El potencial de las vacunas basadas en células dendríticas para modular las poblaciones de células linfoides innatas tipo 3

Abstracto:

Las vacunas de células dendríticas (DC) son un tipo de inmunoterapia que se basa en la comunicación de las DC con otros aspectos del sistema inmunológico. Las CD son potentes células presentadoras de antígenos involucradas en la activación de respuestas inmunes innatas y la educación de inmunidad adaptativa, lo que las convierte en objetivos ideales para inmunoterapias. Las células linfoides innatas (ILC) se han identificado relativamente recientemente en el campo de la inmunología y desempeñan funciones importantes en la salud y la enfermedad. Los estudios descritos aquí exploraron las comunicaciones entre las ILC tipo 3 (ILC3) y las DC utilizando un modelo murino de vacunación basada en DC. Se observaron cambios locales y sistémicos en las poblaciones de ILC3 después de la administración de una vacuna DC y, tras la exposición a células de melanoma B16F10, se observaron cambios en las poblaciones de ILC3 en los pulmones. Las interacciones entre DC e ILC3 deben explorarse más a fondo para determinar el potencial que sus comunicaciones podrían tener en la salud, la enfermedad y el desarrollo de inmunoterapias.

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Palabras clave:

célula dendrítica (DC); célula linfoide innata tipo 3 (ILC3); innato; comunicación

1. Introducción

Las células linfoides innatas (ILC) son un grupo heterogéneo de leucocitos derivados de células progenitoras linfoides comunes que tienen funciones cruciales en el desarrollo, la reparación y la homeostasis de los tejidos. Las CLI se han relacionado con diferentes enfermedades inflamatorias, incluida la enfermedad inflamatoria intestinal, la psoriasis, el asma y diversas enfermedades autoinmunes [1]. Por lo general, se separan en tres grupos principales, tipo 1 (ILC1), tipo 2 (ILC2) y tipo 3 (ILC3), según la expresión de factores de transcripción, perfiles de citoquinas y marcadores fenotípicos específicos [2]. Las células asesinas naturales (NK) a veces se agrupan como un subconjunto de ILC1 debido a sus similitudes; sin embargo, se ha demostrado que las células NK tienen características distintas de las ILC1, como la expresión de factores de transcripción y la actividad citolítica, que las han distinguido como su propio subtipo de ILC [3]. Sin embargo, muchos todavía consideran a las células NK como un subconjunto de ILC1 [4]. Debido a sus perfiles de citoquinas, factores de transcripción y funciones inmunológicas similares, las ILC (células NK, ILC1, ILC2 e ILC3) se consideran contrapartes innatas de los componentes del sistema inmunológico adaptativo que reflejan los linfocitos T citotóxicos, Th1, Th2 y Th17. respuestas, respectivamente [4]. Sin embargo, a diferencia de las células T, carecen de receptores específicos de antígeno [5].

Las CD son leucocitos innatos que son fundamentales en la inducción de respuestas inmunes y tolerancia. Tienen receptores de reconocimiento de patrones que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos y/o daños y son las células presentadoras de antígenos más eficientes [6]. A través de la presentación de antígenos y la secreción de citoquinas, las CD pueden dictar el destino de las células T vírgenes e inducir respuestas proinflamatorias o inmunosupresión. Se puede educar a las células T para que reconozcan un antígeno como peligroso y lo ataquen o como no peligroso y adopten un fenotipo tolerogénico [6]. Las CD también participan en la activación de la inmunidad innata, así como en la educación de la inmunidad adaptativa. A través del contacto directo o la producción de diferentes citoquinas y factores solubles, las CD pueden activar otros leucocitos innatos y promover respuestas inmunes innatas [7].

El poder de las DC se ha utilizado en inmunoterapias como las vacunas DC. Las vacunas DC se preparan aislando DC de un paciente o aislando precursores de DC y derivando DC. Estas DC se manipulan ex vivo, lo que implica la maduración de las DC de forma inmunogénica. Las CD también están cargadas con antígenos específicos, que será hacia lo que apuntará la vacuna para desarrollar respuestas inmunogénicas dirigidas [8]. Las vacunas DC son una plataforma inmunoterapéutica que aprovecha la capacidad de las DC para educar al sistema inmunológico adaptativo para inducir respuestas antígeno específicas, en particular células T citotóxicas específicas de antígeno. Por lo tanto, la mayoría de las investigaciones sobre vacunas de CD se han centrado en la capacidad de las CD para educar al sistema inmunológico adaptativo. Sin embargo, en los últimos años, se ha demostrado que la relación entre las CD y las células NK tiene una poderosa influencia en la inmunidad antitumoral, lo cual es crucial para la eficacia de la vacunación con CD [9-11]. Esto demuestra la importante necesidad de explorar otras relaciones entre las DC y diferentes leucocitos innatos y la influencia que estas comunicaciones pueden tener en la eficacia de las vacunas DC. Dado que las células NK son parte de la familia ILC y debido al gran parecido de las ILC con las células T [5], el objetivo de los estudios presentados aquí fue investigar la posible relación entre las CD y otro miembro de la familia ILC, las ILC3. Utilizamos una plataforma de vacuna DC derivada de monocitos (moDC) donde las DC se generaron ex vivo a partir de células precursoras de médula ósea murina. Las vacunas MoDC son la forma más común de vacunas DC ya que, históricamente, fueron las más fáciles de producir [12].

