Los efectos blanqueadores de la piel de la ectoína a través de la supresión de la melanogénesis estimulada por -MSH y la activación de las vías antioxidantes Nrf2 en queratinocitos irradiados con UVA

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You-Cheng Hseu 1,2,3,4, Xuan-Zao Chen 1, Yugandhar Vudhya Gowrisankar 1, Hung-Rong Yen 3,4,5,6, Jing-Yuan Chuang 7 y Hsin-Ling Yang 8,*

Resumen:La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) inducida por radiación ultravioleta A (UVA) media el excesomelanogénesisen las células de la piel que conducen a la pigmentación. Demostramos los efectos despigmentantes y antimelanogénicos de la ectoína, un osmolito bacteriano natural, en queratinocitos humanos irradiados con UVA (HaCaT), y se dilucidaron los mecanismos moleculares subyacentes. Las células HaCaT se trataron previamente con bajas concentraciones de ectoína (00,5–1,5 µM) y se analizaron para determinar varios parámetros despigmentantes y antimelanogénicos. Este tratamiento previo redujo significativamente la generación de ROS, la producción de hormona estimulante de melanocitos (-MSH) y la expresión de proopiomelanocortina (POMC) en células HaCaT irradiadas con UVA. También,antioxidantehemo oxigenasa-1 (HO-1), NAD(P)H deshidrogenasa [quinona 1] (NQO-1) y subunidad catalítica de glutamato-cisteína ligasa (-GCLC) se expresaron mediada a través de la translocación nuclear del factor nuclear eritroide2-relacionado con el factor 2 (Nrf2) cuya caída de hecho perjudicó este efecto, lo que significa la importancia de la vía Nrf2. La ectoína mediaba en la activación de Nrf2 a través de las vías p38, proteína quinasa B (también conocida como AKT), proteína quinasa C (PKC) y caseína quinasa II proteína quinasa (CKII). El medio acondicionado obtenido de las células HaCaT pretratadas con ectoína e irradiadas con UVA reguló a la baja latirosinasa, proteína relacionada con tirosinasa-1 y -2 (TRP-1/-2), proteína cinasa de AMP cíclico (c-AMP), proteína de unión al elemento c-AMPresponse (CREB ), y expresiones del factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF) que dan lugar a células de melanoma B16F10 que han inhibido la síntesis de melanina. Curiosamente, este efecto anti-melanogénico en las células B16F10 estimuladas con -MSH fue observable solo en concentraciones de ectoína de 50–400 µM, lo que significa el papel clave que desempeña la piel de queratinocitosina tratada con ectoína (0,5–1 µM).blanqueoefectos Llegamos a la conclusión de que la ectoína podría utilizarse como un eficaz agente cosmético natural tópico con eficacia despigmentante y antimelanogénica.

Palabras clave:ectoína; queratinocitos;melanogénesis; tirosinasa; -MSH; Nrf2

Cistanche tiene un efecto antioxidante.

1. Introducción

La exposición de la piel humana a la radiación UVA desencadena la generación de ROS y también la sobreproducción de melanina en las células de la piel. La producción descontrolada de ROS también podría conducir a condiciones de melanoma. La mayoría de los agentes para blanquear la piel se enfocan y tratan de minimizar elmelanogénesisproceso a través de la inhibición de -MSH ytirosinasaproducciones [1]. La mayoría de las cremas para aclarar el tono de la piel están compuestas de hidroquinona [2] o hidrocortisona [3], que se sabe que reducen la formación de melanina, pero también se asocian con efectos secundarios graves. Por ejemplo, acné, piel escamosa y con picazón, decoloración azul y negra de la piel, ocronosis, ardor y escozor, irritación de la piel e incluso inflamación. Sin embargo, la pielblanqueoTambién se informa que los agentes de fuentes naturales, por ejemplo, el ácido kójico (un derivado fúngico obtenido de especies de Penicillium y Aspergillus) causan 'dermatitis de contacto' en personas que tienen piel sensible. En estas personas, más del 1 por ciento de ácido kójico podría causar efectos secundarios graves de hipersensibilidad [4,5]. Por lo tanto, solo unas pocas pieles de origen naturalblanqueoactualmente se utilizan en la industria cosmética [6]. Sin embargo, los productos para el cuidado de la piel que se enfocan principalmente en las propiedades despigmentantes a veces no se han enfocado en contrarrestar los efectos nocivos planteados por el exceso de producción de ROS inducida por la radiación UVA.melanogénesisen las células de la piel.

