Identificación de sitogluside como agente potencial para reducir la pigmentación de la piel a través de la farmacología en red

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Haoran Guo,1 Hongliang Zeng,2 Chuhan Fu,1 Jinhua Huang,1 Jianyun Lu,1 Yibo Hu,1Ying Zhou,1 Liping Luo,1 Yushan Zhang,1 Lan Zhang,1 Jing Chen,1 y Qinghai Zeng 1

Muchas medicinas chinas tradicionales (MTC) conblanqueamiento de la pielSe han registrado propiedades en las prescripciones de Ben-Cao-Gang-Mu e infolk, y alguna literatura confirma que sus extractos tienen el potencial de inhibirpigmentación. Sin embargo, estudios no sistemáticos han identificado los mecanismos reguladores específicos de los posibles ingredientes activos. El objetivo de este estudio fue evaluar los ingredientes en los MTC que inhiben la pielpigmentacióna través de un sistema de farmacología en red y para explorar los mecanismos subyacentes. Identificamos 148 ingredientes activos potenciales de 14 TCM y, según el "grado" promedio de los parámetros topológicos, los cinco TCM principales (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones y Paeoniae Radix Alba) que era más probable que causaranblanqueamiento de la piela través de procesos antiinflamatorios fueron seleccionados. Sitogluside, el ingrediente más común en los cinco principales TCM, inhibe la melanogénesis en células de melanoma humano (MNT1) y células de melanoma murino (B16F0) y disminuye la pielpigmentaciónen el pez cebra. Además, la investigación mecanicista reveló que la sitogluside es capaz de regular a la bajatirosinasa(TYR) inhibiendo las vías de ERK y p38 e inhibiendo la actividad de TYR. Estos resultados demuestran que la farmacología de red es una herramienta eficaz para el descubrimiento de compuestos naturales con propiedades blanqueadoras de la piel y la determinación de sus posibles mecanismos. Sitogluside es un ingrediente activo novedoso para blanquear la piel con efectos reguladores duales que inhibenTYRexpresión y actividad.

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Introducción

La melanina no solo determina el color de la piel, los ojos y el cabello humanos, sino que también juega un papel clave en el camuflaje, el mimetismo, la comunicación social y la protección contra los rayos ultravioleta. de condiciones, como pecas y melasma, que pueden afectar negativamente la belleza percibida y la confianza social [1]. La melanina es el producto final de la L-tirosina después de múltiples pasos de reacciones enzimáticas y se sintetiza en los melanosomas de los melanocitos [2]. En la piel, los melanocitos están ubicados en la capa basal de la epidermis y pueden producir y transferir melanosomas maduros a los queratinocitos, causando así lesiones en la piel.pigmentación [3]. TYRes la principal enzima limitante de la velocidad en la producción de melanina [4], y el factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF) es el principal factor de transcripción que regula la expresión transcripcional de TYR [5].

Recientemente, los estudios han encontrado que las respuestas inflamatorias desempeñan un papel importante en la regulación de la melanogénesis [6]. Por ejemplo, la IL-18, producida por las células de Langerhans, las células dendríticas y los queratinocitos en la epidermis, puede aumentar las expresiones de TRP{{2 }} (proteína 1 relacionada con tirosinasa) y TRP-2 (proteína 2 relacionada con tirosinasa) al activar las vías p38/MAPK (proteína quinasa activada por mitógeno) y PKA (proteína quinasa A), promoviendo así la melanogénesis[7, 8 ]. TNF- regula a la baja la producción de melanina B16 principalmente mediante la activación de NF-κB [9]. Se ha demostrado que la PGe2 (prostaglandina e2), que es secretada por los fibroblastos y los queratinocitos, estimula la diferenciación de las células dendríticas e inicia la actividad de TYR en los melanocitos a través de las vías de señalización de AMPc (monofosfato de adenosina cíclico) y Plc (fosfolipasa c) [10]. La PIH (hiperpigmentación posinflamatoria) es un tipo de melanización cutánea reactiva [11]. Diversas enfermedades de la piel, traumatismos o cirugías estéticas a menudo conducen apigmentacióndel área afectada, especialmente en personas de color [12]. Los pacientes con PIH suelen soportar un estrés psicológico inmenso que, en casos graves, afecta negativamente a su calidad de vida. Por lo tanto, ciertos medicamentos que regulan la inflamación se usan para tratar la PIH y otras enfermedades que causan hiperpigmentación. Por ejemplo, se descubrió que el resveratrol, que redujo el daño inflamatorio en las células HaCaT [13], inhibe la síntesis de melanina a través de la regulación de la señal extracelular de la quinasa 1/2 y la señalización. de fosfoinositida 3-quinasa/Akt [14].

BlanqueoLos agentes, como la hidroquinona (HQ) y la vitamina C, se usan tradicionalmente para tratar la pigmentación [15]. HQ es un hidroxifenol con un poderoso efecto inhibitorio sobre la melanogénesis. Sin embargo, debido a varios efectos secundarios, como dermatitis de contacto irritante o alérgica, decoloración de las uñas y deterioro de la cicatrización de heridas, el uso de HQ está restringido [16, 17]. La vitamina C inhibeTYRal interactuar con los iones de cobre en los sitios activos de TYR, lo que disminuye la melanogénesis. Sin embargo, la vitamina C es inestable en los productos terminados. Además, si la concentración de vitamina C es superior al 20 por ciento, puede causar irritación en la piel [18]. Por lo tanto, los ingredientes naturales de una amplia gama de fuentes que son seguros, efectivos, altamente estables y fáciles de almacenar tienen una gran demanda.