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Las ILC3 tienen funciones importantes en la homeostasis intestinal, la inmunidad contra bacterias extracelulares y el desarrollo de tejidos linfoides [5]. Las ILC3 se pueden subdividir en grupos que varían en su expresión de marcadores de superficie y producción de citoquinas. Sin embargo, todas las ILC3 expresan ROR t [13]. Un subgrupo de ILC3 son las células inductoras de tejido linfoide ILC3-, que son importantes en la organogénesis [14]. Las ILC3 también se pueden subdividir según la expresión del receptor de citotoxicidad natural (NCR), que en ratones es la expresión de NKp46 [15,16], y en humanos, es NKp44 [17,18]. Por tanto, existen NCR+ y NCR-ILC3 que tienen diferencias en sus capacidades funcionales y características fenotípicas. Por ejemplo, se ha sugerido que las ILC3 NCR+ producen IL-22 pero no IL-17, mientras que las ILC3 NCR- pueden producir ambas citocinas [19]. Sin embargo, en un estudio reciente realizado por Fiancette et al., se demostró que las ILC3 NCR+ pueden producir una cantidad baja de IL-17 [20]. Rankin et al. demostró en ratones que las ILC3 NCR + requieren el factor de transcripción T-bet. Por lo tanto, las NCR +/− ILC3 se pueden diferenciar en función de la expresión de NKp46 y T-bet. En los estudios descritos aquí, las ILC3 murinas se definieron por linaje-CD45+DX5-ROR t +, siendo las ILC3 NCR+ también T-bet+NKp46+ y las NCR-ILC3 T-bet-NKp46. − (Tabla 1 y Figuras A1 a A3 del Apéndice A).

Tabla 1. Subconjuntos de ILC3 definidos mediante análisis de citometría de flujo.

El objetivo de esta investigación fue ayudar a dilucidar si existen comunicaciones entre las vacunas DC y las ILC3 y el potencial que podrían tener sus interacciones en las inmunoterapias DC. Se ha demostrado que las ILC3 desempeñan funciones en diversas enfermedades y cánceres y, por lo tanto, tienen potencial en diferentes contextos de inmunoterapia. Las ILC3 son relativamente nuevas en el ámbito de la inmunología y, como resultado, sus influencias en las enfermedades y los tratamientos se han explorado de forma limitada. Las ILC3 responden a estímulos externos, que dictarán sus actividades y si promueven la progresión o la supresión de los tumores [21,22]. Al igual que las células Th17, las ILC3 tienen el factor de transcripción ROR t y producen citocinas de respuesta Th17 como IL-17 e IL-22. IL-22 es importante para controlar las infecciones bacterianas en el intestino [16]. Sin embargo, en un modelo de cáncer de colon inducido por bacterias, se demostró que la IL-17 y la IL-22 de las ILC en el colon contribuyeron al desarrollo del cáncer de colon [23]. Además, las ILC3 se han correlacionado con resultados negativos en el cáncer de mama [24]. Por el contrario, se ha observado una asociación entre las ILC3 NCR+ y las estructuras linfoides terciarias (TLS) y mejores resultados clínicos en los cánceres de pulmón de células no pequeñas [18]. Además, un estudio reciente investigó las ILC3 en el cáncer colorrectal. El estudio observó un aumento en las ILC1 y una disminución en las ILC3 en muestras de pacientes de tumores colorrectales resecados en comparación con tejidos adyacentes no malignos compatibles. La secuenciación de ARN y el perfil transcripcional revelaron que las ILC3 tienen una mayor plasticidad y diferentes capacidades funcionales dentro de los tumores colorrectales en comparación con los tejidos no malignos. Curiosamente, la secuenciación de ARN también sugirió que las ILC3 que se infiltraban en el tumor tenían una plasticidad regulada positivamente para cambiar a un fenotipo ILC1. El estudio observó que las interacciones de ILC3 con las células T respaldaban la inmunidad de tipo I y, en los cánceres colorrectales, estas interacciones son limitadas, lo que dificulta las respuestas antitumorales. Esto respalda una función importante de las ILC3 en la inmunidad antitumoral. En general, el artículo demostró las funciones importantes que tienen las ILC3 en la regulación de la homeostasis inmunológica y el cáncer colorrectal [25]. Por lo tanto, se considera que las ILC3 tienen una doble función en la salud y la enfermedad. Pueden promover la progresión del cáncer [23,24,26] pero también pueden contribuir a las respuestas antitumorales [18,25,27,28]. Su fenotipo y sus contribuciones al cáncer parecen ser contextuales, lo que indica un potencial para manipular las ILC3 mediante inmunoterapia para obtener un fenotipo que ayude con las respuestas contra el cáncer en lugar de apoyar la progresión del tumor. Por lo tanto, las vacunas basadas en DC representan un posible método para influir en el microambiente tumoral mediante la manipulación de los fenotipos de ILC y su producción de citoquinas, lo que permitiría adaptar la respuesta inmune según las circunstancias y podría ser beneficioso en la investigación del cáncer.

