Contenido De Compuestos Fenólicos Y Diversidad Genética A Nivel Poblacional A Través Del Área De Distribución Natural De La Gayuba (Arctostaphylos Uva-ursi, Ericaceae) En La Península Ibérica

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

Resumen:La gayuba (Arctostaphylos uva-ursi) es una planta medicinal tradicionalmente empleada para el tratamiento de infecciones del tracto urinario debido al alto contenido dearbutina(hidroquinona -D-glucósido), que ahora se usa principalmente como un agente natural para blanquear la piel en cosméticos. También se ha propuesto la gayuba como ingrediente naturalantioxidanteaditivo debido al alto contenido de compuestos fenólicos en las hojas. Estudiamos la variación de los compuestos fenólicos en 42 poblaciones silvestres de gayuba, con el objetivo de dilucidar si factores biológicos, climáticos y/o geográficos intrínsecos afectan los contenidos fenólicos en su distribución natural en la Península Ibérica. Se recolectaron hojas de gayuba durante el otoño durante un período de tres años (2014-2016) en poblaciones a lo largo de un gradiente de latitud y altitud. Los extractos metanólicos mostraron un amplio rango de variación en el contenido de fenoles totales y diferentes perfiles fenólicos con respecto aarbutina(los niveles de este componente principal variaron de 87 a 232 mg/g de peso seco), pero también los contenidos de catequina y miricetina, que se vieron afectados por factores geográficos y climáticos. También se detectaron entre las poblaciones niveles moderados de variación en el tamaño del genoma (evaluados mediante citometría de flujo) y en dos regiones de ADN de plástidos. La diferenciación genética y citogenética de las poblaciones fue débil pero significativamente asociada con la diversidad fitoquímica. Genotipos élite de gayuba con mayorantioxidanteposteriormente se identificó la capacidad.

Palabras clave: arbutina; variabilidad genética y fitoquímica; tamaño del genoma; haplotipos; naturalesantioxidantes

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1. Introducción

La síntesis de metabolitos especializados de plantas varía en el tiempo (es decir, ontogenia, fenología y defensas inducidas) y en el espacio, ya que juega un papel crucial en la adaptación de las plantas a las condiciones ambientales, mientras que la variación genética también explica la quimiodiversidad [1]. Entre estos compuestos, los fenoles tienen una diversa gama de estructuras mono y poliméricas que cumplen una amplia gama de funciones fisiológicas [2]. La biosíntesis de metabolitos especializados se ve muy afectada por factores ambientales como la temperatura, la precipitación o la radiación solar, que a su vez a menudo están sujetos a gradientes latitudinales, longitudinales o altitudinales. En particular, la acumulación de compuestos fenólicos es una respuesta general a los niveles elevados de radiación UV-B (280–315 nm). Se han informado variaciones de compuestos específicos en plantas que crecen en la región mediterránea durante el verano y en altitudes elevadas, donde se produce una mayor incidencia de UV-B y los ácidos cinámicos y los flavonoides mostraron las tasas más altas de absorción de UV [3].

Arbutina(hidroquinona-D-glucósido) es un compuesto fenólico simple con una presencia restringida en las hojas de algunas especies pertenecientes a géneros como Arbutus, Arctostaphylos, Pyrus o Vaccinium. La principal fuente natural de arbutina, la gayuba (Arctostaphylos uva-ursi ( L.) Spreng.) se ha utilizado durante siglos para tratar infecciones del tracto urinario y otras enfermedades renales [4], y las formulaciones a base de hierbas todavía se preparan en la actualidad [5]. En los últimos años, el espectro de aplicaciones dearbutinase ha ampliado, principalmente como un agente natural para blanquear la piel en la industria cosmética [6] y en terapias clínicas debido a suantioxidantepropiedades antibióticas, antiinflamatorias y antitumorales [7]. En consecuencia, existe un creciente interés en encontrar fuentes naturales adicionales dearbutina, así como procesos biotecnológicos que pueden sustituir a la síntesis química [8,9]. En este contexto, la producción in vitro de arbutina utilizando cultivos celulares de Datura inoxia ha alcanzado la escala piloto [10].

Además dearbutina, otros compuestos fenólicos contribuyen a las propiedades activas de A. uva-ursi, como los flavonoides y los taninos [11,12], de los cuales la catequina y la corilagina son las hojas más relevantes, respectivamente [13]. En la industria alimentaria, los compuestos naturales como los fenoles vegetales están reemplazando a los sintéticos.antioxidanteconservantes [14]. A. uva-ursi se ha utilizado como aditivo, especialmente en productos cárnicos [15–19] pero también en envases activos [20]. Finalmente, recientemente se ha propuesto el potencial de A. uva-ursi como fuente de agentes curtientes para la industria del cuero [21].

La monografía de la "hoja de gayuba" de la Agencia Europea de Medicamentos [5] proponía un mínimo del 7 por ciento dearbutinacontenido en hojas secas como requisito para las preparaciones a base de hierbas. Los estudios realizados durante las últimas décadas describieron contenidos de arbutina en hojas de gayuba que varían de 0 por ciento a 18 por ciento, explicado por procedimientos analíticos, variabilidad natural, condiciones de crecimiento y fecha de cosecha [4]. El contenido de arbutina generalmente se determina mediante cromatografía líquida de alto rendimiento [4,12,22–24], y estudios previos detectaron niveles más altosarbutinacontenido en plantas de gayuba recolectadas en otoño que en las recolectadas en primavera [4]. Se han descrito diversos quimiotipos de gayuba, asociados a la distribución geográfica ya la diferenciación intraespecífica en subespecies de A. uva-ursi. La variación fitoquímica más llamativa reportada es la ausencia de arbutina en A. uva-ursi subsp. stipitata Packer y Denford, pero también se han mencionado diferencias en los contenidos de metilarbutina, ácido elágico o miricetina. La quercetina también está presente en las hojas de gayuba, en las que tanto las agliconas como sus 3-O-glucósidos son los flavonoides que se encuentran con mayor frecuencia [4]. Sin embargo, la mayoría de estos estudios se realizaron hace varias décadas y, en la actualidad, la variación intraespecífica de la gayuba se considera continua. Las 14 subespecies descritas, incluida una de España (A. uva-ursi subsp. crassifolius (Braun-Blanq.) Rivas Mart. ex Torre, Alcaraz y MB Crespo), actualmente son nombres no aceptados y sinónimos de A. uva-ursi [ 25]. Por lo tanto, se necesitan nuevas investigaciones para mejorar nuestro conocimiento sobre los compuestos realmente presentes en la materia prima cosechada en diferentes lugares con fines industriales, ya que se ha descrito que el perfil químico de las hojas de A. uva-ursi incluye una diversa gama de fenoles, taninos, y flavonoides en estudios más recientes realizados para investigar las diferencias a nivel interespecífico [23,26,27].