Recientemente, se ha encontrado que más ingredientes de la MTC son efectivos para inhibir la piel.pigmentación, como la apigenina y la paeoniflorina [19-21]. Los MTC con actividad blanqueadora descritos en el Ben-Cao-Gang-Mu se utilizan ampliamente como recetas secretas en China y, en la actualidad, se ha confirmado que tienen el efecto de inhibir la pigmentación. Por ejemplo, el extracto de Hedysarum multijugum Maxim (el rizoma de Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge) provoca el blanqueamiento de la piel al inhibir la vía ERK [22]. El extracto seco de Typhonii Rhizoma (el rizoma de Sauromatum gigan-teum (Ingl.) Cusimano y Hett.) puede inhibir eficazmente latirosinasaactividad in vitro [23]. Y la medicina basada en la evidencia también ha confirmado que el extracto de Sapindi Mukorossi Semen (el fruto de Sapindus mukorossi Gaertn.), que inhibe la actividad de la tirosinasa, tiene el potencial de ser utilizado como aditivo cosmético y farmacológico [24]. Algunas prescripciones populares tradicionales, aunque no están compiladas en un compendio, también se usan ampliamente. San-Bai-Tang (SBT) es un ejemplo típico. Ye et al. demostraron que SBT podría disminuir la producción de melanina al inhibir la vía de señalización p38/MAPK y la actividad de TYR [25]. También se ha demostrado que otros TCM descritos en algunas recetas tienenblanqueamiento de la pielefectos El extracto de Coicis Semen (la semilla de Coix AquaticaRoxb.) inhibe la producción de melanina al regular a la baja MITF, TYR, TRP-1 y TRP-2 [26]. Además, un cellassay deTYRmostró que Ampelopsis japonica (el rizoma de Ampelopsis japonica (Thunb.) Makino) inhibió la actividad del hongo TYR en más del 50 por ciento [27]. Los MCT blanqueadores registrados en estas recetas antiguas han demostrado ser efectivos mediante técnicas experimentales modernas, pero la mayoría de ellos se verifican en forma de extractos, y los ingredientes activos que funcionan no están claros. Esto despertó nuestro interés en los ingredientes activos de los MTC con efectos blanqueadores registrados. en recetas antiguas.

Además, los MTC o recetas tienen ingredientes complejos, diversos modos de acción y principios activos desconocidos. Además, la inconsistencia de factores como la calidad de las materias primas, los métodos de procesamiento, las técnicas de preparación, la compatibilidad de los ingredientes utilizados en la composición y las formas de dosificación tiene un mayor impacto en la eficacia de los MTC [19, 28]. Por lo tanto, el uso de ciertos TCM conblanqueamiento de la piellos efectos están restringidos. Por lo tanto, es urgente identificar los ingredientes activos con efectos potenciales de blanqueamiento de la piel, a través de una evaluación sistemática para garantizar la seguridad, la eficacia y la estabilidad de estos ingredientes.

En los últimos años, la aplicación de la biología de sistemas en el campo de la MTC ha tenido un gran progreso. La farmacología de redes de la MTC es una nueva disciplina transversal que combina la farmacología de las MTC con la ciencia de redes, la biología de sistemas, la ciencia computacional y la bioinformática [29]. Entiende completamente la complejidad entre fármacos, enfermedades y sistemas biológicos desde la perspectiva de la red "complejo-proteína/gen-enfermedad" [30]. La farmacología en red es una herramienta eficaz y sistemática para estudiar la acción farmacológica, el mecanismo, la seguridad y otros aspectos de la medicina herbaria, especialmente la medicina tradicional china, y proporciona información valiosa para el descubrimiento actual de fármacos [31, 32].

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2. Materiales y métodos

2.1. Proceso Farmacológico en Red

2.1.1. Construcción de base de datos para ingredientes químicos

En la Figura 1 se muestra un diagrama de flujo del programa experimental estudiado. Los MTC con efectos antipigmentación, descritos en el Ben-Cao-Gang-Mu y en recetas populares, se utilizaron para el análisis farmacológico en red. Typhonii Rhizoma, Ricini Semen, Hedysarum multijugum Maxim., Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones y Sapindi MukorossiSemen, descritos en Ben-Cao-Gang-Mu, hanblanqueoy propiedades reductoras amarillas y puede eliminar manchas faciales y lunares. Poria cocos (Schw.) Wolf (el esclerocio de Smilax china L.), Paeoniae Radix Alba y Atractylodes macrocephala Koidz (el rizoma de Atractylodes macrocephalaKoidz.) que son constituyentes del SBT se sabe que mejoran la textura de la piel y reducen el cloasma ypigmentación. Otras hierbas registradas tradicionalmente, como Bletilla striata (Thunb. Murray) Rchb.F. (el rizoma de Bletilla striata(Thunb.) Rchb.F.), Ampelopsis japonica, A. dahurica (Fisch.)Benth. Et Hook (el rizoma de Angelica dahurica (Hoffm.)Benth. and Hook.f. ex Franch. and Sav.), Atractylodes lancea(Thunb.) Dc. (el rizoma de Atractylodes lancea (Thunb.)DC.), Fructus Ligustri Lucidi y Coicis Semen, también se incluyeron en este estudio. Debido a la gran cantidad de MTC incluidas en este estudio, múltiples evaluaciones de bases de datos de medicina china causarán confusión en el procesamiento de datos. Solo utilizamos la base de datos de Farmacología de Sistemas de Medicina Tradicional China (TCMSP), una base de datos de uso más común, para la detección de seguimiento. Los ingredientes químicos de estos TCM se buscaron en TCMSP (actualizado el 24 de abril de 2020) [33]. La semejanza con el fármaco (DL) y la biodisponibilidad oral (OB) son parámetros de detección comúnmente utilizados. Los medicamentos tópicos o sistémicos son tratamientos comunes para las enfermedades de pigmentación de la piel; por lo tanto, solo usamos DL como criterio de tamizaje. Se seleccionaron complejos excelentes con DL > 0:18 para aumentar la tasa de aciertos de los candidatos a fármacos.