Dado que ha habido una investigación limitada sobre las comunicaciones entre las DC y las ILC3, especialmente en el contexto de la vacunación con DC, los estudios descritos aquí investigaron los cambios en las poblaciones de ILC3 después de la administración de una vacuna basada en DC a ratones. En este artículo, se observó la comunicación entre una vacuna basada en DC y las ILC3, lo que se demostró a través de la influencia sostenida de la vacuna en las respuestas de las ILC3 durante al menos 10 días después de la inmunización.

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2. Resultados

2.1. El número de ILC3 NCR+ y NCR− aumentó en el ganglio linfático de drenaje local después de la administración de vacunas DC 

Se preparó una vacuna de DC diferenciando las DC de células derivadas de médula ósea murina ex vivo. Estas CD fueron estimuladas para promover su maduración para que adquirieran un fenotipo inmunogénico. Luego, las CD se cargaron con un péptido. Dado que este estudio se centra en la naturaleza de la comunicación entre dos leucocitos innatos, DC e ILC3, el péptido seleccionado para la producción de la vacuna fue intencionalmente irrelevante para nuestro modelo biológico para evitar que las células T específicas de antígeno se conviertan en una variable de confusión. Por lo tanto, la vacuna DC se cargó con un péptido derivado de ovoalbúmina de pollo.

Para comenzar a investigar si la vacunación con DC influye en las poblaciones de ILC3, primero evaluamos si había diferencias en la celularidad proximal al sitio de vacunación. Hubo cambios en el ganglio linfático de drenaje local después de la vacunación con DC, que incluyeron un aumento en el número de ILC3 (Figura 1). La cinética del aumento de ILC3 mostró que las ILC3 aumentaron gradualmente después de la vacunación con DC (Figura 1b, c). Se evaluó el número de ILC3 NCR+ y NCR− en el ganglio linfático de drenaje local y ambas subpoblaciones aumentaron después de la administración de la vacuna DC. Aunque las poblaciones de ILC3 NCR+ y NCR- alcanzaron su punto máximo tres días después de la vacunación con DC, las ILC3 NCR- regresaron a números homeostáticos siete días después de la inmunización, mientras que el número de ILC3 NCR+ se mantuvo significativamente mayor en comparación con los ratones de control tratados de forma simulada.

Figura 1. El número de células linfoides innatas (ILC3) de receptores de citotoxicidad natural (NCR)+ y NCR- tipo 3 aumentó en el ganglio linfático de drenaje local después de la inmunización con DC. Se inocularon ratones hembra C57BL/6 con vacunas DC mediante inyecciones en la almohadilla de las patas traseras. Se examinaron los ganglios linfáticos poplíteos en busca de poblaciones de ILC3. (a) Se determinó el número total de células en el ganglio linfático. Acumulación de (b) NCR- ILC3 y (c) NCR+ ILC3 en el ganglio linfático y porcentaje de células CD{{10}} en el ganglio linfático que eran (d) NCR- ILC3 y (e) NCR+ ILC3. Cada barra representa datos de cuatro ganglios linfáticos poplíteos. Se utilizó una prueba t de Student en cada momento para determinar diferencias significativas entre los ratones de control inoculados con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y los ratones inoculados con la vacuna DC (valores de p * < 0.{{ 21}}5, ** < 0.005, *** < 0,0005 y **** < 0,0001). Gráficos de puntos representativos que muestran el número promedio de (f) NCR- ILC3 y (g) NCR+ ILC3 en el ganglio linfático poplíteo de drenaje. Los gráficos muestran la media con la desviación estándar.

2.2. Las vacunas DC aumentaron la producción de citoquinas ILC3 en el bazo sin cambiar el número total de ILC3 esplénicas

A continuación, se examinaron los cambios sistémicos en las poblaciones de ILC3 mediante la evaluación del bazo, que es el órgano linfoide secundario más grande [29], una semana después de la vacunación con DC, que es el momento estándar de nuestro laboratorio para evaluar los cambios sistémicos en los leucocitos. No se observó una diferencia significativa en el número total de ILC3 NCR+ o NCR- en el bazo (Figura 2).

Figura 2. No hubo cambios en el número de ILC3 esplénicas después de la inmunización con DC. Se inocularon ratones hembra C57BL/6 (n=8 [PBS] o 10 [DC]) con vacunas DC mediante inyecciones en las patas traseras. Se recogieron los bazos una semana después de la inoculación y se examinaron en busca de poblaciones de ILC3. Número total esplénico de (a) NCR- ILC3 y (b) NCR+ ILC3 (y la intensidad fluorescente media geométrica de T-bet para NCR+ ILC3) y el porcentaje de células CD45+ esplénicas que fueron (c) NCR- Las ILC3 y (d) NCR+ ILC3 se controlaron y cuantificaron mediante análisis de citometría de flujo. Se utilizó una prueba t de Student para determinar la importancia entre las poblaciones de los ratones de control inoculados con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y los ratones inoculados con DC. Las medias no fueron significativamente diferentes. Gráficos de puntos representativos que muestran el número promedio de ILC3 esplénicas (e) NCR- y NCR+ ILC3. La desviación estándar y la media están representadas por las barras del gráfico y las barras de error.

Dado que los perfiles de citoquinas ILC3 pueden verse influenciados por factores ambientales, la producción de IL-22 e IL-17 en ILC3 en el bazo se midió una semana después de la vacunación con DC. Hubo un aumento en las ILC3 que producen IL-17 o IL-22 o ambas citocinas en ratones tratados con vacunas DC en comparación con los ratones de control (Figura 3).