La diversidad genética (incluida la citogenética) a nivel de población promueve la adaptación a diferentes condiciones ambientales [28]. Recientemente se revisaron los efectos de la poliploidización en la producción de metabolitos especializados en plantas medicinales y aromáticas [29]. En este contexto, el tamaño del genoma es un parámetro ampliamente utilizado en las evaluaciones de la variabilidad de las plantas, ya que la variación intraespecífica a menudo se detecta ([30] y las referencias allí), se correlaciona con muchos otros rasgos biológicos y juega un papel relevante en los procesos evolutivos [31–35 ]. Sin embargo, los estudios que abordan la asociación entre la cantidad de ADN nuclear (es decir, el tamaño del genoma) y la diversidad fitoquímica son muy escasos [36,37]. La relación entre la diversidad fitoquímica y genética ha sido evaluada usando marcadores de ADN nuclear pero especialmente plástido [38], particularmente en especies de plantas medicinales [39] y cultivadas [40].

La gayuba está ampliamente distribuida por toda el área circumboreal, pero la mayoría de las poblaciones silvestres recolectadas en Europa se encuentran en los países del Este, Austria, Suiza, Italia y España. Arctostaphylos uva-ursi crece en la parte media oriental de España, en montañas, en altitudes que van desde los 550 hasta los 2350 m sobre el nivel del mar (snm). Es más común en el norte ya que las poblaciones ubicadas en latitudes más bajas son menos frecuentes y suelen tener menos individuos. Los estudios existentes sobre la variabilidad del contenido de arbutina en España se referían a valores que oscilaban entre el 8 % en poblaciones del noreste [41] y el 19 % en material vegetal español evaluado en un estudio realizado en Alemania [42]. Nuestro estudio tiene como objetivo dilucidar los factores, incluido el tamaño del genoma y la diversidad genética, que explican la variación fitoquímica en la distribución natural de la gayuba en España. Nuestros resultados podrían contribuir a la selección de material vegetal para la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria.

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2. Resultados y Discusión

2.1. Análisis de diversidad química

Muestras de hojas de gayuba de un total de 249 plantas que crecen en 42 localidades españolas, y durante un período de tres años, 2014-2016 (Figura 1, Tabla S1), mostraron diferentes porcentajes de peso seco (dr wt), que van desde 46,7 (LO) a 55,1 por ciento (CP), con un promedio de 50,1 ± 2,7 por ciento (datos no mostrados). Se emplearon extractos metanólicos preparados a partir de muestras recolectadas en 2014 y 2015 para las determinaciones de fenoles totales y contenido de arbutina. Observamos un amplio rango de variaciones continuas para ambos parámetros con diferencias significativas (p < 0.001)="" entre="" plantas.="" los="" extractos="" de="" hojas="" de="" 80="" plantas="" muestreadas="" en="" otoño="" de="" 2014="" (figura="" 2a)="" mostraron="" contenidos="" fenólicos="" totales="" que="" oscilaban="" entre="" 103,3="" ±="" 4,8="" mg="" gae/g="" dr="" wt="" (muestra="" li-4)="" y="" 206,4="" ±="" 6,5="" mg="" gae/g="" dr="" wt="" (sr="" -2),="">arbutinael contenido fluctuó de 92.0 ± 3.0 mg/g dr wt (AN-6) a 194.2 ± 5.6 mg/g dr wt (SE-8). El análisis de extractos preparados a partir de hojas recolectadas en 2015 de 94 plantas (Figura 2b) también mostró una amplia variación fitoquímica, de 110,5 ± 3,6 mg GAE/g dr wt(PI-4) a 200,9 ± 9,8 mg GAE/g dr wt (LO-4) en contenido fenólico total, mientras que el contenido de arbutina varió entre 87,1 ± 0,4 mg/g dr wt (ET-2) y 211,5 ± 5,9 mg/g dr wt (LI -2). Además, independientemente del año de recolección, diferencias significativas en fenoles totales yarbutinase detectaron contenidos entre plantas de gayuba que crecían en la misma ubicación para la mayoría de las poblaciones (datos no mostrados). Los niveles de arbutina se correlacionaron significativamente con el contenido total de fenoles en los extractos de hojas de gayuba, ya que estimamos coeficientes de Pearson significativos de {{0}} .332 (p=0.003) para 2014 y 0.289 para datos de 2015 (p=0.005). Los contenidos de arbutina de las 48 plantas muestreadas en ambos años no variaron significativamente (p=0.380).

