El camino hacia el progreso de los estudios preclínicos de las enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad: una perspectiva sobre los modelos derivados de roedores y HiPSC, parte 3

Se han evaluado enfoques de vectores virales similares en varios modelos de EP, y las primeras versiones emplean AAV2/2 o LV.123-126 Estos vectores inyectados en cerebros de ratas adultas se utilizaron para administrar mutantes WT, A30P o A53T de a-syn humano para la enfermedad. inducción.

La relación entre los virus y la memoria puede parecer negativa para muchas personas, ya que los virus suelen provocar malestar físico y enfermedades. Sin embargo, los virus también pueden tener un efecto positivo en la mejora de la memoria, principalmente porque los ataques virales pueden promover la actividad del sistema inmunológico.

Los estudios han demostrado que los ataques virales pueden hacer que el sistema inmunológico del cuerpo responda, mejorando así la resistencia del cuerpo a los virus. Esta respuesta del sistema inmunológico incluye el aumento de la cantidad de glóbulos blancos y otras células inmunitarias producidas, así como la producción de anticuerpos. Estas respuestas no sólo ayudan al cuerpo a resistir la invasión viral sino que también ayudan a fortalecer la función del sistema inmunológico y mejorar la salud general del cuerpo.

Los ataques virales también activan las células inmunitarias del cerebro. Estas células inmunitarias pueden eliminar las células de desecho y corruptas del cerebro, mejorar la función del sistema nervioso y promover la transmisión de información y el procesamiento de la memoria. Los estudios también han demostrado que las personas con ciertas infecciones virales pueden desempeñarse mejor cuando se enfrentan a tareas de memoria.

Además, algunos estudios han descubierto que ciertos virus pueden estimular al cuerpo a producir factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), una sustancia que promueve el crecimiento y desarrollo de las neuronas. Esta sustancia tiene un efecto positivo sobre la función cerebral y puede promover la reparación física y la mejora de la memoria.

Por supuesto, en la batalla contra el virus, debemos adoptar el enfoque y la estrategia correctos, mantener buenos hábitos de higiene y dormir y hacer suficiente ejercicio para que nuestro sistema inmunológico esté en las mejores condiciones. En definitiva, aunque el virus puede causarnos malestar físico, cada vez hay más evidencia de que también puede favorecer la actividad del sistema inmunológico y tener un impacto positivo en nuestra salud y memoria. Se puede ver que necesitamos mejorar nuestra memoria, y Cistanche puede mejorar significativamente nuestra memoria porque Cistanche también puede regular el equilibrio de los neurotransmisores, como aumentar los niveles de acetilcolina y factores de crecimiento, que son muy importantes para la memoria y el aprendizaje. Además, Cistanche también puede mejorar el flujo sanguíneo y promover el suministro de oxígeno, lo que puede garantizar que el cerebro obtenga suficiente nutrición y energía, mejorando así la vitalidad y la resistencia del cerebro.

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Los autores demostraron una expresión eficiente de a-syn en neuronas nigral DA, acompañada de patologías moleculares y celulares y degeneración de nigralDA que evolucionó gradualmente con el tiempo.

No obstante, la primera generación de vectores rAAV2/2 utilizados en estos estudios mostró una pérdida neuronal progresiva, aunque la neurodegeneración de las neuronas tirosina-hidroxilasa positivas, así como el curso temporal, fue bastante variable (25%-80% y de 6 semanas a 1 año). , respectivamente).123,124

Por el contrario, los LV que codifican a-syn mutado en WT, A30P o A53T fueron capaces de inducir la pérdida de células neuronales en ratas de una manera más retrasada y más consistente (25%–40% y 5 meses, respectivamente).126 Ambos estudios demostraron una pérdida progresiva de la longitud de las neuritas y un perikarya inflamado en las neuronas DA restantes.

Además, se encontraron acumulaciones citoplasmáticas masivas de a-syn tanto en cuerpos celulares como en neuritas. Estos resultados se han replicado recientemente en múltiples estudios que utilizaron ambas plataformas virales.127-131

Los LV también se han utilizado en una variedad de modelos de EP en ratones. Por ejemplo, Lauwers y colegas125 demostraron que la inyección de LV que porta WT o A30P mutante de a-syn en el cuerpo estriado, la amígdala o SN de ratones era capaz de inducir cambios neurodegenerativos asociados con la EP de una manera dependiente del tiempo e incluía un agrandamiento neurítico independiente de a. e inclusiones citoplasmáticas.