Figura 3. Hubo un aumento en las ILC3 esplénicas que producen IL-17 e IL-22 después de la inmunización con DC. Se inocularon ratones hembra C57BL/6 (n=12–18) con vacunas DC mediante inyección en la pata trasera. Los ratones de control fueron tratados con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Una semana después de la inmunización, se recogieron los bazos y se examinaron en busca de IL-17- e IL{{10}}productoras de IL{{10}}. El número de células del linaje CD127+DX5- que producen (a) IL-17, (b) IL-22 y (c) tanto IL-17 como IL{{. 16}} y sus intensidades fluorescentes medias geométricas correspondientes se determinaron mediante tinción con citoquinas intracelulares y citometría de flujo. Los datos se analizaron mediante una prueba ANOVA de dos factores (valores de p * < 0.05, ** < 0,005). (d) Los diagramas de puntos representativos muestran el número promedio de células del linaje CD45+-CD127+DX5- del bazo que producen IL-17 y/o IL-22. Los gráficos muestran la media con la desviación estándar.

2.3. Subpoblaciones ILC3 después de la inmunización con DC y la exposición a células de melanoma B16F10

Las ILC3 pueden desempeñar una doble función en la progresión del cáncer al contribuir a respuestas tanto pro como antitumorales [22]. Por lo tanto, se investigó la influencia de la vacunación con DC en las respuestas de ILC3 en el contexto del cáncer. Los ratones fueron tratados con vacunas DC y una semana después, fueron expuestos por vía intravenosa a células de melanoma B16F10, lo que resultó en la siembra de los pulmones. Como se mencionó anteriormente, dado que solo se evaluaron los componentes de la inmunidad innata, en nuestros experimentos no se debía evaluar la formación de antígeno específico mediante la vacuna y, por lo tanto, el modelo de melanoma utilizado no expresaba ovoalbúmina, lo que hacía que el péptido cargado en las CD irrelevante. El experimento de cinética (Figura 1) demostró que las respuestas locales de ILC3 se podían observar en tres días. Por lo tanto, tres días después del desafío, se examinó en el bazo y los pulmones el número de subpoblaciones de ILC3 y su capacidad para producir citocinas. De manera similar a lo que se observó en los bazos de ratones sin tratamiento previo, no hubo diferencias significativas en el número total de ILC3 esplénicas NCR+ y NCR- entre el grupo de control y el grupo inmunizado con DC (Figura 4). Sin embargo, a diferencia del modelo ingenuo, en el bazo ya no hubo cambios en la producción de IL-17 y/o IL-22 (Figura 5).

Figura 4. No hubo cambios en el número total de ILC3 esplénicas después de la vacunación con DC y la exposición a células de melanoma B16F10. Se inocularon ratones hembra C57BL/6 (n=10) con vacunas DC mediante inyección en la almohadilla de las patas traseras y, una semana después, a los ratones se les administraron 3 × 105 células B16F10 mediante inyección en la vena de la cola. Se recogieron los bazos y se examinaron para determinar la acumulación de poblaciones de ILC3 tres días después de la administración de B16F10. El número de (a) NCR- ILC3 esplénicas y (b) NCR+ ILC3 (y la intensidad fluorescente media geométrica de T-bet para NCR+ ILC3) y el porcentaje de células CD45+ esplénicas que fueron (c) NCR- Las ILC3 y (d) NCR+ ILC3 se controlaron y cuantificaron mediante citometría de flujo. Se utilizó una prueba t de Student para determinar la importancia entre las poblaciones de los ratones de control tratados con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y los ratones inoculados con DC. Las medias no fueron significativamente diferentes. Los gráficos de puntos representativos muestran el número promedio de ILC3 esplénicas (e) NCR- y NCR+ ILC3. La media y la desviación estándar se representan con gráficos de barras y barras de error.

Figura 5. No hubo cambios en el número de ILC esplénicas productoras de IL-17 y/o IL-22- después de la vacunación con DC y la exposición a células de melanoma B16F10. Se inocularon ratones hembra C57BL/6 (n=10) con vacunas DC mediante inyección en la almohadilla de las patas traseras y, una semana después, se administraron por vía intravenosa 3 x 105 células B16F10. Tres días después, se recogieron los bazos y se examinaron para determinar la producción de citoquinas ILC3. El número de células CD127+DX5- del linaje que producen (a) IL-17, (b) IL-22 y (c) tanto IL-17 como IL-22 y sus correspondientes intensidades fluorescentes medias geométricas se determinaron mediante tinción con citoquinas intracelulares y citometría de flujo. Los datos se analizaron mediante una prueba ANOVA de dos vías y no se detectaron diferencias significativas entre los ratones vacunados con DC y los controles tratados con solución salina tamponada con fosfato (PBS). (d) Los diagramas de puntos representativos muestran el número promedio de células CD45+linaje CD127+DX5- del bazo que producen IL-17 y/o IL-22.

La inyección intravenosa de células B16F10 a través de la vena de la cola es un modelo común en ratones de metástasis de melanoma sintético en los pulmones [30]. Por lo tanto, también se examinaron los pulmones para determinar el número de subpoblaciones de ILC3 y evaluar su producción de citoquinas.