A pesar de la variabilidad encontrada dentro de las poblaciones, e independientemente del año de cosecha, el análisis de varianza mostró que los contenidos de arbutina de los extractos de hojas de gayuba también dependían (p < {{0}}.00="" 1)="" sobre="" la="" ubicación="" de="" la="" población="" (figura="" 3a,b),="" como="" ocurrió="" con="" el="" contenido="" de="" fenoles="" totales="" de="" las="" hojas="" de="" gayuba="" analizadas="" en="" 2015="" (p="">< 0.001,="" figura="" 3b).="" en="" cambio,="" no="" se="" observaron="" diferencias="" significativas="" en="" el="" contenido="" de="" fenoles="" totales="" (p="0.080)" entre="" las="" 10="" poblaciones="" muestreadas="" en="" 2014,="" las="" cuales="" se="" ubicaron="" en="" un="" área="" relativamente="" pequeña,="" pero="" distribuidas="" en="" un="" amplio="" rango="" altitudinal,="" desde="" 424="" (ba="" población)="" a="" 1410="" m="" snm="" (población="" pa).="" esta="" variación="" en="" la="" altitud="" se="" asoció="" a="" diferencias="" en="" las="" condiciones="" climáticas="" (cuadro="" s1),="" ya="" que="" las="" ubicaciones="" a="" mayor="" altitud="" se="" caracterizaron="" por="" temperaturas="" medias="" más="" bajas="" (coeficiente="" de="" correlación="" de="" pearson,="" r="−0.666," p="">< 0.001)="" y="" precipitaciones="" anuales="" más="" altas="" (="" r="0.485," p="">< 0.001),="" lo="" que="" a="" su="" vez="" resultó="" en="" niveles="" de="" radiación="" global="" más="" bajos="" (r="−0.390," p="">< 0.001).="" además,="" a="" partir="" de="" este="" conjunto="" de="" datos,="" estimamos="" una="" correlación="" positiva="" baja="" pero="" significativa="" entre="" la="" precipitación="" anual="" y="" el="" contenido="" total="" de="" fenoles="" de="" las="" plantas="" de="" gayuba="" (coeficiente="" de="" spearman="" rho="0.256," p="0.022)," mientras="" que="" a="" partir="" del="" conjunto="" de="" datos="" de="" 2015="" cuando="" muestreamos="" poblaciones="" en="" un="" área="" más="" grande,="" detectamos="" una="" correlación="" positiva="" significativa="" entre="" la="" lluvia="" anual="" y="" el="" contenido="" de="" arbutina="" (rho="0.246," p="0.017)." esta="" correlación="" significativa="" indica="" que="" las="" plantas="" de="" gayuba="" que="" crecen="" en="" lugares="" del="" norte="" y="" en="" altitudes="" relativamente="" más="" altas="" mostraron="" con="" frecuencia="">arbutinacontenidos (rho=0.217, p=0.035 y rho=0.269, p=0.009, respectivamente). Como se mencionó, estos contenidos más altos de arbutina se correlacionaron significativamente con los contenidos más altos de fenoles totales de las hojas de gayuba, que fueron similares (en promedio 154,4 ± 19,6 mg GAE/g dr wt) a los encontrados en extractos acuosos de otras especies de plantas empleadas comoantioxidanteaditivos en la industria alimentaria [43], como el romero (185,0 mg GAE/g dr wt), el té (149,3 mg GAE/g dr wt) o la guayaba (154,4 mg GAE/g dr wt). Estos resultados están de acuerdo con referencias previas y fueron corroborados en un estudio realizado por Wrona et al. [20] usando algunas de las muestras de hojas de gayuba españolas recolectadas en 2015, para las cualesantioxidantecapacidad se asoció con mayorarbutinacontenido. También se pudieron identificar genotipos élite de gayuba para este fin, como los individuos 1, 4, 7 y 8 de la población LO, que acumularon en promedio 183,3 ± 16,4 mg GAE/g dr wt en los dos años de estudio.

Con el fin de dilucidar aún más los factores climáticos y geográficos que afectan los patrones de variación fenólica, realizamos una recolección de muestras más exhaustiva en el otoño 2016: 140 plantas de gayuba que crecen en 29 ubicaciones, y cuantificamos cinco compuestos fenólicos (Figura S1a) que se identificaron por coelución con estándares en un gradiente de acetonitrilo/agua (Figura S1b). El análisis mostró amplios rangos de variación continua para los contenidos de glucósido de arbutina, ácido cafeico, catequina, miricetina y quercetina, con diferencias significativas entre las plantas que también se observaron generalmente dentro de las poblaciones (datos no mostrados). Para los componentes fenólicos principales, encontramos que el contenido de arbutina varió de 91,1 ± 5.0 (LB{{10}}) a 232,4 ± 2,8 mg/g dr wt (PT{{15 }}), mientras que el contenido de catequinas varió de 4,1 ± 0,1 (AF{{20}}) a 45,5 ± 1,4 mg/g dr wt (LB-5). Con respecto a los otros dos flavonoides determinados, la miricetina no se detectó en algunas plantas de varias poblaciones, mientras que alcanzó 21.2 ± 1.2 mg/g dr wt en PO{{30}}, y el glucósido de quercetina varió de 3.8 ± 0.1 (CO -3) a 22,8 ± 0,8 mg/g de peso seco (BT-3). Se determinaron contenidos más bajos de ácido cafeico en extractos de hojas de gayuba, que variaron de 1,8 ± 0,0 (IZ-1) a 7,1 ± 0,3 mg Plantas /g dr wt (SI-4).