2.1.2. Intersección entre los genes diana de los MTC y los genes asociados a la pigmentación.

El conjunto de genes asociado conpigmentaciónse seleccionó en función de la base de datos GeneCards (actualizada el 24 de abril de 2020), de la cual se seleccionaron los objetivos con una puntuación de gen-enfermedad > 1. Eventualmente, se identificaron 6180objetivos relacionados con la pigmentación. La intersección entre los genes objetivo de los MTC y los genes asociados con la pigmentación se ilustró mediante un diagrama de Venn [34].

2.1.3. Construcción de una red de ruta de compuesto activo-objetivo.

Los ingredientes activos y los genes diana regulados se examinaron de acuerdo con los resultados del diagrama de Venn. La red se construyó usando el software Cytoscape [35] y se usó para indicar la relación entre los compuestos activos de los MTC y los genes diana depigmentaciónCada gen diana regulado por un ingrediente activo en la MTCA se consideró un "grado". Los parámetros topológicos de "grado" promedio de cada TCM se usaron para evaluar la importancia de los TCM seleccionados. Se clasificaron los compuestos y se seleccionaron los cinco principales TCM para análisis clave. Además, se analizó información detallada sobre los ingredientes activos potenciales reportados para regular la pigmentación.

2.1.4. Enciclopedia de Kioto de genes y genomas (KEGG)Análisis de enriquecimiento de genes diana regulados por MTC potencialmente eficaces.

Los genes diana regulados por los cinco principales TCM se seleccionaron para determinar las vías diana de KEGG y explorar los posibles mecanismos de ingredientes potencialmente efectivos en estos TCM contrapigmentación.DAVID bioinformatics resources 6.8 se utilizó para analizar el enriquecimiento de las vías diana de KEGG. Se cargaron los símbolos genéticos de los objetivos potenciales de los ingredientes activos efectivos. Los identificadores de genes obtenidos se descargaron y se ingresaron en KOBAS3. Se seleccionó el gen que ajustaba los valores de p menos de 0.05.

2.1.5. Simulación de acoplamiento molecular.

Las estructuras 2D de sitogluside, arbutina, nicotinamida, HQ, ácido kójico y ácido ascórbico se obtuvieron de la base de datos PubChem. Las estructuras mecánicas de las moléculas pequeñas se optimizaron con ChemBio3D Ultra 14.0. La estructura cristalina 3D del hongo.TYR(ID de PDB: 2Y9X, coordenadas de acoplamiento: X =−8:87, Y=−30:74 y Z=−41:52) se obtuvo del Banco de datos de proteínas ( PDB) base de datos [36]. Las estructuras cristalinas 3D de seis receptores de membrana (receptor opioide u, PDB ID: 4DKI; receptor de melanocortina 1, PDB ID: 2L1J; receptor de endotelina B, PDB ID: 5GLI; receptor adrenérgico, PDB ID: 4GBR; receptor de prostaglandina, PDB ID: 6D26 ; receptor del factor de células madre, PDB ID: 2EC8) se obtuvieron de la base de datos PDB. Las estructuras proteicas se prepararon con las herramientas AutoDock mediante la eliminación de moléculas de agua, la adición de hidrógenos y la creación de enlaces de orden cero con metales y enlaces disulfuro. Por último, las simulaciones de acoplamiento molecular se realizaron con AutoDock Vina 1.1.2 [37] y los resultados se analizaron con PyMoL 1.7.2.1.

2.2. Validación Experimental

2.2.1. Químicos y Anticuerpos.

El sitogluside (pureza superior o igual al 98 por ciento) se adquirió de ChemFaces (#CFN98, 713, Chem Faces). El dimetilsulfóxido (DMSO) se adquirió de Sigma-Aldrich. Se adquirió paraformaldehído neutro (4 por ciento) de Biosharp (Hefei, China). El ácido kójico, el Fontana-Masson Stain Kit, el desoxicolato de sodio y L DOPA se adquirieron de Solarbio (Beijing, China). El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) se adquirió de Gibco (#C11995500BT, Gibco). El suero bovino fetal (FBS) y el kit de recuento de células-8 (CCK8) se adquirieron de BI (Kibbutz Beit-Haemek, Israel). El PMA (acetato de 12-O-tetradecanoilforbol-13-, el activador ERK/MAPK) se adquirió de APExBIO (#N2060, APExBIO). La anisomicina (el activador p38/MAPK) se adquirió de MedChem Express (HY-18982, MedChemExpress). Anticuerpos primarios contra la proteína relacionada con ras Rab-27A (RAB27A) (n.º 69295, CST), quinasa regulada por señal extracelular (ERK) (n.º 4695, CST), p-ERK (n.º 4370, CST), c- Jun N-terminal quinasa JNK (# 9252, CST), p-JNK (# 4668, CST), p38 (# 8690, CST), p38 (# 4511, CST), proteína de unión al elemento de respuesta cAMPCREB ( #9107, CST) y p-CREB (#9198, CST) se adquirieron de Cell Signaling Technology. Anticuerpos primarios contra TRP1 (ab235447, Abcam), TRP2 (NBP1-56058, Novusbio), MITF (STJ94134, St. John's Laboratory),TYR(BS1484, Bioworld) y GAPDH (#AP0066, Bioworld) se adquirieron de Abcam, Novusbio, St. John's Laboratory y Bioworld, respectivamente.