La ectoína es un 'extremolito natural' producido a partir de varias especies de microorganismos en condiciones de estrés [7,8]. Este compuesto se aisló por primera vez de la especie de bacteria Ectothiorhodospira que vive en el desierto egipcio. La cascada de genes del operón ect (ectA, ectB, ectC o ectD) está involucrada en la producción de este compuesto. La ectoína se designa químicamente como ácido 1,4,5,6-tetrahidro-2-metil-4-pirimidincarboxílico [9]. Como aglutinante de la humedad, la ectoína ayuda a la reestructuración de la membrana celular de la piel [10], la protección contra el daño y la contaminación de los rayos UV [11,12], la hidratación de la piel [13], el retraso del envejecimiento prematuro de la piel [14], etc. Además de las funciones protectoras de la piel, la ectoína ha demostrado ser útil en el tratamiento de la dermatitis atópica [15], el Alzheimer [16], así como en la inhibición de la replicación del VIH [17], la radio y la quimioterapia [18] y la cirrosis hepática [ 19]. Se especula que la ectoína exhibe sus propiedades despigmentantes y blanqueadoras de la piel sin causar efectos secundarios indeseables [20]. Por el contrario, no se conocen los mecanismos moleculares provocados por la ectoína. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue delinear los mecanismos despigmentantes y antimelanogénicos mediados por ectoína provocados en queratinocitos humanos (HaCaT) irradiados con UVA como sistema modelo celular. El efecto de las secreciones inducidas por ectoína de los agentes protectores de la piel de las células HaCaT al medio de cultivo (medio acondicionado) también se probó utilizando una línea de células de melanoma típicas (B16F10).

2. Materiales y métodos

2.1. Reactivos y Anticuerpos

La ectoína (Producto nº: 81619, pureza mayor o igual al 95 por ciento) se adquirió de Sigma-Aldrich (Taufkichen, Alemania). Se compraron suero bovino fetal (FBS), penicilina/estreptomicina, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y l-glutamina de Invitrogen/Gibco BRL (Carlsbad, CA, EE. UU.). L-DOPA, melanina, 3-4,5-dimetil-2-il-2,5-bromuro de difeniltetrazolio (MTT) y -MSH se adquirieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.). N-acetilcisteína (NAC) y 20,70-diclorofluoresceína-diacetato (DCFH2-DA) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Todos los inhibidores farmacológicos necesarios para JNK (SP600125), ERK1/2 (PD98059), p38 (SB203580), PKC (GF109203X) y CKII se obtuvieron de Calbiochem (La Jolla, CA, EE. UU.) Se obtuvo el inhibidor de PI3K/AKT (LY294002) de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Todos los anticuerpos para POMC, CREB, -actina,tirosinasa, Nrf2, p-CREB, NQO-1, PKC, proteína asociada a ECH similar a Kelch-1 (Keap-1) y TRP-1, TRP-2 se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Alemania). Los anticuerpos contra -GCLC y HO-1 se obtuvieron de Gene Tex Inc. (San Antonio, TX, EE. UU.). Obtuvimos anticuerpos contra la proteína quinasa c-AMP y CKII de Abcam (Cambridge, MA, EE. UU.). Las histonas, MITF, p-p38, p38, p-AKT y AKT se obtuvieron de Cell Signal Technology (Beverly, MA, EE. UU.). Los reactivos de detección de quimioluminiscencia mejorada (ECL) se obtuvieron de Millipore, (Billerica, MA, EE. UU.). Todos los demás reactivos (de grado HPLC) se adquirieron de Sigma-Aldrich o Merck & Co., Inc. (Darmstadt, Alemania).