A pesar de la variación observada entre individuos, también se estimaron diferencias significativas entre poblaciones para estos cinco compuestos (pruebas de Kruskal-Wallis, p < {{0}}.001,="" y="" p="0." 009="" para="" el="" contenido="" de="" ácido="" cafeico).="" se="" determinaron="" contenidos="" más="" altos="" de="" arbutina,="" en="" promedio,="" en="" plantas="" de="" las="" poblaciones="" naturales="" ab,="" gu,="" ln="" y="" lo="" (figura="" 4a),="" que="" diferían="" significativamente="" (después="" de="" la="" corrección="" de="" bonferroni)="" de="" los="" bajos="" contenidos="" encontrados="" en="" las="" plantas="" de="" la="" población="" lb="" (186.7="" ±="" 22.3,="" 193,9="" ±="" 12,1,="" 169,5="" ±="" 10,0="" y="" 169,2="" ±="" 5,2="" mg/g="" peso="" seco="" frente="" a="" 111,8="" ±="" 16,0="" mg/g="" peso="" seco,="" respectivamente).="" otra="">arbutinael contenido de plantas que habían sido muestreadas también en 2015 no varió significativamente entre años (p=0.821). La población LB mostró a su vez mayor nivel medio de catequina (Figura 4b), que difería significativamente de los bajos contenidos medios de este flavonoide detectados en las poblaciones AF y LC (32,8 ± 9,8 frente a 5,7 ± 1,9 y 5,3 ± {{2{{62} }}}.5 mg/g dr wt, respectivamente). Los contenidos medios de glucósido de miricetina y quercetina se muestran en la Figura 4c, con diferencias significativas entre las poblaciones AB, CG, LB y PO, con contenidos más altos de miricetina (15.1 ± 4.0, 14.6 ± 5.7, 10 0,7 ± 2,8 y 17,2 ± 3,9 mg/g dr wt, respectivamente), en comparación con los niveles bajos que se acumularon en las plantas promedio de las poblaciones CO y OD (1,2 ± 1,5 y 2,4 ± 3,6 mg/g dr wt, respectivamente) , y también significa que los contenidos de glucósido de quercetina determinados en las poblaciones AA, BT, CP, IZ y LB (15,2 ± 3,7, 15,9 ± 4,6, 11,8 ± 2,3, 15,7 ± 3,4 y 13,1 ± 4,6 mg/g peso seco, respectivamente) diferían significativamente de eso en la población CO (4.0 ± 0.1 mg/g dr wt). Por el contrario, el contenido medio de ácido cafeico osciló de 2,1 ± 0,2 mg/g peso seco en las poblaciones AB, CE, PT y SA, a 3,5 ± 1,2 mg/g peso seco en la población AF o 3,4 ± 2,2 mg/g peso seco en población SI; por lo tanto, no se observaron diferencias significativas debido a la variación intrapoblacional (contenido promedio 2,7 ± 0,8 mg/g peso seco). Estos resultados complementan la variación en los metabolitos fenólicos observada por Wrona et al. [20], para ocho de las ubicaciones de gayuba muestreadas en 2015 que se analizaron utilizando la tecnología UPLC®-ESI-Q-TOF con MSE.

A diferencia de los resultados obtenidos en el análisis realizado con muestras de gayuba de 2014 y 2015,arbutinaLos contenidos determinados en 2{{10}}16 muestras mostraron una correlación positiva baja pero significativa con la radiación (rho=0.256, p=0.002) y las temperaturas medias máximas (rho{ {5}}.183, p=0.030), y por lo tanto estaban inversamente correlacionados con los valores de precipitación anual (rho=−0.265, p=0.002). Estas diferencias también se asociaron con la variación en la altitud (rho=−0.192, p=0.023), pero esta correlación negativa se explica por la baja mencionadaarbutinacontenidos de plantas de la población LB que se ubican a 1720m. Se observó un patrón de variación similar para los contenidos de miricetina, ya que los niveles más altos de este compuesto se asociaron significativamente con plantas de gayuba que crecían en lugares bajo niveles de radiación más altos (rho=0.226, p=0.{{1{{ 12}}}}07). El patrón opuesto al de la arbutina se observó para la catequina, ya que se estimó una correlación positiva entre este flavonoide y la precipitación anual (rho=0.398,p < 0.0{{23="" }}1),="" por="" lo="" que="" se="" detectaron="" correlaciones="" negativas="" con="" la="" radiación="" y="" con="" la="" temperatura="" media="" máxima="" (rho="−0.307," p="">< 0.001="" y="" rho="−0.470," p="">< 0.001,="" respectivamente).="" esta="" variación="" en="" los="" factores="" climáticos="" explicó="" que="" tanto="" la="" altitud="" como="" la="" latitud="" afectaron="" el="" contenido="" de="" catequinas="" de="" las="" hojas="" de="" gayuba="" (rho="0.410" y="" 0.490,="" respectivamente,="" p="">< 0.001).="" un="" análisis="" de="" componentes="" principales="" realizado="" con="" datos="" fitoquímicos,="" climáticos="" y="" geográficos="" correspondientes="" a="" las="" 29="" localidades="" muestreadas="" en="" 2016,="" en="" el="" que="" los="" dos="" primeros="" componentes="" explicaron="" el="" 60="" por="" ciento="" de="" la="" variación="" observada,="" corroboró="" estos="" resultados="" (figura="" 5).="" no="" detectamos="" ninguna="" correlación="" significativa="" entre="" los="" contenidos="" de="" ácido="" cafeico="" o="" glucósido="" de="" quercetina="" de="" las="" plantas="" de="" gayuba="" y="" los="" factores="" climáticos="" o="" geográficos,="" aunque="" estimamos="" correlaciones="" ligeras="" pero="" significativas="" entre="" los="" contenidos="" de="" miricetina="" y="" glucósido="" de="" quercetina="" (rho="0.184," p="" {{31}="" }.030)="" y="" entre="" los="" contenidos="" de="" miricetina="" y="" ácido="" cafeico="" (rho="−0.176," p="0.037)" de="" las="" plantas="" de="">

Los patrones climáticos contrastantes observados de variación enarbutinacontenido de plantas de gayuba sugieren que, aunque la biosíntesis de este metabolito probablemente aumente en condiciones de mayor radiación y temperatura, probablemente la escasez de agua sea un factor limitante para A. uva-ursi en las regiones del Mediterráneo y del sur. Del Valle et al. [44] reportaron un patrón latitudinal de acumulación de flavonoides de Silene littorea (Caryophyllaceae) en España, donde se determinaron mayores contenidos de flavonoides en las poblaciones del sur, ya que la latitud se correlacionó negativamente con la radiación UV-B y la temperatura, y positivamente con la precipitación. La radiación global muestra un claro gradiente latitudinal con una mayor incidencia en el Sur y Este de la Península Ibérica, y también hay un efecto orográfico importante ya que la persistencia de las nubes modula la incidencia de esta radiación a mayor altura. Mapa de radiación UV de España [45] alta correlación referida (r > 0.9) entre UV-B y los datos de radiación global. De acuerdo con esta referencia, las poblaciones de gayuba que mostraron mayor promedioarbutinaLos contenidos de nuestro estudio se encuentran principalmente en áreas bajo niveles de radiación UV-B de 2403–2451 J/m2.