Además, este estudio demostró que la sobreexpresión nigral de A30P-a-syn resultó en aproximadamente un 25% de pérdida celular entre 10 y 12 meses.125 La entrega de A30P, E57K y E35K al SN de la rata usando LV demostró un grado similar en la neurona DA. pérdida (alrededor del 50%) en comparación con el WT (30%), mientras que el mutante A53T de formación de fibrillas más rápido utilizado en el mismo estudio no mostró una disminución significativa en el número de células DA.

Curiosamente, las características neuropatológicas generales observadas en ratones (es decir, inicio y gravedad) parecieron menos graves en comparación con las ratas, aunque estas diferencias pueden ser un artefacto de la pureza viral o los títulos de producción del virus inyectado y/u otras discrepancias técnicas relacionadas.

Consideraciones importantes para los modelos de vectores virales de EA y EP

El desarrollo de nuevos serotipos, incluidos AAV2/1, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8, AAVrh10, DJ y DJ8, ha ampliado los objetivos celulares y mejorado las eficiencias de transducción de AAV.

Los AAV serotipados con estas nuevas cápsides se han probado en ratas y primates no humanos para sobreexpresar a-syn.132-137 La sobreexpresión de la forma S129A administrada a través de AAV2/5 y AAV2/6 muestra consistentemente una mayor toxicidad en el proceso de neurodegeneración.134,138

Estos experimentos también demostraron que la dosificación cuidadosa del transgén de sobreexpresión es crucial, ya que incluso los vectores de control que contienen sólo indicadores fluorescentes administrados con títulos altos pueden demostrar efectos tóxicos no específicos.135

Esta advertencia debe tenerse muy en cuenta al diseñar experimentos de rescate basados ​​en AAV. Por ejemplo, se ha demostrado que el AAV terapéutico que alberga un pequeño ARN de interferencia (ARNip) dirigido al SNCA produjo un alto nivel de toxicidad y provocó una pérdida significativa de neuronas DA nigroestriatales. Este estudio destacó aún más las limitaciones de las aplicaciones de AAV en estudios con animales.

Sin embargo, no se puede excluir que la neurotoxicidad haya sido causada por la fuerte reducción de los niveles de SNCA en modelos de ratas; asa-syn desempeña un papel bioquímico crucial en las neuronas DA y su fuerte reducción podría disminuir la viabilidad celular.139 En conjunto, esto subraya la importancia de desarrollar una herramienta para ajustar la expresión de genes asociados a enfermedades para diseñar enfoques de terapia génica.

En este sentido, el sistema más reciente basado en CRISPR-dCas9- puede presentar un sistema más ventajoso para modular la expresión genética de una manera precisa y afinada.

En esta línea, recientemente desarrollamos el sistema LV-CRISPR-Cas9 para lograr una regulación precisa y ajustada de la expresión del gen SNCA. El estudio proporcionó una prueba del concepto de que la manipulación de la expresión genética (p. ej., revertir la sobreexpresión) mediante la edición del epigenoma es una estrategia terapéutica valiosa para los trastornos neurológicos, como la EP,140 causados ​​por la desregulación genética.

Como tal, los modelos de EP de vector viral que utilizan LV y AAV para la sobreexpresión de la proteína a-syn muestran patología de EP asociada con la neurodegeneración de DA, y el uso de nuevos serotipos de AAV mejora la expresión de a-syn en las neuronas DA en comparación con AAV2/2.

En general, tanto los AAV como los LV son capaces de inducir la expresión transgénica y demuestran un alto nivel de tropismo por las neuronas DA, lo que resulta en niveles similares de neurodegeneración. Se necesitarán mejoras adicionales de estos sistemas virales para evitar la lenta progresión de los fenotipos celulares de la EP y niveles relativamente bajos de alteraciones del comportamiento.

Modelos de cultivo celular in vitro Descripción general de los modelos actuales de AD y PD in vitro: limitaciones y oportunidades

Durante las últimas cuatro décadas, se han desarrollado una variedad de modelos in vitro de EA y EP para examinar las interacciones entre aspectos clave de la fisiopatología de su enfermedad relativa y posteriormente se han utilizado para la detección terapéutica preclínica.