2.2. Cultivo de células

Obtuvimos células inmortalizadas de queratinocitos de piel humana HaCaT y melanoma murino B16F10 de Cell Line Services (CLS, Eppelheim, Alemania) y American Type Culture Collection (ATCC, VA, EE. UU.). Las células se cultivaron en DMEM suplementado con FBS activado por calor al 10 %, estreptomicina/penicilina al 1 % y L-glutamina 2 mM en una incubadora humidificada suplementada con CO2 al 5 % a 37 ◦C.

2.3. Tratamientos celulares e irradiación UVA

Antes de la irradiación con UVA, las células se trataron previamente con ectoína (00,5–1,5 µM durante 24 h) o vehículo (PBS). Después de la incubación, las células lavadas con PBS se expusieron a radiaciones UVA de 3 J/cm2 (durante 27 min, λmax, 365 nm, sin emisiones detectables por debajo de 320 nm) utilizando el UV CROSS-LINKER CL-508 (UVItec, Cambridge, Reino Unido) [21].

2.4. Ensayo de ROS intracelular

Las células HaCaT se sembraron a una densidad de 1,5 × 105 en una cámara Teck de 8-bien que contenía DMEM complementado con un 10 % de FBS y se cultivaron hasta un 80 % de confluencia. Estas células se trataron primero con ectoína 1,5 µM, seguido de exposición a radiación UVA de 3 J/cm2 durante el tiempo prescrito. Las células se lavaron con PBS y se utilizó el método DCFH2-DA para determinar la producción de ROS intracelular. usando el software de solución de Olympus Software para cada condición [21].

2.5. Cuantificación de melanina

En una 6-placa de pocillos, se sembraron células B16F10 de melanoma murino a una densidad de 2,5 × 105 células/pocillo. Se pretrataron con 100, 200 y 400 µM de ectoína durante 2 h en ausencia o presencia de -MSH (1 µM). El protocolo utilizado para la cuantificación de melanina siguió un método previamente descrito [21]. Medimos el contenido de melanina con el lector de microplacas ELISA con una longitud de onda de absorbancia de 470 nm.

la cistanche inhibe la melanina.

2.7. mancha occidental

Se pretrataron células HaCaT (1 × 106 células/placa de 10 cm) o B16F10 (1 × 106 células/placa de 10 cm) con concentraciones variables de ectoína (0,5, 1 y 1,5 µM) o -MSH (1 µM) seguido de irradiación en ausencia o presencia de UVA durante el tiempo prescrito. Se recogieron las células lavadas con PBS, se aisló el contenido de proteína (nuclear y citosólica) después del tratamiento. Luego, las células fueron sometidas al método Western blot utilizado previamente para la determinación de expresiones de diversas proteínas nucleares y citosólicas [21].

2.8. Extracción de ARN y RT-PCR

Las células HaCaT pretratadas con ectoína (1,5 µM, 24 h) se sometieron al reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad) para el aislamiento del ARN total de estas células. Se utilizó 1 µg de ARN total y los reactivos suministrados por el kit Taq de platino SuperScript-III One-Step RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad) en el experimento de PCR con el instrumento Bio-Rad iCycler PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. Estados Unidos). Los cebadores directo e inverso para Nrf2 utilizados fueron: F: 50-AAACCAGTGGATCTGCCAAC-30,R-50-GCAATGAAGACTGGGCTCTC-30. Los cebadores directo e inverso para GAPDH utilizados fueron: F: 50-GCATCCTGGGCTACACTGA-30, R: 50-CCACCACCCTGTTGCTGTA-30. Al final del experimento, el producto de PCR se analizó usando gel de agarosa al 1 por ciento. Luego, se visualizó con tinción con bromuro de etidio. Como control interno, utilizamos GAPDH [22].

2.9. Ensayo de inmunofluorescencia

Las células HaCaT se cultivaron a una densidad de 1 × 104 células/pocillo en suplemento DMEM con 10 % de FBS en una cámara 8-well Lab Tek (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Pretratamos las células con ectoína 1,5 µM durante el tiempo indicado seguido de irradiación en ausencia o presencia de UVA. Las células se sometieron a un ensayo de inmunofluorescencia, que utiliza un método descrito previamente [21].

