agua y se sirvió como agua de bebida. Para examinar la farmacocinética de 11 -OHKA, se administraron por vía oral 100 mg/kg del compuesto suspendido en Tween 80 al 1 por ciento (Kanto Kagaku, Tokio, Japón). La sangre se recuperó a través de la vena de la cola entre 15 y 240 minutos después de la administración.

Para medir el {{0}}OH KA en sangre de ratón, se extrajo el suero (20 µL) con 200 µL de acetonitrilo. Para normalizar la eficacia de la extracción, se añadieron al suero 10 nmol de 18 -ácido glicirretínico (Kanto Kagaku) ​​antes de la extracción. Después de eliminar el acetonitrilo por evaporación, los compuestos se disolvieron en 5 µL de metanol seguido de la adición de 5 µL de H2O. Luego, se utilizó 1 µL de solución para espectrometría LC-MS (MS: Waters Xevo G2-XS QTof, Waters, Milford, MA). Para separar 11 -OH KA, se utilizó una columna C18 ODS (3,0 mm × 150 mm (5 µm): RP-18 GP, Kanto Kagaku) ​​y se aplicó un gradiente que varió desde 35 por ciento de acetonitrilo/agua hasta 100 por ciento de acetonitrilo durante 10 min. Las condiciones de MS fueron las siguientes: capilar (kV), 2,20; núcleo de muestreo, 45; cono de extracción, 4.0. Debido a que no pudimos detectar fragmentos de 11 -OH KA a través de análisis de MS/MS (Figura de materiales complementarios S3A),11 -OH KA se cuantificó solo con señales de MS al monitorear la relación masa-carga (m/ z) de 331,1879 con la ruta de 0,01 Da (Figura de materiales complementarios S3B). Se preparó una curva estándar mediante la adición de 11 -OH KA (a una concentración final de 0,1 a 3 µM) al 50 % de metanol/agua que se había preparado a partir de suero normal de ratón usando el mismo procedimiento para 11 -OH Extracción de KA. El ácido 18 -glicirretínico se midió mediante LC-UV en las mismas condiciones utilizadas para la medición de 11 -OH KA. Estos experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Experimentos con Animales de la Universidad de Gifu (H30-041). Utilizamos un número mínimo de ratones para cumplir con los requisitos de bienestar animal.

2.4. Ensayo de melanogénesis

Células de melanoma B16F10 de ratón de la Colección Americana de Cultivos Tipo (RIKEN, Tsukuba, Japón) se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM-Alta glucosa (4,5 g/L d-glucosa), WAKO, Kioto, Japón) y se complementaron con un 10 por ciento suero bovino fetal y antibióticos. Las células se incubaron en atmósfera húmeda con 5 por ciento de CO2 a 37 ◦C y se transfirieron cada dos días mediante tripsinización a nuevas placas de cultivo.

Las células (2 × 105) se sembraron en una placa de pocillos 6-y se incubaron durante 12 a 16 h antes de la inducción demelanogénesis. La melanogénesis se indujo con forskolina (Fsk) 20 µM junto con extracto de agua de A. lavenia o 11 -OH KA durante 48 h. Las mediciones de melanina se realizaron de acuerdo con la literatura [5]. Brevemente, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato y se recuperaron en tubos de recolección de 2 ml, seguido de centrifugación a 8000 rpm durante 1,5 min. Cada sedimento celular se suspendió en 200 µL de agua destilada y se usaron 50 µL para medir el contenido de proteínas. Los 150 µL residuales se mezclaron con 150 µL de NaOH 2 M y luego se lisaron mediante incubación a 45 ◦C durante 2 h. La melanina se extrajo con una mezcla de cloroformo-metanol 2:1 y se midió con espectrofotómetro (Glomax Multi, Promega, Madison, WI, EE. UU.) a 405 nm. La concentración de proteína de los sedimentos celulares se determinó usando un reactivo de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) y se usó para la normalización del contenido de melanina.

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2.5. Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de Student cuando los datos se obtuvieron durante el mismo experimento. No usamos análisis estadísticos si los experimentos se realizaron en días diferentes o si el número de muestra era solo dos.