Hubo una disminución en el número de NCR- ILC3 con un aumento concomitante en el número de NCR+ ILC3 (Figura 6). Sin embargo, no se observó ningún efecto de la vacunación con DC sobre la producción de citoquinas mediada por ILC3-en los pulmones (Figura 7).

Figura 6. Después de la inmunización con DC y la exposición a células B16F10, hubo cambios numéricos en las subpoblaciones de ILC3 en los pulmones. Los ratones hembra C57BL/6 (n=10) recibieron vacunas DC mediante inyección en la pata trasera y una semana después, se administraron por vía intravenosa 3 × 105 células B16F10. Tres días después de la exposición, los pulmones se examinaron mediante citometría de flujo para determinar el número de (a) ILC3 NCR- y (b) ILC3 NCR+ (y la intensidad fluorescente media geométrica de T-bet para ILC3 NCR+) y el porcentaje de CD{. {18}} células que eran (c) NCR- ILC3 y (d) NCR+ ILC3. Se utilizó una prueba t de Student para determinar la importancia entre las subpoblaciones de los ratones de control tratados con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y los ratones inoculados con DC (valores de p *<0.05, *** <0.0005, and **** < 0.0001). Representative dot plots showing the average number of pulmonary (e) NCR− ILC3s and NCR+ ILC3s. The graphs display the mean with the standard deviation.

Figura 7.No hubo cambios en la cantidad de ILC3 que producen IL-17 y/o IL-22 en los pulmones después de la vacunación con DC y la exposición a células de melanoma B16F10. Se inocularon ratones hembra C57BL/6 (n=10) con vacunas DC mediante inyección en la almohadilla de las patas traseras y, una semana después, se les administró por vía intravenosa 3 × 105 células B16F10. Tres días después, se extrajeron los pulmones y se examinaron para determinar la producción de citocinas mediada por ILC3-. El número de células del linaje CD127+DX5- que producen (a) IL-17, (b) IL-22, y (c) tanto IL{{0}} como IL-22 y sus intensidades fluorescentes medias geométricas correspondientes se determinaron mediante tinción con citoquinas intracelulares y citometría de flujo. Los datos se analizaron mediante una prueba ANOVA de dos factores (valores de p *** <0,0005). No hubo diferencias significativas en el número total de CD de linaje productores de IL-22-, IL-17-productores y IL-22 e IL-17 productores de múltiples citoquinas{{ 12}}DX5-células. (d) Gráficos de puntos representativos que muestran el número promedio de células pulmonares de linaje CD45+-CD127+DX5- que producen IL-17 y/o IL-22. La desviación estándar y la media están representadas por las barras del gráfico y las barras de error.

3. Discusión

Los estudios descritos aquí intentaron investigar posibles comunicaciones entre ILC3 y DC en el contexto de una vacuna DC. Hubo aumentos en el número de subpoblaciones NCR+ y NCR− ILC3 en los ganglios linfáticos de drenaje (Figura 1) después de la vacunación con DC, lo que sugiere que se produjeron comunicaciones locales entre la vacuna DC y las subpoblaciones ILC3. Sin embargo, la comunicación entre las DC y las ILC3 NCR+ tuvo una influencia más duradera en el número total de ILC3 NCR+ que la observada entre las DC y las ILC3 NCR-. Esto indicó que las CD pueden tener interacciones únicas con las ILC3 dependiendo de su expresión de NCR. No se observaron cambios en el número de subpoblaciones de ILC3 en el bazo siete días después de la vacunación con DC (Figura 2) o diez días después de la vacunación con DC y tres días después de la exposición a células de melanoma B16F10 (Figura 4). Nuestros métodos para analizar las ILC3 para determinar su producción de IL-17 e IL-22 tienen una limitación porque muestran respuestas tanto traduccionales como transcripcionales debido a la reestimulación in vitro de las células. Sin embargo, agregamos un control experimental en todos los experimentos, que sería el tratamiento sin estimulación in vitro para detectar qué producen las ILC3 en respuesta a la señal recibida in vivo. Como se ilustra en las Figuras 3d, 5d y 7d, las células que no recibieron estimulación in vitro produjeron IL-17 e IL-22. Además, aunque el número de células ILC3 esplénicas no cambió (Figura 2), la producción de citoquinas por parte de las subpoblaciones ILC3 fue diferente siete días después de la vacunación con DC (Figura 3). Esto sugirió que la vacunación con DC podría influir en la funcionalidad de las respuestas de ILC3 sin afectarlas numéricamente. Al ser componentes del sistema inmunológico innato, el tráfico de ILC3 dentro y fuera de los tejidos podría haber ocurrido en el lapso de unos pocos días, impidiendo así la detección de diferencias numéricas moduladas por el tratamiento entre siete y diez días después de la vacunación con DC. Se observó evidencia de esto en el ganglio linfático de drenaje de la vacuna DC, donde el número de ILC3 aumentó en el transcurso de tres días y luego comenzó a disminuir (Figura 1). Por lo tanto, es posible que haya habido cambios numéricos en las subpoblaciones de ILC3 en el bazo que se pasaron por alto porque habían regresado a números homeostáticos en el séptimo día posterior a la inmunización con DC. No obstante, los estudios se centraron en respuestas más duraderas en lugar de respuestas transitorias a corto plazo y, por lo tanto, no investigaron más esta vía. Curiosamente, aunque el número de subpoblaciones de ILC3 esplénicas no fue diferente del de los grupos de control, sus perfiles de citocinas estaban alterados (Figura 3). La producción de IL-22 e IL-17 aumentó en las ILC3 esplénicas, lo que demuestra que la vacunación con DC tuvo un efecto sistémico en las ILC3. En resumen, la vacunación con DC no afectó la cantidad de ILC3 esplénicas, pero sí influyó en su funcionalidad.