Nuestros resultados para la variación de catequinas en la gayuba mostraron un patrón geográfico (Figura 5) y concuerdan con los estudios realizados en otras especies de plantas de los países del norte de Europa. Se informaron contenidos más altos de metabolitos especializados, como flavonoides y antocianinas, en plantas que crecían en latitudes más altas, probablemente debido a períodos más largos de luz diurna y temperaturas nocturnas más bajas [46]. Por lo tanto, el contenido fenólico soluble en las agujas de Juniperus communis aumentó con la latitud y la altitud en las poblaciones de Finlandia [47], y también se encontraron contenidos fenólicos 10-19 por ciento más altos en una latitud más alta en frutos de tres Ribes spp. cultivares analizados en dos lugares finlandeses [48]. Estos autores relacionaron un menor contenido de fenoles con mayores niveles de radiación y temperatura. El contenido de flavonoides en frutos de dos especies de Vaccinium (también de la familia Ericaceae) mostró un gradiente geográfico, con mayores cantidades de flavonoides en las latitudes del norte [49,50].

En relación con la variación altitudinal, se determinaron niveles más altos de flavonoides en poblaciones de otras especies de Ericaceae, Calluna vulgaris, que crecían en altitudes más altas [51]. Los gradientes altitudinales también afectaron el metabolismo especializado de las poblaciones españolas de Arnica montana [52] y Quercus robur [53]. Este último trabajo refirió una asociación positiva significativa entre la concentración de fenoles foliares totales y la elevación, dependiendo el gradiente únicamente de los flavonoides, lo que sugiere que estos compuestos impulsaron la relación para los compuestos fenólicos totales. Estos resultados concuerdan con nuestras estimaciones para el patrón de contenido de catequinas. Finalmente, un gradiente de lluvia se asoció con diferencias significativas en la composición de polifenoles en un arbusto medicinal africano (Myrothamnus flabellifolia) para el cual las diferencias metabolómicas fueron congruentes con la estructura genética de las poblaciones [54].

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2.2. Análisis de datos de tamaño y secuencia del genoma

Los valores del tamaño del genoma 2C de las plantas de gayuba oscilaron entre 2,50 y 3,15 pg (Tabla 1). Se han encontrado ligeras diferencias en la cantidad de ADN nuclear entre las poblaciones (Kruskal-Wallis χ2=87.639, df=36,p=3.39 × 10−6). La prueba de Dunn con corrección de Bonferroni reveló diferencias estadísticamente significativas entre: poblaciones AL y SI (Z=−3.972, p=0.024), LE y SI (Z=−4.196, p {{ 21}}.009), y SE y SI (Z=−4.236, p=0.008). La población de Pontils (PO) es la localidad tipo de A. uva-ursi var. crassifolius, que posteriormente se combinó como A. uva-ursi subsp. crassifolius, y actualmente no considerado taxonómicamente (ver introducción), tiene un valor intermedio (2.88 pg), dentro del rango de valores obtenidos en otras poblaciones de la especie. Este es el primer estudio poblacional extenso de la cantidad de ADN nuclear en la especie y en todo el género, ya que la única información disponible hasta la fecha proviene de una población balcánica del mismo taxón [55]. El valor 2C informado allí, 2,49 pg, se coloca justo en el límite inferior del rango de variación del conjunto de datos aquí investigado. No se encontró correlación entre los valores del tamaño del genoma y la altitud de la población. La cantidad de ADN de los individuos mostró una débil correlación positiva significativa con laarbutinacuando se compararon los datos de 158 plantas de gayuba (rho=0.187, p=0.018), mientras que no se encontró ninguna otra correlación significativa entre el tamaño del genoma y otras variables. Este resultado está de acuerdo con los aumentos informados en la producción de metabolitos especializados que generalmente se observan en plantas medicinales y aromáticas después de la poliploidización [29].

Las secuencias recién producidas para los espaciadores intergénicos rpl{{0}}trnL y psbE-petN se alinearon en dos matrices (que contenían 566 y 874 pb respectivamente) que se concatenaron en una sola matriz de 1440 pb. Moderada se detectaron niveles de variación en estas regiones de plástidos (seis sustituciones de nucleótidos y cuatro indeles). Se encontraron diez haplotipos diferentes con una diversidad total de haplotipos (Hd) de 0.468 (Tabla 1). La mayoría de las poblaciones (21) contenían solo un haplotipo, mientras que cinco de ellas exhibieron cierta diversidad entre los individuos. El haplotipo 1 más abundante mostró la frecuencia más alta (71,4 por ciento), seguido del haplotipo 2 (15,2 por ciento), mientras que el resto mostró frecuencias mucho más bajas (0,04–0,01 por ciento). La distribución geográfica de los haplotipos se muestra en la Figura 6. El haplotipo 1 se encontró en 32 poblaciones, se fijó en 18 de ellas, distribuidas en todas las regiones muestreadas, excepto en las localidades más al sur. El haplotipo 2 se encontró en diez poblaciones y fue el haplotipo exclusivo en las dos poblaciones más al sur (HU y LV), así como en PR. El haplotipo 4 fue propio de tres poblaciones de los Pirineos, mientras que el haplotipo 8 apareció en dos poblaciones del este de la Península Ibérica. En cuanto a las relaciones evolutivas que se muestran en la red de parsimonia (Figura 6), la mayoría de los haplotipos están conectados por uno o dos pasos de mutación. El haplotipo 1 ocupa una posición central, con siete haplotipos conectados a él.