3. Resultados

3.1. A. Lavenia contiene una gran cantidad de 11 OH-KA

Anteriormente informamos que el extracto etanólico de hojas de P. disper Kunze, preparado con 10 volúmenes de peso seco (v/w) de etanol, inhibió de manera eficientemelanogénesisen células B16F10, incluso después de una dilución 1/1000 [5]. Para comparar la eficacia de los extractos acuosos de hojas secas de A. lavenia y la de los extractos acuosos de hojas de P. disper Kunze, preparamos los extractos (20 volúmenes de agua (v/w hojas secas)) y los añadimos al medio de cultivo juntos. con forskolina (inductor de melanogénesis—agonista de acAMP). Ambos extractos inhibieron eficientemente la síntesis de melanina incluso a una dilución de 1/1000, cuando se evaluó visualmente el contenido de melanina (Figura 2A). El contenido de melanina se midió después de la extracción con NaOH (Figura 2B). A una dilución de 1/3000, el extracto de A. lavenia disminuyó el contenido de melanina en un 69 por ciento en comparación con el control (solo Fsk), y el extracto de P. disper Kunze disminuyó el contenido de melanina en un 41 por ciento. A una dilución de 1/1000, el extracto de A. lavenia redujo completamente el contenido de melanina, mientras que los extractos de P. disperKunze redujeron el contenido de melanina en un 60 %. Esta diferencia no se observó cuando los extractos se diluyeron al 1/300.

Los análisis LC-UV sugirieron que11 OH-KAfue el componente principal en el extracto de agua de A. lavenia (Figura 2C, izquierda). Por el contrario, no se detectó ningún pico claro para 11 OH-KA cuando el P. Se analizó el extracto de dispersión de Kunze (Figura 2C, derecha). Los análisis de LC-MS sugirieron que el pico indicado por una flecha correspondía a 11 OH-KA (datos no mostrados). Estos resultados indican que el 11 OH-KA podría ser el principal componente responsable demelanogénesisinhibición en extracto de A. lavenia, mientras que derivados como las formas glicosiladas [5] podrían contribuir preferentemente a la inhibición de melanina en P. extracto de dispersión de Kunze.

A continuación, tratamos de purificar11 OH-KApor distribución CHCl3 pudo extraer 11 OH-KA del extracto acuoso de A. lavenia anterior con alta pureza (más del 87 por ciento) (Figura 2D, izquierda). Los espectros de los análisis de RMN de la sustancia cristalizada en CHCl3 fueron idénticos a los del auténtico 11 OH-KA (ver Materiales y Métodos). Por el contrario, se extrajo una gran cantidad de compuestos desconocidos del extracto acuoso de P. disper Kunze (Figura 2D, derecha). En la Figura 2E se indica un resumen de los análisis de LC, lo que sugiere que A. lavenia es una fuente atractiva de 11 OH-KA.

3.2. Extracción adecuada de 11 OH-KA de A. lavenia

De acuerdo con la información encontrada en Internet, todas las partes (hoja, tallo y raíz) de A. lavenia se usan como hierbas medicinales en China y Taiwán. Para determinar las mejores condiciones para la extracción de 11 OH-KA de A. lavenia, primero examinamos qué porciones de la planta son ricas en este compuesto. Los extractos de agua se prepararon a partir de hojas solas o de partes aéreas. losmelanogénesisEl ensayo en las células B16F10 mostró que el extracto preparado a partir de las partes aéreas (tallos y hojas) tenía menos actividad antimelanogénica que el preparado a partir de las hojas solas (Figura 3A, izquierda). Esto sugiere que los tallos (que representan más del 90 por ciento del peso seco) contienen menos11 OH-KA, que fue confirmado por los análisis LC-UV (Figura 3A, derecha).

A continuación, examinamos cuántos volúmenes de agua se deben utilizar para la extracción. Aparentemente, un pequeño volumen de agua (10-veces) podría enriquecer11 OH-KA(Figura 3B). Especulamos que la baja solubilidad del 11 OH-KA en agua podría ayudar a retener este compuesto en los residuos. Se observó una recuperación máxima de 11 OH-KA en agua cuando se utilizaron más de 30 volúmenes de agua (Figura 3C). Por lo tanto, considerando la máxima recuperación y enriquecimiento de 11 OH-KA en agua, utilizamos 30 volúmenes de agua en experimentos posteriores.