Aunque hubo un efecto sostenido sobre la producción de citoquinas derivadas de ILC3-siete días después de la inmunización con DC en el bazo de ratones libres de tumores, esta influencia sobre las ILC3 en el bazo fue indetectable tres días después de la exposición intravenosa con células de melanoma B16F10 ( Figura 5). La vacuna DC pareció preparar poblaciones de ILC3 en el modelo libre de tumores que se suprimió tras la exposición al tumor. Dado que las ILC están muy influenciadas por su entorno, esto podría sugerir que las comunicaciones entre las CD de la vacuna y las ILC3 se limitaron al modelo libre de tumores. Por el contrario, esto también podría deberse a la movilización de ILC3 preparadas a otras ubicaciones del cuerpo donde los B16F10 pueden haberse congregado y establecido un microambiente que indujo el reclutamiento de leucocitos.

Se observó un cambio en las subpoblaciones de ILC3 en los pulmones diez días después de la vacunación con DC y tres días después de la exposición a células B16F10 en comparación con los ratones de control no vacunados con DC que solo recibieron la administración de células B16F10. Específicamente, hubo un aumento en el número de NCR+ ILC3 y una disminución de NCR- ILC3 en los pulmones (Figura 6). T-bet es un factor de transcripción asociado con las respuestas Th1 [31]. Por lo tanto, el aumento de NCR+ ILC3, que expresan T-bet, indicó una posible promoción de la inmunidad tipo 1. Esta podría ser una respuesta ILC3 beneficiosa en un contexto de cáncer donde generalmente se desean respuestas inmunes de tipo 1.

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Se ha demostrado que las ILC3 NCR+ pueden derivar de un subconjunto de ILC3 NCR- [16]. Por lo tanto, el aumento de NCR+ ILC3 y la disminución de NCR- ILC3 podrían atribuirse a una estimulación que indujo un cambio en NCR- ILC3 para convertirse en NCR+ ILC3. Si las ILC3 estuvieran experimentando un cambio de fenotipo de NCR− a NCR+, es posible que no hubieran podido producir citoquinas durante o poco después del cambio y mientras se adaptaban al entorno y a su nuevo fenotipo. Por lo tanto, es posible que su producción de citoquinas se haya detenido o retrasado mientras se producía el cambio de fenotipo, lo que podría explicar por qué no hubo cambios en la producción de IL-17 mediada por ILC3-y/o IL-22 en los pulmones (Figura 7). Sin embargo, también es posible que la vacunación con DC simplemente no haya influido en la producción de citoquinas por parte de las ILC3 en los pulmones en este momento.

4. Materiales y métodos

Aprobación de ética

Todos los estudios murinos se realizaron siguiendo el protocolo de utilización de animales nº 3807 bajo la supervisión del personal de cuidado de animales de la Universidad de Guelph.

Ratones

Se recibieron ratones hembra C57BL6 de Charles River Laboratories de cinco a ocho semanas de edad. Los ratones fueron alojados en un ambiente controlado en la unidad de aislamiento de animales de la Universidad de Guelph y se les dio una semana para que se aclimataran antes del comienzo de los experimentos. Los ratones fueron alimentados y se les dio agua ad libitum.

Cultivos de células dendríticas

Se recolectaron los fémures y las tibias de ratones hembra C57BL6 y se cortaron los extremos de los huesos. Con una jeringa, se lavó la médula ósea de las tibias y los fémures con PBS en una placa de Petri. La médula ósea se resuspendió en una suspensión unicelular y se contó utilizando un hemocitómetro. Luego, las células se resuspendieron en medio (RPMI [HyClone Cat# SH30027.01] con 2-mercaptoetanol [Gibco Ref# 21985-023], penicilina/estreptomicina al 1% [HyClone Cat# SV30010] y 10% suero bovino fetal [VWR Cat#97068-085]) a una concentración de 1,25 × 106 células por ml, suplementado con 20 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) (Biolegend Cat#576308) y repartir en alícuotas en matraces de cultivo de 25 cm2, 5 ml por matraz. Los cultivos se colocaron en incubadoras humidificadas a 37 ◦C con 5% de CO2 y se dejaron crecer durante 7 días. El segundo día del cultivo, se agregaron 5 ml de medio nuevo con 20 ng/ml de GM-CSF. El quinto día, se centrifugaron 5 ml de cada cultivo y se eliminó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 5 ml de medio nuevo con 20 ng/ml de GM-CSF y se volvieron a añadir a los matraces de cultivo. Los cultivos se recogieron el día 7 y se prepararon para la vacunación.

Preparación de vacunación con células dendríticas

Los cultivos de células dendríticas (DC) se transfirieron a un tubo cónico de 50 ml y se contaron utilizando un hemocitómetro. Las células se estimularon con 100 ng/ml de lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli O55:B5 (Sigma Cat#L2880) y 1 µg/ml de ovoalbúmina de pollo (OVA) 257–264 (SIIN) (PepScan Systems, Lelystad, Países Bajos). durante 1 h en incubadora a 37 ◦C con 5% de CO2. Luego, las células se lavaron con PBS tres veces y se resuspendieron a una concentración de 5 x 105 células por 30 µl. Las vacunas se administraron en dosis de 5 x 105 células por 30 µl de PBS.