2.10. Análisis estadístico

Usamos la media ± desviación estándar (media ± DE) para todos los resultados utilizados en este estudio. Todos los datos se analizaron con un análisis de varianza (ANOVA), seguido de la prueba de Dunnett para comparaciones por pares y presentados como media ± DE de tres o más experimentos independientes. La significación estadística se estableció en * p < 0.05;="" **="" p="">< 0.01;="" ***="" p="">< 0.001="" en="" comparación="" con="" células="" de="" control="" no="" tratadas,="" y="" #="" p="">< 0,05;="" ##="" p="">< 0,01;="" ###="" p="">< 0,001="" en="" comparación="" con="" las="" células="" hacat="" expuestas="" a="" uva="" o="" las="" células="" b16f10="" tratadas="" con="">

3. Resultados

3.1. La ectoína inhibió la generación de ROS inducida por UVA en células HaCaT

Primero, probamos los efectos citotóxicos de la ectoína (Figura 1A) en células HaCaT irradiadas con UVA. Nuestros datos de MTT indicaron que, en comparación con las células de control no tratadas, la ectoína pretratada (0.5–1.5 µM) y las células HaCaT expuestas a 3 J/cm2 UVA no pudieron mostrar una disminución significativa en la viabilidad celular (Figura 1B). Además, el pretratamiento con ectoína atenuó la muerte celular inducida por UVA (3 J/cm2) de manera dependiente de la dosis (Figura 1B). Además de nuestros datos de fluorescencia, que indicaron que, en comparación con las células de control, la radiación UVA de 3 J/cm2 y los tratamientos con ectoína sola (1,5 µM) aumentaron significativamente los niveles de ROS 5- y 2-veces, respectivamente. Sin embargo, en el caso de los niveles de ROS pretratamiento con ectoína se redujeron significativamente y podemos inferir que la ectoína tiene unantioxidanteefecto contra la radiación UVA. Esto también induce niveles basales de ROS en células HaCaT (Figura 1C, D).

3.2. Expresiones de POMC y -MSH suprimidas con ectoína en células HaCaT irradiadas con UVA

Los queratinocitos expuestos a UVA fueron estimulados por su POMC mediada por ROS-p53 y también por una pequeña hormona peptídica -MSH que se deriva de POMC [23]. Por lo tanto, determinamos las alteraciones en los patrones de expresión de -MSH, POMC y otras proteínas asociadas en células HaCaT pretratadas con ectoína y luego las expusimos a UVA (3 J/cm2). Los datos de Western blot indicaron que la regulación al alza inducida por UVA de las expresiones de -MSH y POMC se reguló a la baja mediante el pretratamiento con ectoína; mientras que el tratamiento con ectoína sin radiación UVA ha inhibido completamente las expresiones -MSH y POMC de las células HaCaT no irradiadas (Figura 2A). Más tarde, probamos el efecto del 'medio acondicionado' (placa de 10 ml/100 mm), obtenido de las células HaCaT pretratadas con ectoína e irradiadas con UVA, en elmelanogénesisde células de melanoma B16F10. La figura 2B muestra este medio condicionado regulado a la baja.tirosinasa, TRP-1, TRP-2, niveles de proteína quinasa c-AMP, p-CREB, CREB y MITF en células B16F10.