En China y Taiwán, A. lavenia se extrae en agua caliente, a través de la cual se examinó la estabilidad térmica de 11 OH-KA. Los extractos acuosos se incubaron a 90 ◦C o 120 ◦C durante 10 o 20 min y se analizó el contenido de 11 OH-KA por LC-UV. Estos tratamientos térmicos produjeron una gran cantidad de sedimentación, que probablemente consistía en proteína desnaturalizada. los11 OH-KAlos contenidos en la fracción soluble aparentemente aumentaron (Figura 3D), lo que podría ser el resultado de la remoción de estos materiales sedimentados.

3.2.1. OH-KA es el compuesto en el extracto de agua de A. Lavenia responsable de la actividad antimelanogénica en las células B16F10

Cuando se extrajo 1 g de la hoja en 30 volúmenes de agua, el contenido de 11 OH-KA fue de aproximadamente 0,6 mg/mL (1,8 mM). Para determinar el grado de la contribución de11 OH-KAen el extracto acuoso de A. lavenia para la actividad antimelanogénica, se probaron diferentes concentraciones de 11 OH-KA auténtico en células B16F10. El examen visual (Figura 4A) y la medición del contenido de melanina (Figura 4B) revelaron que los extractos de agua (Figura 4A, conjunto superior) que mostraron la misma eficacia en términos de actividad antimelanogénica que el 11 OH-KA auténtico solo (Figura 4A, conjunto inferior) contenía sólo la mitad de la cantidad de11 OH-KA. Estos resultados sugieren que el 11 OH-KA en el extracto contribuyó a casi el 50 por ciento de la actividad antimelanogénica del extracto. El otro 50 por ciento podría derivarse de derivados de 11 OH-KA, como las formas de glucósidos, lo que también podría explicar el bajo contenido de 11 OH-KA en el P. extracto de disper Kunze a pesar de su alta eficacia en términos de actividad antimelanogénica (Figura 2).

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3.2.2. OH-KA es el compuesto del extracto de A. lavenia responsable de la actividad antimelanogénica en ratones

Para obtener resultados preliminares para el desarrollo futuro de A. lavenia como material para cosméticos, realizamos análisis in vivo utilizando un pequeño número de ratones. Primero examinamos la farmacocinética de 11 OH-KA en ratones. La ingesta de agua fue de aproximadamente 4 ml diarios en ratones con aproximadamente 25 g de peso corporal. La solubilidad máxima del 11 OH-KA en el extracto acuoso de A. lavenia (ver Figura 3C, 20–30 volúmenes de agua: 0,6 mg/mL) teóricamente podría proporcionar una concentración de 100 mg/kg dosis diaria de este ácido kaurenoico (4 ml de 0,6 mg/ml de 11 OH-KA se convirtieron en 2,4 mg/día; la normalización de 2,4 mg por peso corporal del ratón (25 g) dio como resultado 96 mg/kg). Por lo tanto, decidimos tratar a los ratones con 100 mg/kg11 de OH-KA (suspendidos en 200 µL de Tween 80 al 1 por ciento).

tratamiento oral con11 OH-KAresultó en su rápida aparición (dentro de 15 min) en la sangre (Figura 5A). La concentración alcanzó y retuvo una dosis efectiva en las células B16F10. Este resultado indica que el 11 OH-KA podría absorberse a través del tracto digestivo. Sin embargo, el hecho de que la concentración disminuya dentro de los 60 minutos sugiere una rápida excreción de este compuesto.

A continuación, examinamos los efectos crónicos de 11 OH-KA en ratones. Dado que incluso 0.6 mg/mL de 11 OH-K precipita rápidamente en el agua potable si11 OH-KAera puro, decidimos probar el extracto acuoso de A. lavenia. Sin embargo, el extracto acuoso de A. lavenia podría contener ingredientes desconocidos con un sabor amargo. Por lo tanto, el extracto tuvo que diluirse más con dos volúmenes de agua (con un valor final de0.3 mg/mL para 11 OH -KA, aproximadamente 50 mg/kg/día). Los ratones fueron tratados con los extractos de agua durante 1 semana y luego se recogieron sus muestras de sangre (Figura 5B). Los análisis de LC-MS detectaron 11 OH-KA en la sangre a una concentración semiefectiva. También se examinó el extracto acuoso de P. dispar Kunze que había sido preparado por el mismo procedimiento que el extracto acuoso de A. lavenia. El contenido de 11 OH-KA en la sangre de los ratones tratados con el extracto de P. dispar Kunze fue 10 veces menor que el de los ratones tratados con el extracto de A. lavenia.