Procesamiento de tejidos

Los ganglios linfáticos y el bazo se recogieron y se colocaron en placas de Petri con 2 ml de solución salina tamponada de Hanks (HBSS). Se presionaron para formar suspensiones unicelulares utilizando la parte posterior de un tapón de jeringa de 3 ml. Las suspensiones unicelulares se filtraron en un tubo cónico de 50 ml utilizando un colador celular con un tamaño de poro de 70 µm. Los ganglios linfáticos se contaron mediante un hemocitómetro. Los bazos se centrifugaron, se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en tampón de lisis ACK (8,29 g de NH4Cl [0.15 M], 1 g de KHCO3 [10,0 mM], 37,2 mg de Na2EDTA [0,1 mM] en 1 ml de agua Milli Q) y se dejó reposar durante cinco minutos para lisar los eritrocitos. Las células se lavaron con HBSS dos veces antes de resuspenderse en medio y contarse usando un hemocitómetro.

Los pulmones se recogieron y se pesaron antes de colocarlos en un tubo gentleMACSTM que contenía 1 mg/ml de colagenasa IV (Gibco Ref#17104-019) y 5 µg/mL de DNasa I (Roche Ref#11284932001) en HBSS. Usando el disociador gentleMACSTM, las muestras se procesaron a través del protocolo de pulmón A y luego se incubaron durante 20 minutos en una incubadora a 37 ◦C con 5% de CO2. Luego, las muestras se procesaron a través del protocolo pulmonar B en el disociador gentleMACSTM. Se añadió el doble del volumen de muestra de HBSS a las muestras para neutralizar la reacción enzimática. Las muestras se filtraron en un tubo cónico de 50 ml a través de un colador celular con un tamaño de poro de 70 µm. Luego, las células se lavaron dos veces con HBSS y se resuspendieron en tampón de lisis ACK. Después de cinco minutos en tampón de lisis ACK, las células se lavaron dos veces con HBSS y se resuspendieron en medio.

Ensayo de respuesta de citocinas

Las suspensiones unicelulares de las muestras de tejido se sembraron en 96-placas de pocillos por duplicado, donde un pocillo se trató como control sin estimulación y el otro recibió un tratamiento estimulante. Los pocillos no estimulados solo recibieron medio y los pocillos tratados con estimulante recibieron 10 ng/ml de acetato de miristato de forbol (PMA) y 1500 ng/ml de ionomicina en el medio. Las células se colocaron en una incubadora a 37 ◦C con 5% de CO2 durante una hora. Luego, se añadió Brefeldin A (GolgiPlug, Biolegend Cat#420601) (dilución x100) a todos los pocillos de muestra y la placa se volvió a colocar en la incubadora durante cuatro horas más. Luego, las células se lavaron dos veces con PBS y se tiñeron para su análisis mediante citometría de flujo.

Células de melanoma B16F10

Las células B16F10 se descongelaron del nitrógeno líquido y se contaron utilizando un hemocitómetro. Luego, las células se resuspendieron en medio (medio Eagles modificado con alto contenido de glucosa de Dulbecco [HyClone Cat#SH3002201] con 1% de penicilina/estreptomicina [HyClone Cat# SV30010] y 10% de suero de ternero bovino [VWR Cat#10158-358]) para una concentración de 1 × 105 células por ml. Luego se dividieron alícuotas de las células B16F10 en matraces de cultivo y se colocaron en una incubadora a 37 ◦C con 5% de CO2. Para preparar las células B16F10 para la administración, las células se transfirieron de los matraces de cultivo a un tubo cónico de 50 ml, se lavaron con PBS y luego se resuspendieron en PBS. Las células se contaron utilizando un hemocitómetro y se resuspendieron en PBS para dar dosis de 3 x 105 células por 200 µl.

Tinción de anticuerpos contra citoquinas intracelulares

Las células se sembraron en placas de pocillos {{0}} y se resuspendieron en bloque Fc (anti-CD16/CD32, BioLegend Cat#101320) y se incubaron a 4 ◦C durante 15 min. Las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato que contenía albúmina sérica bovina al 0,5 % (tampón FACS) y luego se resuspendieron en una mezcla maestra de anticuerpos que tiñen la superficie celular (CD45, BioLegend Cat#103132; NKp46, BioLegend Cat#137617; DX5, BioLegend Cat#108919; CD127, BioLegend Cat#135007; Lineage Cocktail, BioLegend Cat#133311) y se incubaron a 4 grados durante 20 minutos. Las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato dos veces y se resuspendieron en colorante de viabilidad reparable (FVD) Zombie Aqua (BioLegend Cat#423101) y se incubaron a 4 ◦C durante 30 min. Se usó solución salina tamponada con fosfato para lavar las células dos veces antes de resuspendirlas en tampón de fijación (BioLegend Cat#420801). Las células se incubaron a 4 ◦C durante 20 min. Después de la fijación, las células se lavaron dos veces con tampón de permeabilización (BioLegend Cat#421002). Las células se resuspendieron en una mezcla maestra de anticuerpos de tinción intracelular (IL-22, BioLegend Cat#516404; IL-17A, eBioscience Cat# 17-7177-81) y se incubaron a 4 ◦C durante 20 minutos. Las células se lavaron dos veces con tampón de permeabilización, luego se resuspendieron en tampón FAC y luego se procesaron con un citómetro de flujo BD FACSCantoTM II y se analizaron utilizando el software BD FACSDivaTM.