2.2.2. Cultivo y Tratamiento Celular.

MNT1 y B16F0, que son ricos en melanosomas, se utilizan ampliamente para estudiar la melanogénesis [38]. En consecuencia, se eligieron estas dos líneas celulares para experimentos posteriores. Se cultivaron células MNT1 y B16F0 en suero bovino fetal al 20 o 10 por ciento (BiologicalIndustries, Israel) y penicilina-estreptomicina al 1 por ciento (Gibco) en DMEM. Todas las células se cultivaron en una incubadora húmeda a 37 grados y 5 por ciento de CO2. Sitogluside se disolvió en DMSO, y la concentración final de DMSO fue<0.1%. pma="" and="" anisomycin="" were="" separately="" dissolved="" in="" dmso,="" and="" the="" final="" concentration="" of="" dmso="" was=""><>

2.2.3. Cultivo y tratamiento del pez cebra.

Los embriones de pez cebra y el medio de cultivo se adquirieron de EzeRinka Biotech (Nanjing, China). El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética del Tercer Hospital Xiangya de la Universidad Central del Sur (No. 2021-S137). El primer día después de la eclosión, los peces cebra se criaron en una 12-placa de pocillos (10 por pocillo), se protegieron de la luz y se cultivaron a 37 grados. Los peces cebra fueron tratados con diferentes concentraciones de sitogluside y se tomaron fotografías usando un microscopio invertido a intervalos de 24 horas para registrar los cambios en la melanina en las colas de los peces cebra. Después de tomar las fotografías, se leyeron las soluciones de sitogluside de diferentes concentraciones y se registraron continuamente durante una semana.

2.2.4. Viabilidad celular.

La viabilidad celular se evaluó utilizando CCK8.MNT1 y las células B16F0 se sembraron en 96-placas de pocillos a una densidad de 2000 células/pocillo o 500 células/pocillo. Las células se trataron con diferentes concentraciones de sitogluside (25, 50, 100, 200, 400, 600 y 800 μM). Después de 24 o 48 h, se añadieron 10 μl de reactivo CCK8 a cada pocillo y las células se incubaron a 37 grados durante 1 h. Cuando el color del medio se volvió naranja, se terminó el cultivo y se usó un lector de microplacas (PerkinElmer EnVision Xcite, Reino Unido) para medir la absorbancia a 490 nm.

2.2.5. Tinción de melanina de Fontana-Masson.

Las células se cultivaron en una placa 6-pocillo y se trataron con diferentes concentraciones de sitogluside durante 2 días, y se añadió ácido kójico como control positivo a 200 μM. Luego, las células se colocaron en paraformaldehído al 4 por ciento durante 15 min. Después de enjuagar con agua, las células se incubaron con solución de amoníaco-plata de Fontana durante 24 h en una cámara oscura, se enjuagaron con agua y luego se colocaron en hiposulfito durante 5 min adicionales. Se utilizó un microscopio invertido para observar la melanina.

2.2.6. Experimento de recuperación de funciones.

PMA, como activador reconocido de ERK/MAPK [39, 40], se probó para detectar citotoxicidad a través del experimento CCK8 a diferentes concentraciones (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 y 800 ng/mL) durante 24 horas. Y después de que las células MNT1 y B16F0 se trataron con diferentes concentraciones (25, 50 y 100 ng/mL) de PMA durante 2 horas, el nivel de fosforilación de ERK se detectó mediante un experimento de transferencia Western. A la concentración seleccionada, las células se trataron con 0, 1, 2, 4, 6 y 8 horas para detectar el tiempo efectivo de activación. Después de tratar las células con sitogluside (200 μM) y PMA (25 ng/mL) durante 48 horas (retratadas cada 8 horas), los niveles de proteína deTYRyp-ERK fueron detectados. La tinción de melanina de Fontana-Masson detectó el contenido de melanina. La anisomicina [41] es el activador de p38/MAPK, cuya concentración de exploración es de 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 y 512 nM, y los otros métodos experimentales son los mismos que PMA.

2.2.7. Mediciones de actividad TYR.

Las células se trataron con diferentes concentraciones de sitogluside durante 2 días. Después de la digestión y centrifugación, las células se contaron y se resuspendieron dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS). A continuación, se añadieron a cada muestra 500 μl de solución de desoxicolato de sodio al 0,5 %. Las muestras se incubaron a 4 grados durante 10 minutos y luego a 37 grados durante 15 minutos. Se añadió 1 ml de solución de L-DOPA al 1 por ciento, después de lo cual se pipetearon inmediatamente 200 μl en una placa de pocillos 96-. Posteriormente, se utilizó un lector de placas multimodo para medir los valores de absorbancia (A0) a 475 nm, y se repitió la medición a los 30 min (A30).TYRla actividad se calculó como (A{{0}}A0)/número de celda.