3.3. Expresión de melanina y tirosinasa regulada negativamente por ectoína en células B16F10 estimuladas por -MSH

Las células de melanoma B16F10 se sometieron primero a las concentraciones más altas de ectoína y se determinó el efecto de la citotoxicidad usando el ensayo MTT. La Figura 3A muestra que la ectoína no tuvo un impacto significativo en la viabilidad de las células B16F10 en concentraciones más altas (100–400 μM durante 72 h). Sin embargo, la viabilidad celular no se vio afectada a las 24 y 48 h del tratamiento con ectoína (datos no mostrados). Por lo tanto, estas concentraciones se utilizaron para determinar el efecto de la ectoína sobre la estimulación de -MSHmelanogénesisen células B16F10. Los datos de cuantificación de melanina mostraron que, en comparación con las células de control, el tratamiento con -MSH (1 μM) solo aumentó significativamente los niveles de melanina en más del 25 por ciento. Sin embargo, en comparación con el tratamiento con -MSH solo, las células expuestas a concentraciones crecientes de ectoína (100–400 μM a las 72 h) disminuyeron significativamente y de manera dependiente de la dosis el porcentaje de contenido de melanina con una regulación descendente máxima de solo el 85 por ciento (o -15 por ciento que las células no tratadas). control) se observó a 400 μM de pretratamiento con ectoína (Figura 3B). Además, nuestros datos de Western blot también mostraron que -MSH estimulótirosinasa(24 h) y p-CREB (2 h) las expresiones se regularon significativamente a la baja con concentraciones crecientes de pretratamientos con ectoína en estas células de melanoma (Figura 3C).

3.4. La ectoína reguló al alza la expresión de las proteínas HO-1, NQO-1 y -GCLC en células HaCaT

Para determinar el efecto del tiempo en la translocación nuclear mediada por ectoína de Nrf2 y la subsiguiente expresión aguas abajo de las proteínas HO-1, NQO-1 y -GCLC, se expusieron células HaCaT a ectoína 1,5 µM y se recolectaron las proteínas celulares. 0.5, 1, 2, 4, 8 o 12 h después del tratamiento con Ectoína. Los datos de Western blot indicaron que, a excepción de la proteína -GCLC, la ectoína 1,5 µM provocó la expresión máxima de las proteínas HO-1, Nrf2 y NQO-1 en el punto temporal de 4 h. -GCLC se mostró en un punto de tiempo de 8 h (Figura 5A). Los datos obtenidos de la curva de tiempo nos llevan a probar el efecto de la concentración de ectoína en la expresión deantioxidanteproteínas en un punto de tiempo de 4 h. La Figura 5B muestra que las tres proteínas antioxidantes exhibieron la expresión máxima a una concentración de ectoína de 1,5 µM. Más tarde, se probaron los efectos del pretratamiento con ectoína en la expresión de la relación Nrf2 y Keap-1 en las células HaCaT irradiadas con UVA. El análisis de datos occidentales indicó que el pretratamiento con 1,5 µM de ectoína mostró un aumento en la proporción de Nrf2/Keap-1 en células HaCaT irradiadas con UVA (Figura 5C). También vimos datos consistentes con el aumento de la expresión de NQO -1, HO-1 y proteínas -GCLC en células HaCaT pretratadas con ectoína que se irradiaron con 3 J/cm2 UVA (Figura 5D). Estos datos infieren que el pretratamiento con ectoína juega un papel protector en las células HaCaT irradiadas con UVA.

3.5. Varias vías de señalización estuvieron involucradas en la activación de Nrf2 en células HaCaT tratadas con ectoína

Determinamos las vías de señalización involucradas en la translocación nuclear mediada por ectoína de Nrf2. Las células HaCaT se trataron previamente con inhibidores farmacológicos de las vías de señalización PI3K/AKT, ERK, p38, JNK, PKC, ROS y CKII, seguidas de ectoína 1,5 μM. Los datos de transferencia Western de Nrf2 nuclear mostraron que las vías p38 MAPK, PI3K/AKT, PKC y CKII estaban involucradas en este mecanismo (Figura 6A). A partir de la información obtenida, también determinamos el efecto del pretratamiento con ectoína sobre el papel que juegan estas vías en la expresión de proteínas antioxidantes. La Figura 6B muestra que la inhibición farmacológica de las vías MAPK, p38, PI3K/AKT, CKII y PKC reguló a la baja la expresión de NQO-1, HO-1 y -GCLCantioxidanteProteínas en células HaCaT. Además, el tiempo necesario para la fosforilación de AKT, p38 y la expresión de PKC y CKII durante la exposición a la ectoína indica que, a excepción de la p-AKT, la fosforilación de p38 y las expresiones de PKC y CKII tuvieron lugar en el último momento. puntos de tiempo solamente (después de 30 min) (Figura 6C). En el caso de AKT, se observó fosforilación desde el punto de tiempo de 15 min que alcanzó un pico a los 30 min (Figura 6C). En el caso de AKT, se observó fosforilación desde el punto de tiempo de 15 minutos que alcanzó un pico a los 30 minutos (Figura 6C). Nrf2 que conduce a la expresión de proteínas antioxidantes.