Beneficios de cistanche para hombres: fortalece el sistema inmunológico.

Tinción de anticuerpos contra el factor de transcripción

Las células se sembraron en placas de pocillos {{0}} y se resuspendieron en un bloque FC (anti-CD16/CD32 BioLegend Cat# 101320) y se incubaron a 4 ◦C durante 15 min. Las células se lavaron dos veces con tampón FAC (0,5% en albúmina sérica bovina [HyClone Cat# SH30574.02] en PBS), luego se resuspendieron en una mezcla maestra de anticuerpos que tiñen la superficie celular (CD45, BioLegend Cat#103132; NKp46 , BioLegend Cat#137617; DX5, BioLegend Cat# 108919; CD127, BioLegend Cat#135007; Lineage Cocktail, BioLegend Cat#133311) y se incubaron a 4 ◦C durante 20 min. Luego, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato, se resuspendieron dos veces en FVD (BioLegend Cat#423101) y se incubaron a 4 ◦C durante 20 minutos. Las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato dos veces y se resuspendieron en tampón de fijación FoxP3 de ratón (BD Pharmingen BD Sciences Cat#51-9006124) y se incubaron a 4 ◦C durante 30 min. Después de la fijación, las células se lavaron con tampón de permeabilización FoxP3 de ratón (BD Pharmingen BD Sciences Cat# 51-9006125) resuspendido en tampón de permeabilización FoxP3 y se incubaron a 37 ◦C durante 30 min. Las células se resuspendieron en anticuerpos contra el factor de transcripción (ROR gamma(t), eBioscience Cat#17-6988-82; T-bet, eBioscience Cat# 12-5825-82) y se incubaron a 4 ◦C durante 20 min. Las células se lavaron dos veces con tampón de permeabilización, luego se resuspendieron en tampón FAC y se analizaron utilizando un citómetro de flujo BD FACSCantoTM II y el software BD FACSDivaTM.

análisis estadístico

Las poblaciones esplénicas y pulmonares de NCR+ y NCR− ILC3 se analizaron mediante pruebas t no apareadas. El análisis de población del experimento cinético se comparó mediante el análisis de varianza unidireccional ordinario (ANOVA) y la prueba de comparación múltiple de Tukey. El análisis de citocinas en el bazo y los pulmones se examinó mediante ANOVA de dos factores y la prueba de comparaciones múltiples de Šídák. Las medias para los grupos de tratamiento se definieron como significativamente diferentes con un valor de p <0.05.

Estrategia de puerta

Primero, utilizando el área de dispersión directa (FSC-A) y el área de dispersión lateral (SSC-A), se activaron los linfocitos. Luego, las células dobletes se excluyeron utilizando FSC-A y FSC-altura (FSC-H). Las células vivas se activaron tomando las células negativas para FVD. Luego, se tomaron CD127+ y células de cóctel de linaje para reducir las ILC. Luego se activaron las células CD45+. Para garantizar que se excluyeran todas las células NK, se activó DX5-. Para la identificación del factor de transcripción de las ILC3, luego se activaron las células ROR t+ y, a partir de estas células, las ILC3 NCR+ fueron T-bet+ y NKp46+ y las ILC3 NCR- fueron T-bet- y NKp46. Para la identificación de citocinas, después de seleccionar linfocitos, se seleccionaron células individuales, células vivas y el linaje CD127+: CD45+, IL-17 e IL-22 se seleccionaron como siendo producida por ILC3 ya que las ILC3 serían las únicas células en esta puerta final que podrían producir IL-22 e IL-17.

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5. Conclusiones

Aunque el aumento de la producción de IL-17 e IL-22 derivada de ILC3-en el bazo observado en el modelo libre de tumores se perdió en el modelo de desafío tumoral, hubo un cambio opuesto en NCR+ y Poblaciones NCR- ILC3 en los pulmones. Esto sugiere que la vacunación con DC podría haber influido en las ILC3 en el modelo de desafío tumoral, así como en los ratones libres de tumores. Sin embargo, el efecto de esta relación entre las CD de la vacuna y las ILC3 sobre las respuestas antitumorales sigue siendo desconocida y es una dirección de investigación futura. Por lo tanto, los estudios descritos aquí demuestran que existen comunicaciones entre las vacunas basadas en DC y las subpoblaciones de ILC3, tanto en ratones libres de tumores como en ratones con tumores. Estas comunicaciones y sus impactos posteriores en las respuestas inmunes parecen ser complejos. Estas observaciones contribuyen al cuerpo de literatura que busca descifrar la relación entre las vacunas DC y las ILC3 en un esfuerzo por desarrollar estrategias mejoradas de vacunación DC. Recomendamos más estudios que investiguen el potencial para diseñar estrategias de vacunación que puedan modular estas comunicaciones para optimizar las respuestas de ILC3 para ayudar en las respuestas antitumorales y limitar el apoyo de las respuestas protumorales.

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