Los modelos in vitro actuales de EA y EP tienen como objetivo principal recapitular las características moleculares y celulares de las enfermedades, como la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo, la supervivencia celular y la presencia de agregados de proteínas intracelulares y/o extracelulares. Por ejemplo, los modelos celulares de EA más destacados y ampliamente utilizados se basan en la inducción de agregados de Ab40 42 o hiperfosforilación y agregación de tau141,142 (Tabla 1).

De manera similar, los modelos in vitro de EP se basan en la disfunción mitocondrial inducida por toxinas antes mencionada (p. ej., MPTP, rotenona, paraquat, 6-OHDA) y la alteración de la proteostasis (p. ej., tapsigargina, ionomicina, tunicamicina), sobreexpresión de a-syn y expresión de los genes familiares de EP mutados (p. ej., a-syn, Parkin, PINK1)92 (Tabla 2).

Si bien estos modelos de cultivo celular han sido invaluables para avanzar en nuestra comprensión de la neurobiología pertinente, aún no han dado como resultado DMT viables destinados a la prevención, el retraso en el inicio o la progresión más lenta de la enfermedad, lo que pone en duda su relevancia y validez traslacional.

Es importante reconocer varias limitaciones claras en estos modelos para mejorar las prácticas preclínicas actuales.

Por ejemplo, los modelos basados ​​en la sobreexpresión y eliminación/inhibición de genes pertinentes asociados a enfermedades son notoriamente variables en los cambios cuantitativos en los niveles de proteínas y los métodos utilizados para inducir cambios en la expresión génica (es decir, expresión mediada por virus, basada en reproducción, constitutiva o transitoria). eso puede conducir a datos e inferencias contradictorias.92

Esta falta de consistencia en la obtención de fenotipos asociados a enfermedades presenta una advertencia para los estudios preclínicos que utilizan estos modelos para probar posibles DMT. Además, la variabilidad en los fenotipos celulares y la metodología observada en los modelos preclínicos de NDD (p. ej., cambio en la sobreexpresión o caída de proteínas) sugiere fuertemente una mayor heterogeneidad genética que no se puede explorar por completo en los modelos celulares actuales.

Esto se complica aún más por la prevalencia de modelos celulares basados ​​en variantes genéticas identificadas en cohortes familiares, a pesar de que las variantes familiares representan una pequeña minoría de los casos generales de NDD.109,143

Debido a las causas genéticas descubiertas, sigue siendo difícil representar con precisión cohortes de NDD esporádicas o subtipos de enfermedades con genética no mendeliana en modelos preclínicos, lo que crea una barrera importante para dilucidar los mecanismos pertinentes de la enfermedad, identificar posibles objetivos terapéuticos y desarrollar fármacos.

Ante estos desafíos, los investigadores se han visto obligados a evaluar estos modelos para identificar áreas de mejora y evaluar las oportunidades que presentan las nuevas técnicas de cultivo celular.

En los últimos años, nos hemos basado en estos modelos, incorporando nueva tecnología de edición de genes y evaluando importantes asociaciones de enfermedades genéticas obtenidas en GWAS en modelos mejorados de cultivo de tejidos.144,145

La mayor incorporación de la tecnología hiPSC representa una progresión importante en el campo del modelado in vitro de NDD y proporciona oportunidades que antes no estaban disponibles para utilizar tipos de células relevantes para la enfermedad derivadas de pacientes para explorar la patogénesis de la enfermedad en el contexto del genoma humano.

En la siguiente sección se explora en su totalidad el espectro completo de ventajas y limitaciones de los modelos NDD derivados de hiPSC, particularmente aquellos relacionados con AD y PD.

Modelos de NDD derivados de hiPSC: versátiles y genéticamente "fieles"

Los avances modernos en la tecnología de cultivos celulares representan uno de los avances más interesantes en la investigación de las NDD, ya que brindan oportunidades para mejorar el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y la medicina personalizada.

Hasta hace poco, el examen cerebral post mortem se consideraba el material biológico humano de referencia para obtener información sobre los procesos patológicos de las condiciones neurodegenerativas humanas.