3.6. El efecto antimelanogénico mediado por ectoína se suprimió debido a la eliminación de Nrf2

El papel de Nrf2 en la lucha contra la ectoína mediada pormelanogénesisse determinó silenciando el Nrf2 en células HaCaT. Los datos del Western blot indicaron que las células eliminadas de Nrf2 expuestas a ectoína 1,5 μM mostraron una expresión mínima de NQO-1, HO-1 y -GCLCantioxidanteproteínas (Figura 7A). Más tarde, probamos el efecto de la eliminación de Nrf2 en la expresión de los niveles de -MSH en células HaCaT irradiadas con UVA (3 J/cm2). Los resultados de Western blot indicaron que para controlar las células transfectadas con siRNA, la radiación UVA fue significativa en la regulación al alza de la expresión de los niveles de -MSH en células no expuestas a ectoína (Figura 7B). Sin embargo, la ectoína 1,5 μM ha suprimido este efecto. Para el otro caso, las células transfectadas con siNrf2 mostraron una disminución en la expresión de los niveles de -MSH tanto en las células no tratadas como en las tratadas (Figura 7B). De manera similar a los datos de -MSH, nuestros datos de fluorescencia también indicaron que la irradiación UVA aumentó significativamente la producción de ROS en células de siRNA de control no tratadas con ectoína (Figura 7C, D). Sin embargo, este efecto se suprimió significativamente cuando las células se expusieron a ectoína 1,5 µM. Por otro lado, las células HaCaT transfectadas con Nrf2 e irradiadas con UVA mostraron un aumento de aproximadamente 8-veces en los niveles de ROS en comparación con las células transfectadas con Nrf2 que no fueron irradiadas con UVA pero expuestas al tratamiento con ectoína (Figura 7C, D). Todos estos datos significan el papel protector mediado por ectoína que desempeña Nrf2 en la minimización de la producción de melanina en células HaCaT irradiadas con UVA. . Todos estos datos significan el papel protector mediado por ectoína que desempeña Nrf2 en la minimización de la producción de melanina en las células HaCaT irradiadas con UVA.

beneficio de la cistanche: blanqueamiento de la piel

4. Discusión

varias pieles-blanqueoagentes están en uso en la industria cosmética. Muchos de estos agentes tienen un origen químico y sufren las limitaciones de causar varios efectos secundarios, incluidos los cánceres [24–26]. Por lo tanto, la identificación de agentes blanqueadores de la piel seguros y naturales representa la necesidad del momento. Se sabe que la ectoína (Figura 1A) se utiliza como ingrediente activo en cremas faciales y otros agentes cosméticos. Esto actúa como un agente hidratante de la piel y también se considera que retrasa el envejecimiento prematuro de la piel [27]. Casi todos los agentes blanqueadores de la piel conocidos tienen como objetivo la regulación a la baja detirosinasaactividad enzimática en células irradiadas con UV que disminuye lamelanogénesisen células de la piel. Yao et al. demostró lablanqueopropiedades de la ectoína biosintetizada y sugirió que es un agente blanqueador aputativo. En su estudio, probaron la alta concentración (500 µM) de ectoína para determinar su efecto blanqueador en líneas celulares de melanoma de ratón (B16F0) y melanoma humano (A2058) y concluyeron que la ectoína es un agente seguro y agente potencial para la aplicación cosmética y clínica [20]. Sin embargo, en este estudio, probamos más los efectos beneficiosos de bajas concentraciones de ectoína (0,5–1,5 µM) en células HaCaT irradiadas con UVA y se descifraron los mecanismos moleculares subyacentes. En nuestro estudio, se demostró que la ectoína, a través de la vía Nrf2/ARE, no solo ha inducido la expresión del gen antioxidante, sino que también ha regulado a la baja los niveles de -MSH en células HaCaT irradiadas con UVA a través de la supresión de POMC. Una disminución en los niveles de -MSH se correlacionó con la regulación a la baja de la actividad de la enzima tirosinasa que conduce a una disminución en la producción de melanina. Según nuestro conocimiento, este es el primer informe que se evidenció por el mecanismo provocado por la ectoína en las células HaCaT irradiadas con UVA. Este estudio delineó los mecanismos moleculares exhibidos por la ectoína en las células HaCaT como el sistema modelo celular.