2.2.8. Sonda de actividad TYR.

Una sonda de fluorescencia de infrarrojo cercano paraTYRSe usó actividad basada en resorufina para visualizar la actividad en células vivas, como se describió anteriormente [42]. Brevemente, las células MNT1 y B16F0 se cultivaron en una 6-placa de pocillos y se trataron con diferentes concentraciones de sitogluside durante 2 días. . Se añadió una sonda de fluorescencia 10 μM y, después de 4 h, las células se reemplazaron con PBS. Después de que la luz roja fuera emocionante, inmediatamente se usó un microscopio fluorescente invertido para tomar fotografías.

2.2.9. Extracción de Proteínas y Western Blotting.

Después de tratar las células con diferentes concentraciones de sitogluside durante 2 días, se extrajo la proteína celular total utilizando el tampón de lisis RIPA (Thermo Fisher) y los cócteles de inhibidor de proteasa e inhibidor de fosfatasa (Roche). La concentración de proteínas se determinó utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (KeyGEN Biotec). Después de bloquear con BSA al 1 por ciento, los anticuerpos primarios contraTYR, MITF, TRP1, TRP2, RAB27A, CREB, p-CREB, ERK, p-ERK, JUK, p-JUK, p38 y p-p38 se incubaron con las membranas durante la noche a 4 grados a 1: 1000 y GAPDH a 1: 3000 Las membranas se lavaron con TBS-T y se incubaron con anticuerpo secundario de cabra anti-conejo a 1:3000 durante 1 h. El anticuerpo de unión se detectó por electroquimioluminiscencia (ECL).

2.2.10. Análisis estadístico.

Se usó el software SPSS22.0 para el análisis estadístico, y se usó la prueba t de Student o el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para las comparaciones de grupos múltiples. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para datos no paramétricos. p < 0:05="" en="" todos="" los="" casos="" se="" consideró="" estadísticamente="" significativo.="" ∗∗∗p="">< 0:001,="" ∗∗p="">< 0:01="" y="" ∗p=""><>

3. Resultados

3.1. Ingredientes compuestos de TCM.

Se estudiaron catorce MTC, registrados en el Ben-Cao-Gang-Mu y en recetas populares, con efectos antipigmentación. Se recuperó un total de 372 ingredientes de la medicina china de los 14 TCM de la base de datos TCMSP (Tabla complementaria S1).

3.2. Genes diana regulados por TCM y genes de pigmentación relacionados.

De acuerdo con el sistema de predicción de objetivos en la base de datos TCMSP, se obtuvieron un total de 834 genes objetivo de los 14 TCM. Un total de 9431 genes relacionados conpigmentaciónse recuperaron de la base de datos GeneCards, de las cuales se seleccionaron 6180 y tenían una puntuación de relevancia > 1.

3.3. Clasificación de 14 TCM y Disease-Compound-TargetNetwork.

Usando el software Cytoscape, tomamos la intersección de los genes reguladores de cada TCM y los genes relacionados con la pigmentación y obtuvimos los ingredientes activos potenciales y los genes diana comunes. A continuación, la red diana del compuesto de la enfermedad entre la MTC ypigmentaciónfue construido. Con base en esto, obtuvimos el "grado" promedio de cada ingrediente activo y clasificamos los TCM de acuerdo con sus puntajes. De acuerdo con los puntajes de clasificación, las 5 mejores hierbas fueron Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones y Paeoniae Radix Alba (Figura 2(a)). A través del análisis KEGG de 220 genes diana de los 5 MTC principales, el 19,3 % de los genes eran ricos en la vía de señalización PI3K-Akt, el 13,6 % de los genes estaban relacionados con la vía de señalización TNF y aproximadamente el 12,3 % de los genes estaban relacionados con IL{{ 12}}. Además, 37 genes estaban implicados en la vía MAPK y 28 genes en la vía HIF-1. Estas vías están estrechamente relacionadas con la regulación del metabolismo de la melanina y el fotoenvejecimiento de la piel. Entre las 20 principales vías de señalización enriquecidas, las vías relacionadas con la inflamación representaron una cuarta parte de ellas (Figura 2(c)). Las Figuras 2(d)–2(h) representan la red de objetivos de compuesto de la enfermedad entre Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, Paeoniae Radix Alba y pigmentación, respectivamente. De acuerdo con el diagrama de Venn de los ingredientes en los cinco principales TCM, encontramos que cuatro TCM contenían sitogluside y beta-sitosterol (Figura 2 (b), Tabla complementaria S2).

3.4. Posibles ingredientes activos en la inhibición de la pigmentación.

De acuerdo con la red enfermedad-compuesto-objetivo, 148 ingredientes relacionados conpigmentaciónse obtuvieron de 14TCM. A través de una búsqueda bibliográfica, se informó que 25 de los 148 ingredientes inhibían la melanogénesis. Se informaron cuatro ingredientes activos como extractos de plantas que inhiben la melanogénesis. Se estudiaron catorce ingredientes activos y se informó que sus derivados regulan la pigmentación. Curiosamente, se demostró que cuatro ingredientes promueven la melanogénesis, mientras que el mecanismo de seis ingredientes para regular la melanogénesis aún no está claro. Los 95 ingredientes medicinales chinos potenciales restantes aún no han sido explorados para la regulación de la pigmentación. La información detallada sobre estos ingredientes se proporciona en la Tabla complementaria S3.