En ratones adultos, el crecimiento del cabello se detiene durante la etapa telógena durante varios meses, y un nuevo crecimiento (anágeno) ocurre al azar durante solo unos pocos días en diferentes áreas [27]. Por lo tanto, para examinar el efecto demelanogénesisinhibidores, la duración del tratamiento con compuestos (inhibidores) debe ser larga (por ejemplo, varios meses). Por el contrario, los pelos suaves se reemplazan sincrónicamente con pelos adultos durante la fase de 3–4-semanas de edad (W). Por lo tanto, cuando los ratones 3W se tratan con inhibidores durante 2 semanas, los efectos sobremelanogénesispuede evaluarse a partir de la pigmentación (color) del cabello recién crecido (es decir, el primer cabello adulto) a 5W–6W [28].

Cuando los ratones fueron tratados con extracto de A. lavenia a través del agua potable durante dos semanas (3W-4W), su pigmentación se suprimió en los pelos recién crecidos (Figura 5C). Por el contrario, su pigmentación ocular no se vio afectada. La supresión de la pigmentación del cabello no se observó en los ratones tratados con el extracto de P. dispar Kunze. Estos resultados sugieren que el extracto de hoja de A. lavenia podría contener sustancias anti-melanogénicas, posiblemente 11 OH-KA, que son efectivas in vivo, mientras que la P. extracto de hoja de dispar Kunze, probablemente rico en11 OH-KAderivados, podrían no ser efectivos in vivo.

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4. Discusión

Descubrimos que las hojas de A. lavenia contienen una gran cantidad de 11 OH-KA (aproximadamente el 2,5 por ciento del peso seco de la hoja). El agua extrajo eficientemente el 11 OH-KA, a pesar de la naturaleza hidrófoba de este compuesto. Como el 11 OH-KA en agua se mantuvo estable a 120 ◦C durante 20 min, esterilizamos el extracto acuoso de A. hoja de lavenia y se la administró a ratones. Los resultados confirmaron la presencia de11 OH-KAen la sangre de los ratones y la potencia del extracto acuoso como reactivo antimelanogénico in vivo.

La presencia de 11 OH-KA y sus derivados en A. lavenia se informó en 1979 [16] y 1990 [29]. Desde entonces, solo un estudio de Indonesia ha informado un análisis exhaustivo de los ingredientes en A. lavenia [30]. Sin embargo, no se identificó 11 OH-KA en esos materiales. Además, no se han encontrado estudios sobre las propiedades físicas del 11 OH-KA, que se puede extraer con agua pura de A. lavenia.

Un artículo de revisión sobre remedios caseros en la India se refiere al extracto de agua de A. lavenia como tratamiento para los trastornos del sistema digestivo [31]. Una búsqueda en Internet de "A. lavenia" o su nombre chino sugirió algunos usos beneficiosos de esta planta como medicina herbaria antiinflamatoria a través de un extracto de agua caliente (es decir, como decocción) (p. ej., para hepatitis, inflamación pulmonar (alergia y enfermedad obstructiva crónica) enfermedad pulmonar) e inflamación de la piel). Sin embargo, no se encontraron informes formales sobre las actividades biológicas de los extractos de A. lavenia o el estado ecológico de esta planta en PubMed. En nuestra ciudad (Gifu, Japón), A. lavenia está catalogada como especie en peligro de extinción. La rareza de A. lavenia puede dificultar el análisis y el desarrollo de su potencial como medicina herbaria y alimento funcional.