Primero determinamos las concentraciones subletales de ectoína, así como el efecto de la radiación UVA sobre la viabilidad de las células HaCaT. Nuestros datos de MTT indicaron que las bajas concentraciones de ectoína (0.5–1.5 µM) no tuvieron un efecto significativo en la viabilidad de las células HaCaT (Figura 1B). El pretratamiento con ectoína aumentó la viabilidad de las células HaCaT irradiadas con UVA 3 J/cm2 (Figura 1B). Sobre la base de estas observaciones, continuamos nuestros experimentos adicionales utilizando 1,5 µM de pretratamiento con ectoína e irradiación UVA en dosis de 3 J/cm2.

La producción de ROS inducida por la radiación UVA en los queratinocitos de la piel es un hecho bien conocido [28]. Por lo tanto, también probamos cualquier efecto beneficioso del pretratamiento con ectoína en la producción de ROS inducida por radiación UVA en células HaCaT. Nuestros datos de intensidad de fluorescencia DCF indicaron que el pretratamiento con 1,5 µM de ectoína reguló significativamente a la baja la producción de ROS inducida por radiación UVA en queratinocitos. También se pudo observar que 1,5 µM de ectoína podría causar un aumento del nivel basal en los niveles de ROS en las células HaCaT que demostraron ser estadísticamente significativos (Figura 1D, E).

Rousseau et al. informó que POMC es secretado por queratinocitos y melanocitos epidérmicos humanos y ha estimuladomelanogénesis[29]. Teniendo esto en cuenta, también probamos el efecto de la radiación UVA y los tratamientos previos con ectoína en las proteínas asociadas a la melanogénesis en las células HaCaT. Nuestros datos de Western blot indicaron que la regulación a la baja dependiente de la dosis de la expresión de proteínas -MSH y POMC en células HaCaT irradiadas con UVA fue causada por el pretratamiento con ectoína. Por el contrario, el pretratamiento con ectoína tiene un efecto diferencial en el patrón de expresión demelanogénesis-Proteínas asociadas. En particular, casi todas las proteínas analizadas (tirosinasa, TRP-1, TRP-2, c-AMP proteinquinasa, CREB y MITF) mostraron expresiones disminuidas con concentraciones crecientes de ectoína pretratamiento en células HaCaT irradiadas con UVA (Figura 2A, B). Estos datos indican el hecho de que la ectoína posee propiedades antimelanogénicas en las células HaCaT irradiadas con UVA.

La eficacia antimelanogénica de la ectoína se probó más a fondo en células B16F10, una línea celular de melanoma bien conocida que se usa enmelanogénesisestudios [30]. Una de las observaciones notables en nuestro estudio fue que, en contraste con las células HaCaT, se necesitaban altas concentraciones de ectoína (100–400 µM) para suprimir la síntesis de melanina en las células B16F10 estimuladas con -MSH (Figura 3B). Nuestros datos de Western blot indicaron que la ectoína regulaba a la baja la expresión detirosinasay p-CREBproteínas en células B16F10 estimuladas con -MSH, lo que conduce al efecto mencionado (Figura 3C). Por lo tanto, también probamos si estas altas concentraciones de ectoína podrían afectar la viabilidad de las células B16F10. Nuestros resultados de MTT indicaron que las altas concentraciones de ectoína (100–400 µM) no tuvieron efecto sobre la viabilidad de las células B16F10 (Figura 3A). Estos resultados significan que los queratinocitos juegan un papel clave en el anti-melanogénesisy efectos despigmentantes.