3.5. Efectos in vitro e in vivo de sitogluside en la melanogénesis.

Después del proceso de selección anterior, encontramos que cuatro TCM en los principales TCM contenían sitogluside y -sitosterol. -Se ha informado que el sitosterol inhibe la hormona estimulante de los melanocitos alfa (-MSH), estimulando la melanogénesis a través de la vía de señalización p38 en las células de melanoma B16F10 [43]. Sin embargo, no se han informado los efectos antipigmentación de sitogluside y su mecanismo específico. Por lo tanto, elegimos sitogluside como candidato a fármaco para estos estudios. El ensayo CCK8 se realizó para explorar las posibles concentraciones tóxicas de sitogluside en células MNT1 y B16F0. Los resultados mostraron que el sitogluside no tuvo un efecto evidente en la proliferación de las células (Figuras 3(a) y 3(b)) en concentraciones por debajo de 400 μM. La tinción de melanina realizada con 25, 50, 100 y 200 μM de sitogluside mostró que contenido de melanina en las células MNT1 y B16F0 de manera dependiente de la dosis (Figura 3 (c)). Además, el tratamiento con sitogluside inhibió significativamente lapigmentaciónen el pez cebra de manera dependiente del tiempo y la dosis (Figura 3(d)). Estos resultados sugirieron que la sitogluside inhibía la melanogénesis in vitro e in vivo.

3.6. Efectos de sitogluside en la expresión de TYR.

A partir de los resultados anteriores, la sitogluside puede reducir efectivamente el contenido de melanina, pero aún se desconoce cómo regula este proceso y, por lo tanto, es de interés. Se realizó transferencia Western para detectar la expresión de genes relacionados con la melanogénesis (TYR, MITF, TRP1, TRP2 y RAB27A) a nivel de proteína. Los resultados de los análisis demostraron que la expresión de TYR estaba significativamente regulada a la baja y que las expresiones de MITF y TRP1 estaban moderadamente reguladas a la baja después del tratamiento con sitogluside (Figura 4(a)). Dado que MAPK y PKA son las vías de señalización clave aguas arriba que regulan TYR, exploramos más a fondo los cambios en las proteínas clave en estas dos vías. Después de que las células MNT1 y B16F0 se trataron con sitogluside durante 2 días, los niveles de fosforilación de ERK y P38 se redujeron significativamente , mientras que no hubo cambios significativos en los niveles totales de proteínas CREB, ERK, JNK y p38 ni en los niveles de fosforilación de JNK y CREB (Figura 4(b), Figura S1A). De acuerdo con los resultados del experimento CCK8, encontramos que PMA por debajo de 100 ng/mL no es tóxico para ambas células (Figura S1B), y 25 ng/mL de PMA obviamente pueden aumentar el nivel de fosforilación de ERK. El nivel de fosforilación de ERK disminuyó gradualmente después de 4 horas (Figura S1C-D). A través de la tinción de melanina de Fontana-Masson, encontramos que PMA puede aumentar significativamente el contenido de telanina de las células MNT1 y B16F0. Los resultados del western blot también sugieren que PMA puede regular al alza el nivel de fosforilación de ERK, y que la sitogluside puede reducir el nivel de fosforilación de ERK regulado al alza por PMA. Al inhibir el nivel de fosforilación de ERK y reducir el nivel de proteína deTYR, sitogluside reduce el contenido de melanina aumentado por PMA (Figuras 4(c) y 4(e), Figura S2A). Al mismo tiempo, encontramos que la anisomicina tiene resultados similares. La anisomicina por debajo de 8 nM no es tóxica para ambas células, y la anisomicina 2 nM puede aumentar significativamente el nivel de fosforilación de p38. A las 8 horas, el nivel de fosforilación de p38 sigue siendo alto (Figura S1B, Figura S1E-F). Los resultados de la tinción de melanina de Fontana-Masson y el Western Blot también sugieren que la sitogluside puede inhibir el nivel de fosforilación de p38 regulado al alza por la anisomicina, reduciendo el contenido de proteína TYR e inhibiendopigmentación(Figuras 4(d) y 4(f), Figura S2B). Por lo tanto, el sitogluside puede reducir la expresión de TYR al inhibir las vías ERK/MAPK y p38/MAPK. Sin embargo, el mecanismo por el cual el sitogluside inhibe estas vías de señalización aún no está claro. Rastreamos los receptores de membrana corriente arriba de estas vías de señalización y utilizamos el acoplamiento molecular para explorar el mecanismo de regulación de las vías corriente abajo. Las energías de unión entre la sitogluside y los seis receptores de membrana, a saber, el opioide u, la melanocortina 1, el factor de células madre, la endotelina B, los receptores adrenérgicos y de prostaglandinas fueron -7.8,-5.8, {{9 }}.5, -5.4, -3.4 y 0 kal/mol, respectivamente. A través del acoplamiento molecular, encontramos que entre los seis receptores de membrana, la sitogluside tenía afinidades muy altas con el opioide u, la melanocortina 1 y los receptores del factor de crecimiento de células madre (Figura 4 (g)). Especulamos que la sitogluside puede inhibir las vías ERK/MAPK y p38/MAPK al unirse a los receptores de membrana antes mencionados, lo que regula a la baja la expresión de TYR.