Sin embargo, las tecnologías modernas de células madre, incluido el análisis de neuronas y células gliales específicas del paciente, han abierto nuevas vías para investigar los mecanismos patológicos de las NDD y se han aprovechado cada vez más en la disección molecular de NDD con mayor complejidad genética, como la EA y PD.

A través de una biopsia simple y no invasiva de muestras de piel de pacientes, además de una variedad de muestras biológicas alternativas, la generación de hiPSC permite a los investigadores revelar vías moleculares y mecanismos de enfermedades que subyacen a las NDD de una manera que era imposible con los métodos de cultivo celular anteriores.

En la actualidad, las células donantes más frecuentes son los fibroblastos, que se utilizan en más del 80% de todos los experimentos de reprogramación publicados;146 sin embargo, las hiPSC se pueden obtener de una variedad de fuentes, incluidas células madre de cordón embrionario, sangre de cordón umbilical, células epiteliales de la córnea, y células sanguíneas, como las células mononucleares de sangre periférica147-149(Figura 1).

En consecuencia, los modelos derivados de hiPSC representan una alternativa versátil a los modelos de enfermedades celulares existentes y se obtienen a partir de tejidos somáticos de pacientes que son obligados a adquirir pluripotencia mediante el uso de una variedad de herramientas de reprogramación, como plásmidos, vectores (p. ej., episomales) y transducción viral (p. ej. , adenovirus, virus Sendai, lentivirus, estos métodos se revisan exhaustivamente en Brouweret al.150 y Malik y Rao151).

Estas células se renuevan automáticamente y ofrecen una alternativa a las células madre embrionarias (ESC), que van acompañadas de consideraciones éticas y preocupaciones sociales. Actualmente existen varios repositorios de hiPSC que recopilan y distribuyen líneas de hiPSC derivadas de pacientes con NDD y controles de salud de la misma edad para centralizar muestras y ponerlas a disposición de los investigadores (Tabla S2).

Una de las principales aplicaciones de las hiPSC es la diferenciación en tipos de células específicas, que en consecuencia se han utilizado en una variedad de contextos biológicos, incluidos estudios de neurodesarrollo152 y neurodegeneración,144 trasplantes ex vivo,153,154 modelado de enfermedades, validación de objetivos y descubrimiento de fármacos.155

Hasta la fecha, se han desarrollado varios protocolos de diferenciación celular que generan no sólo neuronas genéricas sino también poblaciones de tipos de células neuronales específicas, incluidas neuronas excitadoras, colinérgicas, DA y GABAérgicas inhibidoras.156-158 También se han derivado una variedad de subpoblaciones de células gliales específicas a partir de hiPSC. incluidos astrocitos,159–161oligodendrocitos,162,163 y microglía.164–166

Varias técnicas novedosas de edición de genes, incluidas CRISPR-Cas9, nucleasas con dedos de zinc (ZFN) y nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALENS), introdujeron una dimensión adicional al sistema derivado de hiPSC: la creación de modelos isogénicos que poseen el mismo trasfondo genético. y sólo difieren en la mutación elegida.167

La diversidad de protocolos de diferenciación celular ha facilitado los estudios mecanicistas y la disponibilidad de líneas isogénicas ha respaldado los análisis genéticos de la función de los genes y su papel patogénico en las NDD. Los modelos derivados de hiPSC son adecuados para estas investigaciones, ya que exhiben características clave relacionadas con la enfermedad.

Por ejemplo, los modelos neuronales hiPSC derivados de fAD y sAD que portan mutaciones PS1 y PS2 (A246E y N14II, respectivamente) 168 y mutación de duplicación de APP 169 muestran características bioquímicas importantes de la EA, incluida la secreción de Ab, un aumento de la proporción Ab42:Ab40 y una tau hiperfosforilada elevada.

Es importante señalar que el uso de modelos hiPSC que generan fenotipos relacionados con Ab representa un medio más preciso para explorar el papel de la expresión de Ab en la neurodegeneración de la EA en comparación con los modelos de expresión ectópica tradicionales o los modelos que requieren suplemento y/o inducción de agregados de Ab, como estos adoptan los procesos patológicos "naturales" relacionados con los depósitos de Ab.

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