Por otra parte, el potencial beneficioso de11 OH-KA, purificada de P. semipinnata, ha sido determinada in vitro e in vivo [8–11]. Aunque no examinamos el contenido de 11 OH-KA en P.semipinnata, suponemos que este contenido puede no ser muy alto en comparación con el de A. lavenia porqueP. semipinnata está estrechamente relacionado con P. disper Kunze. Además, no existen registros sobre el uso de estos helechos en sujetos humanos, ni siquiera en Internet. Estos antecedentes sugieren que A. lavenia puede tener un mayor potencial como medicamento a base de hierbas que estos helechos si se demuestra que el 11 OH-KA tiene potencial clínico.

Estudios sobre el potencial de11 OH-KAse han centrado en sus actividades como agente anticancerígeno [2,10,11,32] y antiinflamatorio [11,33]. Sin embargo, también es cierto que las dosis de 11 OH-KA requeridas para estas actividades son superiores a 20 µM, lo cual es relativamente alto. Por el contrario, a una concentración de menos de 1 µM, el kaureno ent-11 -hidroxi-16-Karen-15-ona, que tiene un grupo metilo en la posición19-en lugar del carboxilo grupo en 11 OH-KA, muestra una alta actividad apoptótica contra los monocitos humanos HL-60 [12]. Estas diferencias sugieren que la posición 19-puede ser un factor determinante de la toxicidad celular [5].

Aunque se encuentran actividades antitumorales y antiinflamatorias en una variedad de kaurens [7,34–36], la característica específica de 11 OH-KA es un tipo de actividad antimelanogénica [5]. Se ha descubierto que varios compuestos naturales, como los flavonoides y los terpenoides, modulanmelanogénesisalterando la expresión del factor de transcripción de microftalmía (MITF), que es esencial para los programas melanogénicos [13,14]. A diferencia de estos compuestos, no se han encontrado moduladores de MITF en los ácidos kaurens orkaurenoic.

11 OH-KAsuprime la expresión de latirosinasagen mediante la regulación negativa de su actividad promotora. Aunque 11 OH-KA no altera la expresión o los niveles de actividad de MITF, 11 OH-KA suprime la actividad del promotor del gen de la tirosinasa de una manera dependiente del elemento de unión a MITF [5]. Curiosamente, la sobreexpresión de MITF en células B16F10 da como resultado una cancelación de la supresión mediada por 11 OH-KA de la actividad del promotor de tirosinasa, lo que sugiere que 11 OH-KA puede reclutar un represor desconocido para el elemento de unión a MITF. Además, el mecanismo por el cual 11 OH-KA suprimetirosinasala actividad del promotor puede ser diferente de la que conduce a la citotoxicidad porque la actividad antimelanogénica se observa incluso cuando las células B16F10 se tratan con 1,2 µM de 11 OH-KA (Figura 4).

La investigación que involucra un modelo tridimensional de piel humana compuesto de queratinocitos y melanocitos primarios sugiere que el uso tópico de 1 mM de11 OH-KAsuprime por completo la pigmentación de la piel [5]. En términos de actividad antimelanogénica, 1 mM de 11 OH-KA equivale a aproximadamente 6,6 mg/mL (0,66 por ciento) de hoja seca de A. Lavenia (Figura 3). En este contexto, A. Lavenia es una atractiva fuente de artículos cosméticos parablanqueamiento de la piel. Además, A. Lavenia se usa como medicina popular, y el 11 OH-KA tiene un amplio margen entre sus dosis efectivas (concentraciones) para la actividad antimelanogénica y la citotoxicidad.

Es importante destacar que se ha descubierto que el ácido tranexámico (un fármaco hemostático) suprime el depósito de melanina en la piel humana y se utiliza como medicamento oral para tratar el melasma [23,24]. Curiosamente, el pelaje de los ratones tratados con ácido tranexámico cambió de color de negro a marrón [37]. En el presente estudio, también hemos demostrado que un extracto acuoso de la hoja de A. Lavenia puede suprimir eficazmente la pigmentación del cabello (de negro a marrón) en ratones cuando se administra por vía oral, lo que sugiere que la hoja de A. Lavenia podría desarrollarse tanto en cosméticos internos como en alimentos funcionales [20– 22] para pacientes que sufren de melasma. Se necesitan más estudios sobre los objetivos celulares de los extractos de A. Lavenia y11 OH-KA, así como su seguridad.

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