El papel del factor de transcripción Nrf2 en el metabolismo de las células de la piel está bien documentado [31]. Por lo tanto, probamos más a fondo los mecanismos desempeñados por la vía Nrf2/Keap-1 en los queratinocitos mediados por ectoína. La figura 4A muestra que la ectoína aumentó significativamente y de forma dependiente de la dosis la relación Nrf2/Keap-1 con un efecto máximo observado a una concentración de ectoína de 1,5 µM. También se observó que la ectoína 1,5 µM favorecía la translocación nuclear de la proteína Nrf2 con la máxima expresión de Nrf2 de la fracción de proteína nuclear observada en el punto de tiempo de 2 h (Figura 4B). Los datos obtenidos de la tinción de inmunofluorescencia de las células HaCaT también han respaldado este efecto. (Figura 4D).

En melanocitos y queratinocitos humanos, Marrot et al. y otros han explicado la importancia de la vía defensiva Nrf2 en las respuestas al estrés fotooxidativo [32]. También estudiamos el efecto de la expresión de proteínas antioxidantes mediada por ectoína en células HaCaT. Nuestros datos de la curva de tiempo indicaron que la expresión mediada por ectoína de las tres proteínas antioxidantes (HO-1, NQO-1, -GCLC) y Nrf2 se expresaron de manera bifásica con el aumento del tiempo ({{ 8}}.5–12 h) con un efecto observable en el punto de tiempo de 4 h (Figura 5A). A partir de esto, una curva de concentración que mide el efecto de la concentración de ectoína enantioxidantela expresión de proteína también se determinó en un punto de tiempo de 4 horas. La Figura 5B muestra que, en comparación con las células no tratadas, el tratamiento con ectoína ha aumentado la expresión de las proteínas HO-1, NQO-1, -GCLC de forma dependiente de la dosis. También medimos cómo la concentración de ectoína exhibió efectos protectores en las células HaCaT que estuvieron expuestas a la radiación UVA. Los datos de Western blot mostraron que la ectoína aumentó de forma dependiente de la dosis la expresión de proteínas antioxidantes con una regulación ascendente espectacular también en la relación Nrf2/Keap-1 (Figura 5C, D). Estos resultados indicaron que el pretratamiento con ectoína (1,5 µM, 4 h) tiene el efecto potencial de inducir la expresión de proteínas antioxidantes en las células HaCaT que podrían contrarrestar los efectos nocivos que plantea la exposición a los rayos UVA.

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5. Conclusiones

A partir de los datos anteriores, concluimos que las bajas concentraciones de ectoína (0.5–1.5 µM) podrían regular a la baja la producción de -MSH y melanina a través de la supresión de POMC ytirosinasaen las células HaCaT irradiadas con UVA, lo que indica su efecto anti-melanogénesiseficacia. Además, la ectoína también participó en la supresión de la producción intracelular de ROS en las células HaCaT. A diferencia de las células HaCaT, las altas concentraciones de ectoína (50–400 µM) pudieron mostrar un efecto similar en las células de melanoma B16F10, lo que ha significado el hecho de que los queratinocitos podrían desempeñar un papel clave en la acción antimicrobiana mediada por ectoína.melanogénesisy piel-blanqueoefectos en las células de la piel. Lo que es más importante, los efectos beneficiosos mediados por la ectoína a través de la activación de la vía Nrf2, que induce la expresión deantioxidanteproteínas HO-1, NQO-1 y -GCLC. Se demostró que AKT es la primera vía de señalización que inicia la activación de Nrf2 seguida de las otras vías (p38, PKC y CKII). Finalmente, el silenciamiento de Nrf2 proporcionó evidencia directa de que Nrf2 juega un papel clave en la regulación de las ROS intracelulares, así como en la producción de -MSH. Llegamos a la conclusión de que el principal mecanismo de blanqueamiento de la ectoína debe basarse en la inhibición de la vía ROS-p53/POMC- -MSH en las células HaCaT irradiadas con UVA. Por lo tanto, la ectoína o sus derivados podrían ser un ingrediente activo en los humectantes y lociones. que se utilizan como piel potencial y de base natural.blanqueoAgentes de la industria cosmética.

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