Una prueba de Mantel entre las matrices de distancia por pares genéticas y químicas del pDNA mostró una correlación débil pero significativa (r=0.301; p=0.048) entre la diferenciación genética y la concentración de los cinco componentes químicos medidos para la Conjunto de datos de 2016. La prueba de Mantel no reveló ninguna correlación significativa entre la distancia genética y geográfica entre las 25 poblaciones muestreadas en 2016 (r=0.103, p=0.207) o entre las distancias por pares químicas y geográficas entre estas 25 poblaciones (r=0.191, p=0.050). La variabilidad fitoquímica reportada aquí para las poblaciones silvestres de gayuba en toda España se complementa, por lo tanto, con niveles moderados de variación de haplotipos de pDNA, siendo la diferenciación genética norte-sur encontrada en las poblaciones de gayuba comparable a los patrones filogeográficos encontrados en otras plantas (p. ej., [56–58]. Toda esta homogeneidad es esperable en plantas con baja capacidad reproductiva [59], como A. uva-ursi, que exhibe bajas tasas de germinación y altas tasas de mortalidad de plántulas jóvenes [4] Sin embargo, la modesta diferenciación genética mostrada por pDNA se correlacionó con bioquímica. distancias por pares estimadas a partir de perfiles de cinco fenólicos Figura 6. Distribución geográfica de haplotipos de ADNp en poblaciones ibéricas de Arctostaphylos uva-ursi.Los códigos de población corresponden a los de la Tabla S1 y los gráficos circulares representan el porcentaje de individuos que muestran cada haplotipo en cada población. rectángulo, la red de parsimonia estadística que muestra las relaciones evolutivas del te Se representan los haplotipos de plástidos encontrados en poblaciones de A. uva-ursi. Cada franja a lo largo de las líneas que conectan los haplotipos indica un paso mutacional en las regiones de pDNA secuenciadas en este estudio. Una prueba de Mantel entre las matrices de distancia por pares genética y química de pDNA mostró una correlación débil pero significativa (r=0.301; p {{28 }}.048) entre la diferenciación genética y la concentración de los cinco componentes químicos medidos para el conjunto de datos de 2016. La prueba de Mantel no reveló ninguna correlación significativa entre la distancia genética y geográfica entre las 25 poblaciones muestreadas en 2016 (r=0.103, p=0.207) o entre las distancias por pares químicas y geográficas entre estas 25 poblaciones ( r=0.191, p=0.050). La variabilidad fitoquímica reportada aquí para las poblaciones silvestres de gayuba en toda España se complementa, por lo tanto, con niveles moderados de variación de haplotipos de pDNA, siendo la diferenciación genética norte-sur encontrada en las poblaciones de gayuba comparable a los patrones filogeográficos encontrados en otras plantas (p. ej., [56-58]. Toda esta homogeneidad es esperable en plantas con una baja capacidad reproductiva [59], como A. uva-ursi, que exhibe bajas tasas de germinación y altas tasas de mortalidad de las plántulas jóvenes [4].Sin embargo, la modesta diferenciación genética mostrada por el pDNA se correlacionó con las distancias bioquímicas por pares estimadas a partir de perfiles Este patrón de variación genética y fitoquímica (que, como se mencionó, no estaba asociado con distancias geográficas), así como la correlación débil pero significativa entre el tamaño del genoma y el contenido de arbutina, puede indicar que la variabilidad genómica natural afecta el rendimiento de compuestos fenólicos en A. uva-ursi Sin embargo, m molecular hipervariable Se necesitan investigadores en un muestreo poblacional más extenso para corroborar estos patrones filogeográficos y la asociación entre la variabilidad genética y bioquímica.

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3. Materiales y Métodos

3.1. Material vegetal

Para el análisis fitoquímico, se muestrearon un total de 249 plantas de gayuba que crecían en 42 poblaciones en otoño de 2014, 2015 y 2016, siendo representativas de la distribución natural de esta especie vegetal en la Península Ibérica (Figura 1 y Tabla S1). Primero, en otoño de 2014, recolectamos brotes terminales de 80 plantas en diez poblaciones españolas (AG, AN, BA, LI, LO, PE, PÁ, SR, SC y SE) ubicadas en un área relativamente pequeña (80 × 50 km aproximadamente) en el norte de España pero en un amplio rango de altitud (424–1410 m snm). En segundo lugar, en otoño de 2015 recolectamos 48 plantas de seis de estas poblaciones (AG, LI, LO, PA, SE y SR) y 46 plantas de gayuba de seis poblaciones ubicadas en latitudes más bajas (AL, CH, ET, HU, LV , y PI). Para cada población, muestreamos ocho plantas separadas por lo menos 5 m, excepto en HU, donde encontramos solo seis individuos. En tercer lugar, en otoño de 2016, se muestrearon un total de 140 plantas en 29 ubicaciones diferentes (de 1 a 6 individuos de cada una), incluidas 26 nuevas localidades españolas (IZ, CE, BT, MO, AA, GU, SI, AF, SA, PT, AB, CG, OD, PS, LB, CO, LE, MA, CP, PO, MZ, AV, LC, AY,LN y ZU). Nuestro muestreo abarca un rango de altitud de 534 a 1750 m. En total, las 42 poblaciones representan una amplia gama de condiciones climáticas (Tabla S1): la temperatura media máxima mostró una variación 2- veces mayor (13–26 ◦C) y la precipitación anual osciló entre 399 (ZU) y 1589 mm (PT). La radiación global osciló entre 4,2 y 5,1 kWh/m2d. Se recogieron de seis a diez brotes terminales (15-20 cm de largo) por cada planta para obtener 6-15 g de hojas sanas, que posteriormente se escindieron y secaron a 60 ◦C hasta peso constante (3-4 días). Después de las determinaciones de peso seco, las hojas se homogeneizaron manualmente en un mortero y se almacenaron a 4 ◦C hasta su análisis. Este material vegetal se empleó para determinaciones de fenoles totales y HPLC.

Los materiales foliares para las evaluaciones de citometría de flujo se obtuvieron de hojas frescas de 178 individuos pertenecientes a un total de 37 poblaciones (Cuadro 1). Se obtuvieron muestras de 33 de las poblaciones mencionadas anteriormente, y de cuatro nuevas poblaciones (BE, JO y PR en España, y EN en Andorra) donde se recolectaron hojas en la primavera de 2017, por lo que no se incluyeron en el análisis fitoquímico (Figura 1 y Tabla S1). Se midieron por duplicado de uno a seis individuos por población. Los materiales foliares para la extracción de ADN se secaron en gel de sílice y se almacenaron a temperatura ambiente. Se realizaron análisis de diversidad de ADN en un total de 105 plantas de 35 ubicaciones (Tabla 1).