3.7. Efecto de Sitogluside sobre la actividad de TYR.

Ya queTYRes la enzima clave en la síntesis de melanina, es el objetivo más destacado para inhibir la melanogénesis. La mayoría de los cosméticos o agentes para aclarar la piel disponibles comercialmente, como HQ, arbutina y ácido kójico, son inhibidores de TYR. Utilizamos sitogluside y algunos clínicamente utilizadosblanqueamiento de la piel(arbutina, nicotinamida, ácido kójico, HQ y ácido ascórbico) para realizar el acoplamiento molecular con TYR. Las interacciones detalladas entre sitogluside y los agentes antes mencionados conTYRse muestran en la Figura 5(a). Las energías de enlace de estos seis compuestos fueron -6.2, -6.4, -5.6, -5.7, -5.4, y{{ 11}}.4 kcal/mol, respectivamente. Generalmente se cree que cuando la energía de afinidad es -4, indica una fuerza vinculante, y cuando es mayor o igual que -7.0, indica una fuerte fuerza vinculante. El lado de Sitoglu ocupó el segundo lugar en afinidad, ligeramente más débil que la arbutina, exhibiendo una capacidad de combinación relativamente sobresaliente.

Al mismo tiempo, se utilizó un experimento de conversión de L-DOPA para detectar la actividad de TYR, utilizando ácido kójico como control positivo. Los resultados mostraron que la sitogluside inhibió la actividad de TYR en células MNT1 y B16F0 de una manera dependiente de la concentración, y el grupo de alta concentración (200 μM) mostró un efecto inhibidor equivalente al mostrado por 200 μM kojic ácido (Figuras 5(b) y 5(c)). Además, los resultados del experimento con la sonda TYR mostraron que a medida que aumentaba la concentración de sitogluside, la intensidad de la fluorescencia disminuía gradualmente en las células, y la intensidad de la fluorescencia del grupo de alta concentración era cercana a la del ácido kójico 200 μM en las células MNT1 y B16F0 (Figura 5(d), Figura S2C). Estos resultados indican que sitogluside puede inhibir eficazmenteTYRactividad en células MNT1 y B16F0. Además, especulamos que la sitogluside, como compuesto de esterol natural, puede penetrar directamente en la membrana celular y unirse a TYR e inhibir su actividad, inhibiendo así la melanogénesis.

4. Discusión

En este estudio, utilizamos la farmacología de red para explorar los mecanismos de potencialblanqueamiento de la pielingredientes que se encuentran en 14 TCM, documentados en las recetas de Ben-Cao-Gang-Mu e infolk, para inhibirpigmentación. El estudio también propuso un método innovador que utiliza el parámetro topológico de "grado" promedio de cada ingrediente activo para evaluar la efectividad potencial de las hierbas. De acuerdo con el "grado" promedio, se seleccionaron Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones y Paeoniae Radix Alba, y a través del análisis de enriquecimiento KEGG de los genes regulados por estos cinco TCM, fue inesperado que el 25 por ciento de los genes enriquecidos Las vías de señalización estaban relacionadas con la inflamación, incluidas las vías de señalización IL-17, TNF, HIF-1, PI3K-Akt y MAPK.

Recientemente, se ha demostrado que una variedad de mediadores inflamatorios activan o inhiben las vías de señalización relacionadas con la melanogénesis que promueven o inhiben la piel.pigmentación[6]. Células de melanoma B16F10 incultivadas, TNF- redujo la expresión deTYRy la actividad de TRP1 y TYR de forma dependiente de la dosis [44]. IL-17 y TNF- pueden reducir la expresión de genes relacionados con la melanogénesis en los melanocitos, e IL-17 puede aumentar significativamente el efecto inhibidor de TNF- en la melanogénesis. Después del tratamiento con etanercept (anti-TNF), los genes relacionados con la melanogénesis aumentaron significativamente en las lesiones cutáneas de los pacientes con psoriasis[45]. Se ha informado que HIF-1, un poderoso factor de transcripción que regula la respuesta inflamatoria, participa en la regulación de factores como IL-17 y TNF- [46–48]. Por lo tanto, es probable que HIF-1 participe en la regulación de la melanogénesis al influir en la inflamación. Otras citoquinas como IL-18, IL-33, GM-CSF e IL-1 puede promover la melanogénesis al activar PKA, MAPK u otras vías de señalización, mientras que IFN-, IL-1, IL-4 e IL-6 reducen la melanogénesis al inhibir STAT1, NF-κB, y vías de señalización JAK2-STAT6 [6]. Nuestros hallazgos sugieren que los cinco principales TCM (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones y Paeoniae Radix Alba) pueden ejercer un efecto antipigmentación principalmente a través de vías antiinflamatorias. La literatura anterior también mencionó que estos cinco MTC principales tienen poderosos efectos antiinflamatorios y antienvejecimiento [49, 50]. Esto también respalda nuestra conjetura de que los MTC pueden desempeñar un papel no despreciable en la pigmentación posinflamatoria.

Mientras examinamos la literatura de 148 ingredientes encontrados en 14 TCM, también encontramos que entre 35 de los ingredientes informados, se confirmó que casi el 70 por ciento de ellos reducen el contenido de melanina o inhiben la actividad de TYR. Esto no solo confirma que los registros de prescripciones para blanquear la piel en libros antiguos son en gran medida confiables, sino que también muestra que la referencia a la literatura antigua es un método confiable para obtener conocimiento sobre las MTC. Todavía hay 95 compuestos que permanecen sin explorar, que tienen el potencial de resistirpigmentación. A través del análisis de los diagramas de Venn de los cinco principales MTC, se obtuvieron 13 ingredientes comunes. Entre ellos, los experimentos in vitro confirmaron que la daidzeína, la rutina y (más) la catequina pueden reducir el contenido de melanina [51–53]. La sacarosa altera la maduración adecuada del melanosoma. al inducir estrés osmótico e inhibir la vía de la quinasa PI3, lo que interfiere con la melanogénesis [54]. La quercetina reduce la melanogénesis inducida por el estrés oxidativo [55]. Además, los métodos químicos y físicos, como los análisis espectroscópicos y de estructura-actividad, confirmaron que el lupeo y el kaempferol pueden inhibirTYRy reducir la melanogénesis[56, 57]. Esto indica que la farmacología en red puede ser un método factible para desenterrarblanqueoingredientes. Cuatro de los cinco MTC principales contenían sitogluside, y no hay informes sobre si el sitogluside regula la pigmentación o su mecanismo relacionado. Por lo tanto, elegimos sitogluside para estos estudios.