Los testigos de plantas de las 46 poblaciones de gayuba estudiadas están depositados en el herbario BC, del Institut Botànic de Barcelona, ​​en el herbario BCN, del Centre de Documentació de BiodiversitatVegetal, Universitat de Barcelona o en el herbario JACA, del Instituto Pirenaico de Ecología( CSIC).

3.2. Preparación de Extractos de Hojas y Determinación de Fenoles Totales

Se prepararon tres réplicas de extractos de hojas de gayuba usando 50 mg de muestra seca y 10 ml de metanol al 80 por ciento. Los tubos se incubaron durante 30 min en un baño ultrasónico, luego los extractos se filtraron (0,45 mm) y se almacenaron a 4 ◦C hasta su análisis. Se determinó el contenido fenólico total en los extractos preparados a partir de muestras recolectadas en 2014 y 2015. Se siguió un método de Folin-Ciocalteume [60,61] con ligeras modificaciones: a 0.1 mL de extracto, 0.4 mL de metanol (80 por ciento), 0.5 mL de Folin– Se añadió reactivo de Ciocalteu y 8 mL de agua ultrapura. Después de 5 min en un baño ultrasónico, se añadió 1 ml de Na2CO3 20 por ciento (p/v). Las muestras se dejaron en la oscuridad durante 30 minutos antes de medir la absorbancia a 760 nm con un espectrofotómetro UV-visible (CARY 50 BIO, Varian, AgilentTechnologies). Los resultados se expresaron en equivalentes de ácido gálico (GAE); es decir, mg de ácido gálico/g de peso seco, usando una curva estándar de ácido gálico (40–340 µg/g).

3.3. Determinación de Arbutina y Otros Metabolitos Fenólicos

El contenido fenólico de los extractos metanólicos de hojas de gayuba se cuantificó mediante RP-HPLC usando un sistema HPLC-UV/Vis (LaChrom Merck Hitachi L-7400) con un Kinetex 5 µm-EVO C18(250 mm × 4,6 mm ) columna y absorbancia determinada a 280 nm. Los extractos de las muestras recolectadas en 2014 y 2015 se diluyeron 1:10 (v/v) y se inyectaron con una fase móvil de metanol y acetonitrilo. El programa de gradiente consistió en 0-5 min, 25 por ciento de metanol; 5–6 min, 100 por ciento; 6–10 min, 100 por ciento; y 10–20 min, nuevamente 25 por ciento de metanol. El caudal fue de 1 ml/min y el volumen de inyección fue de 20 µl. En estas condiciones, el tiempo de retención dearbutinafue de 2,6 min, lo que nos permitió determinar la concentración de este compuesto mediante una curva de calibración establecida con 6 diluciones de un patrón, desde 40 hasta 340 µg/g, con un coeficiente de correlación de r=0. 9997. Los extractos de las muestras recolectadas en 2016 se analizaron usando una fase móvil de metanol y agua con el siguiente programa de gradiente: 0–5 min, 10 por ciento de metanol; 5–6 min, 20 por ciento; 6–10 min, 20 por ciento; 10–11 min, 30 por ciento; 11 a 15 min, 30 por ciento; 15 a 16 min, 40 por ciento; 16–20 min, 40 por ciento; 20–21 min, 50 por ciento; 21–25 min, 50 por ciento; 25–26 min, 60 por ciento; 26–30 min, 60 por ciento; 30–31 min, 10 por ciento; y 31–36 min, nuevamente 10 por ciento de metanol. En estas condiciones, determinamosarbutina yotros 4 compuestos fenólicos: ácido cafeico, catequina, miricetina y quercetina-3-O-glucopiranósido utilizando las correspondientes curvas de calibración establecidas con 5 diluciones de estándares (25–500 µg/mL) ,que mostró coeficientes de correlación de {{10}}.9992 para catequina (tiempo de retención 12.0 min), 0.9924 para ácido cafeico (tiempo de retención 13.4 min), 0.9981 para quercetina{{16} }O-glucósido (tiempo de retención 23,4 min) y 0,9997 para miricetina (tiempo de retención 25,1 min).

El metanol y el acetonitrilo eran de grado HPLC y se compraron a Panreac (Barcelona, ​​España). Estándares (pureza mayor o igual al 98 por ciento) dearbutina, ácido cafeico y ácido gálico, así como el reactivo de Folin-Ciocalteu fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Barcelona, ​​España). Los estándares de catequina y quercetina-3-O-glucopiranósido se adquirieron de Extrasynthese (Genay Cedex, Francia), mientras que la miricetina se adquirió de Alfa Aesar (Karlsruhe, Alemania).

Los resultados de las determinaciones químicas se analizaron con el software SPSS v. 25 y R 3.5.2. Después de probar los datos para normalidad y homocedasticidad, realizamos el análisis de varianza de diferentes conjuntos de datos y pruebas de separación de medias (Tukey y Tamhane) o pruebas no paramétricas. como prueba de comparación múltiple de Kruskal-Wallis y Dunn con corrección de Bonferroni. También estimamos coeficientes de correlación (Pearson o Spearman según si los datos seguían una distribución normal) entre variables, incluido el tamaño del genoma.

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3.4. Estimaciones del tamaño del genoma y secuenciación del ADN

El tamaño del genoma de las plantas de gayuba se estimó por citometría de flujo en los Centres Científicsi Tecnològics de la Universitat de Barcelona (CCiTUB) siguiendo los procedimientos explicados en Pellicer et al. [62].Petunia hybrida Vilm. Se usó 'PxPc6' (2C=2.85 pg) como estándar interno. Las semillas del patrón fueron proporcionadas por Plateforme de cytométrie d'Imagerie-Gif, CNRS—I2BC (Gif-sur-Yvette, Francia). El contenido de ADN nuclear (2C) se calculó multiplicando el contenido de ADN conocido del patrón por el cociente entre el posiciones máximas (moda) de la especie objetivo y el estándar en el histograma de intensidades de fluorescencia, asumiendo una correlación lineal entre las señales fluorescentes de los núcleos teñidos de la muestra desconocida, el estándar interno conocido y la cantidad de ADN [63].

Se utilizaron aproximadamente 20 mg de tejido foliar secado con sílice para la extracción de ADN utilizando un protocolo CTAB [64] con modificaciones menores. La calidad del ADN total se verificó con un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (ThermoScientific, Wilmington, DE, EE. UU.). Las regiones intergénicas de plástidos rpl32-trnLand psbE-petN, así como la región de ADN ribosómico nuclear ITS, se amplificaron y secuenciaron para tres individuos por población. Las secuencias de ITS no presentaron variabilidad dentro de los 105 individuos analizados, a excepción de algunas posiciones que mostraron polimorfismos de nucleótidos intragenómicos. Por lo tanto, esta región de ADN ribosómico nuclear se excluyó de análisis posteriores. También se analizaron otras regiones de ADN de plástidos (es decir, ndhF; ndhF-rpl32; psbA-trnH; psbD-trnT; rps16; y trnL-trnF), pero se descartaron debido a la baja variabilidad o problemas de secuenciación. El procedimiento de amplificación se realizó como se describe en Vitales et al. [sesenta y cinco]. La secuenciación directa de los segmentos de ADN amplificados se realizó con Big Dye Terminator Cycle Sequencing v 3.1 (PE Biosystems, Foster City, California, EE. UU.) en la Unitatde Genòmica, CCiTUB, en un analizador de ADN ABI PRISM 3700 (PE Biosystems). Las secuencias rpl32-trnL y psbE-petN se ensamblaron con BioEdit versión 7.1.3.0 [66], se alinearon con ClustalW MultipleAlignment v1.4 [67] y se ajustaron manualmente. Los números de acceso de GenBank se proporcionan en la Tabla S2.

3.5. Tamaño del genoma y análisis genético

Se realizó una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis para verificar diferencias estadísticamente significativas en los valores de 2C entre las poblaciones. También se realizó la prueba de comparación múltiple de Dunn para determinar qué poblaciones presentaban diferencias significativas entre ellas. Se aplicó la corrección de Bonferroni para minimizar el error tipo I (falso positivo).

Los parámetros de diversidad genética (sitios polimórficos, sitios informativos de parsimonia, el número de haplotipos y la diversidad total de haplotipos) se estimaron utilizando DnaSP v6 [68]. Los haplotipos de plástidos se determinaron en un conjunto de datos combinado que incluía las regiones rpl32-trnL y psbE-petN. Los indel se codificaron con FastGap v.1.2 [69] y se trataron como eventos de mutación única. Las relaciones evolutivas entre los haplotipos se infirieron sobre la base de una red de parsimonia construida utilizando TCS [70] tal como se implementó en PopArt [71]. El número máximo de diferencias resultantes de sustituciones individuales entre haplotipos se calculó con límites de confianza del 95 por ciento.

Para analizar la relación entre los datos genéticos y químicos se realizó una prueba de Mantel. Primero, estimamos la distancia fenotípica entre 25 poblaciones utilizando datos de plantas de gayuba recolectadas en 2016, que habían sido medidas para cinco componentes fenólicos (es decir,arbutina, catequina, ácido cafeico, quercetina y miricetina). Utilizamos R Commander para estandarizar estos datos [72] y, posteriormente, para calcular la distancia química derivada de la matriz estandarizada con la función "Dist" onR basada en distancias euclidianas. En segundo lugar, se calculó una matriz de distancia por pares genéticos de población de Nei entre las 25 poblaciones utilizando DnaSP v6. Finalmente, calculamos las distancias geográficas por pares entre estas poblaciones usando el paquete "geodist" en R. Las correlaciones por pares entre las matrices de distancia se calcularon usando una prueba de Mantel con 10,000 permutaciones con la función mantel disponible en el paquete de R "vegan" [ 73].

4. Conclusiones

Todas las plantas de gayuba analizadas mostraronarbutinacontenidos superiores al 7 por ciento; por lo tanto, este material vegetal es apropiado para preparaciones a base de hierbas. Nuestro análisis reveló contenidos de arbutina superiores a los (hasta un 9 por ciento) referidos por Parejo et al. [40], quienes analizaron cuatro poblaciones situadas en el noreste de los Pirineos a 1580-2030 m y detectaron bajas diferencias en el contenido de arbutina entre poblaciones. Además, la mayoría de los valores determinados aquí están en el rango del material vegetal seleccionado para el cultivo en Polonia [74] y de acuerdo con la altaarbutinacontenido de muestras de hojas de gayuba españolas informado por Sonnenschein y Tegtmeier [42] al seleccionar plantas para su cultivo en Alemania. Los genotipos élite de A. uva-ursi pudieron ser propagados vegetativamente, pero la mayoría de los clones obtenidos fallaron durante el establecimiento en campo, lo que limitó la explotación de estos recursos. También describimos la variación existente en el contenido de tres flavonoides (catequina, miricetina y quercetina glucósido), así como de ácido cafeico, entre las poblaciones de gayuba españolas, y cómo los factores climáticos (principalmente la radiación global y las precipitaciones), que se correlacionan con la latitud y la altitud. gradientes, afectan esa variación. Al mismo tiempo, a pesar de los bajos niveles de variabilidad de haplotipos y tamaño del genoma determinados en A. uva-ursi ibérica, la diferenciación genética y citogenética de las poblaciones se asoció débil pero significativamente con la diversidad fitoquímica. En general, estos resultados destacan que se debe considerar el efecto de los factores genéticos y abióticos para explicar la variabilidad fitoquímica intraespecífica encontrada en plantas de poblaciones silvestres.

EFECTOS DE LA CITANCHE

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