Se ha informado que la sitogluside, un glucósido de esterol que se encuentra ampliamente presente en las plantas, ejerce efectos antitumorales, antioxidantes y neuroprotectores [58–60]. En este estudio, descubrimos que la sitogluside redujo efectivamente el contenido de melanina in vitro e in vivo. Experimentos posteriores demostraron que podía reducir significativamente la expresión de TYR. El ácido kójico se usó como control positivo y también puede inhibir los niveles de proteína de los genes relacionados con la melanogénesis como TYR, MITF y TYRP1 bajo estimulación con MSH, lo cual fue informado por Jeon et al. [61]. Dada la ausencia de estimulación exógena, el ácido kójico 200 μM tuvo solo efectos inhibitorios moderados sobre la expresión génica en nuestro estudio, pero debido a que el ácido kójico tiene una gran actividad inhibidora de la tirosinasa, aún lo usamos como control positivo en este estudio. Se informó que la expresión de TYR está regulada directa o indirectamente por las vías MAPK o PKA, respectivamente. Se ha confirmado que un número cada vez mayor de ingredientes tiene un efecto blanqueador en la piel al inhibir la vía de señalización de MAPK. Por ejemplo, la fargesina reduce la expresión deTYRal inhibir la vía P38/MAPK [62]. Los polisacáridos de Ganoderma lucidum pueden resistir la melanogénesis inducida por UVB mediante la regulación negativa de la vía MAPK [63]. Nuestro estudio encontró que la sitogluside, en una concentración de 200 μM, tenía el potencial de reducir la expresión de TYR al inhibir las vías de señalización de ERK/-MAPK y P38/MAPK. Esto ha sido informado a través del acoplamiento molecular entre los receptores de membrana corriente arriba de las vías MAPK [64] y la sitogluside. Encontramos que la sitogluside se une fuertemente a los receptores opioides u, melanocortina 1 y factor de crecimiento de células madre. Por lo tanto, especulamos que la sitogluside puede interactuar con estos receptores de membrana, inhibir las vías de señalización de ERK/MAPK y P38/MAPK y reducir la expresión de TYR.

Dado que TYR es la enzima clave en la síntesis de partículas de melanina en los melanocitos, la inhibición de la actividad del sitio catalítico de TYR es esencial para reducir la piel.pigmentación[sesenta y cinco]. Muchos agentes para aclarar la piel en el mercado son inhibidores de la actividad TYR, como HQ, arbutina y ácido kójico. En este estudio, utilizamos el acoplamiento molecular para explorar los efectos de unión de la sitogluside y cincoblanqueamiento de la pielingredientes activos (arbutina, nicotinamida, ácido kójico, HQ, y ácido ascórbico) [66] conTYR. Los resultados mostraron que la sitogluside tenía una fuerte afinidad de unión con TYR, más débil que la arbutina, pero más fuerte que el ácido kójico, la nicotinamida, la HQ y el ácido ascórbico. La arbutina es un profármaco de HQ y un producto natural que puede reducir o inhibir la síntesis de melanina mediante la inhibición de TYR. Sin embargo, la forma natural de la arbutina es químicamente inestable y puede convertirse en HQ, que se cataliza y metaboliza en metabolitos de benceno con toxicidad potencial para la médula ósea [67]. El uso de ácido kójico en cosméticos está restringido debido a su carcinogenicidad e inestabilidad durante el almacenamiento [68]. Por lo tanto, se espera que la sitogluside, un compuesto de esterol natural derivado de una variedad de plantas, actúe como un potente agente aclarador de la piel. Sin embargo, la solubilidad del sitogluside en DMSO es baja, lo que también es una deficiencia de este ingrediente natural. La verificación experimental posterior reveló que el sitogluside es seguro en las líneas celulares MNT1 y B16F0, y el grupo de baja concentración tuvo un buen efecto inhibidor sobre la actividad de TYR, mientras que el grupo de alta concentración tuvo el mismo efecto que la misma concentración de ácido kójico. Por lo tanto, la sitogluside se puede usar terapéuticamente como un regulador del blanqueamiento de la piel, que no solo reduce la expresión de TYR sino que también inhibe su actividad (Figura 6).

5. Conclusiones

La farmacología en red es quizás una herramienta eficaz para el descubrimiento de principios activos naturales reductores de la pigmentación de la piel y sus posibles mecanismos. Fructus LigustriLucidi, Hedysarum multijugum maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones y PaeoniaeRadix Alba tienen potencialblanqueamiento de la pielpropiedades y puede inhibirpigmentaciónregulando la inflamación. Sitogluside es una novelablanqueamiento de la pielingrediente activo con efectos reguladores duales, a saber. inhibiendoTYRexpresión y actividad.

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